凋亡調(diào)節(jié)因子與藥物耐受性

1、凋亡調(diào)節(jié)因子與藥物耐受性    腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性是臨床化療失敗的重要原因。本文綜述細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)因子p53、bcl-2、bax等對(duì)腫瘤細(xì)胞耐藥機(jī)制的影響和p53蛋白等對(duì)P一糖蛋白和多藥耐藥相關(guān)蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)作用，并介紹部分多耐藥性新的研究進(jìn)展。 放療和化療對(duì)腫瘤細(xì)胞有明顯殺傷作用。然而成功治療的一個(gè)重要障礙是腫瘤細(xì)胞對(duì)上述治療無(wú)反應(yīng)，并出現(xiàn)耐受細(xì)胞群，導(dǎo)致惡性腫瘤復(fù)發(fā)或浸潤(rùn)進(jìn)展。因此了解細(xì)胞對(duì)化療藥物耐受基礎(chǔ)成為許多實(shí)驗(yàn)研究的熱點(diǎn)。一般而言，研究的重點(diǎn)是解釋治療因子怎樣達(dá)到細(xì)胞內(nèi)靶位點(diǎn)，并檢查藥物與靶位點(diǎn)相互作用的分子基礎(chǔ)，如高水平表達(dá)MDRI基

2、因能夠限制多種藥物在細(xì)胞內(nèi)的濃度，并引起多耐藥性（MDR）。 最近幾年里，探索和了解細(xì)胞凋亡機(jī)制，對(duì)腫瘤細(xì)胞獲得或失去耐受細(xì)胞毒性機(jī)制有了新的認(rèn)識(shí)。 1 凋亡調(diào)節(jié)因子對(duì)耐藥性的調(diào)節(jié)作用 許多藥物能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，包括抗代謝藥、脫氧核苷酸合成抑制劑、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑、烷化劑及干擾微管藥物等1?；熕幬镆鸬蛲龅倪^(guò)程還不十分清楚，可能是藥物打斷了正常的細(xì)胞生長(zhǎng)周期所致2。凋亡是一種可以被激活或抑制的可調(diào)節(jié)過(guò)程，因此可能還有在某些情況下藥物耐受性的新解釋。 1.1 p53 野生型p53（wt-p53）在細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中以“分子警察”身份監(jiān)視細(xì)胞內(nèi)DNA狀態(tài)，當(dāng)DNA受損后，p53通過(guò)轉(zhuǎn)錄后穩(wěn)定機(jī)制

3、抑制細(xì)胞停留在G1期，使細(xì)胞有時(shí)間修復(fù)，若修復(fù)失敗，wt-p53將角發(fā)細(xì)胞凋亡。wt-p53缺乏或發(fā)生突變，將失去“分子警察”作用，不能誘導(dǎo)受損細(xì)胞凋亡，而使受損細(xì)胞得以生存。但由于細(xì)胞失G1期細(xì)胞周期檢查點(diǎn)的DNA損傷監(jiān)視作用，易造成諸如缺失、擴(kuò)增和易位等染色體畸變。 Malcomson3采用溫控p53表達(dá)載體轉(zhuǎn)染鼠胚胎成纖維細(xì)胞株，在鬼臼乙叉甙（VP-16）作用下，32條件時(shí)，wt-p53表達(dá)，細(xì)胞滯留在G1期，明顯表現(xiàn)出對(duì)藥物介導(dǎo)凋亡的耐受性；而在37時(shí)，表達(dá)突變型p53，細(xì)胞在VP-16作用下，無(wú)明顯生長(zhǎng)抑制，繼續(xù)增殖，并顯示出劑量依賴性的細(xì)胞凋亡增多。提示wt-p53能介導(dǎo)細(xì)胞對(duì)VP

4、-16的耐受性。wt-p53介導(dǎo)的耐藥性可能與藥物作用特點(diǎn)有關(guān)。VP-16為細(xì)胞周期特異性藥，主要作用于細(xì)胞周期的S期，干擾DNA的合成。一定劑量的VP-16作用細(xì)胞后，wt-p53使得細(xì)胞滯留在G1期而不繼續(xù)增殖，因此，VP-16作用的靶位點(diǎn)減少，如同Topo酶含量下降介導(dǎo)的耐藥性一樣，引起細(xì)胞對(duì)VP-16的耐藥性。Wosikowski4檢測(cè)13例對(duì)阿霉素（ADM）、長(zhǎng)春花堿、順鉑（CDDP）、VP-16和胺苯丫啶等耐藥的乳腺癌細(xì)胞株，僅1例發(fā)生p53基因突變。 但許多學(xué)者認(rèn)為低濃度化療藥物可引起表達(dá)wt-p53的細(xì)胞凋亡，在缺乏wt-婦生基因突變后，須大劑量藥物方能引起細(xì)胞死亡5、wt-p

5、53的缺失或突變間接導(dǎo)致了藥物耐受性。Lowe6通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，表達(dá)Wt-p53基因的腫瘤細(xì)胞在經(jīng)放射性和ADM治療后，絕大多數(shù)細(xì)胞發(fā)生凋亡；相反，相同因子治療p53基因缺陷的腫瘤細(xì)胞MEFS，對(duì)放療和幾種化療藥物有較強(qiáng)的耐藥性。但將wt-p53基因轉(zhuǎn)染到MEFS細(xì)胞，低劑量放療，或小劑量的ADM、VP-16等藥物處理后細(xì)胞迅速凋亡。另有報(bào)道wt-p53能促進(jìn)體外培養(yǎng)的人粘液表皮樣癌細(xì)胞凋亡。 p53對(duì)細(xì)胞耐藥性的調(diào)節(jié)可能是雙向的，具體作用方式可能與細(xì)胞種類、狀態(tài)及藥物作用特點(diǎn)和劑量有關(guān)。如突變型p53可能更多引起細(xì)胞對(duì)細(xì)胞周期非特異性藥物耐受，而wt-p53介導(dǎo)細(xì)胞對(duì)某些細(xì)胞周期異性藥物耐

6、受。 1.2 Bcl-2家族 一些研究發(fā)現(xiàn)bcl-2基因家族蛋白表達(dá)水平變化，能顯著改變腫瘤細(xì)胞株對(duì)化療藥物誘導(dǎo)凋亡的阻抗。Dole7用bcl-2表達(dá)載體轉(zhuǎn)染人類神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株Shep-1，發(fā)現(xiàn)高表達(dá)bcl-2克隆的細(xì)胞株對(duì)CDDP和VP-16引起的細(xì)胞毒性呈劑量依賴性阻抗。Miyashita1采用基因轉(zhuǎn)染方法，發(fā)現(xiàn)bcl-2能使細(xì)胞增加對(duì)地塞米松、氨甲喋呤、阿糖胞苷、長(zhǎng)春新堿（VCR）、VP-16和CDDP等藥物耐受性。與對(duì)照組細(xì)胞相比， bcl-2蛋白并不影響藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用，但在維持細(xì)胞存活中起著重要調(diào)節(jié)作用。在VP-16和CDDP等化療藥物去除后，bcl-2蛋白能夠重新

7、啟動(dòng)細(xì)胞增殖，使細(xì)胞獲得耐藥性。 Pantazis8研究VCR誘導(dǎo)人白血病細(xì)胞株U-937/WT形成VCR耐藥細(xì)胞亞株U-937/RV，在U-937/WT細(xì)胞中不能檢出凋亡抑制蛋白bcl-2和bcl-xl表達(dá)，而在U-9377/RV均可檢出；但在U-937/RV中亦可檢出bax蛋白表達(dá)，后者是一種凋亡啟動(dòng)因子，是一種bcl-2蛋白的異源二聚體，可抵銷bcl-2的活性作用，而在敏感株中未檢出bax蛋白。由此可見bcl-2家族在細(xì)胞耐藥過(guò)程中的作用也是相互調(diào)節(jié)和相互制約的。 1.3 p53與bcl-2家庭間的相互影響 細(xì)胞凋亡是一個(gè)多因子參加的復(fù)雜的生理過(guò)程，藥物影響能誘發(fā)p53和bcl-2等蛋白

8、發(fā)生一系列變化，參與細(xì)胞的耐藥性。 Miyashi9研究發(fā)現(xiàn)wt-p53能與bcl-2基因上p53依賴性的負(fù)反應(yīng)元件結(jié)合抑制bcl-2的表達(dá)。Eliopoulos10檢測(cè)p53和bcl-2蛋白在敏感和耐藥的卵巢癌細(xì)胞株中表達(dá)水平，結(jié)果顯示耐藥株過(guò)度表達(dá)p53和bcl-2蛋白，且bcl-2作用環(huán)節(jié)可能在p53之上。許多臨床資料亦發(fā)現(xiàn)突變型p53和bcl-2蛋白的高表達(dá)與不良預(yù)后有關(guān)。 Ju11將wt-p53傳染wt-p53陰性的HL-60細(xì)胞形成轉(zhuǎn)染株SN3，與母代細(xì)胞相比，對(duì)化療藥物的敏感性明顯增加，如對(duì)CDDP和胸苷（thymidine）的敏感性分別增加2倍和50倍；而用突變型p53傳染的細(xì)

9、胞無(wú)比現(xiàn)象。用胸苷合成酶抑制劑FdUrd觀察與p53相關(guān)聯(lián)基因表達(dá)變化，在各種濃度的FdUrd存在下，很大比例的SN3細(xì)胞發(fā)生凋亡，而不是停留在S期。母代細(xì)胞有不確定的bax水平和高水平的bcl-2表達(dá)。在SN3細(xì)胞bcl-2檢測(cè)不出，并維持適當(dāng)基礎(chǔ)水平的bax。FdUrd治療后，wt-p53和bax水平增加，但bax誘導(dǎo)早于p53，且平行出現(xiàn)細(xì)胞凋亡的DNA條帶。Perego12檢測(cè)p53與順鉑導(dǎo)致耐藥性間的關(guān)系時(shí)，發(fā)現(xiàn)在卵巢癌藥細(xì)胞株中，突變型p53失去激活bax基因轉(zhuǎn)錄能力。 這些資料說(shuō)明p53、bax-2和bax等凋亡調(diào)節(jié)因子在腫瘤細(xì)胞的耐藥機(jī)制中起重要作用，但作用方式是復(fù)雜多樣的。

10、2 p53對(duì)耐藥蛋白的調(diào)節(jié)作用 p53具有不同結(jié)構(gòu)區(qū)域。wt-p53與DNA共有區(qū)結(jié)合后，能正向調(diào)節(jié)一系列下游基因的表達(dá)。另外，wt-姢負(fù)向調(diào)節(jié)許多缺乏wt-p53共有區(qū)結(jié)合位點(diǎn)基因，包括DNA topo、MDRI、c-fos和其它病毒和細(xì)胞的啟動(dòng)子。 2.1 p53對(duì)多藥耐藥相關(guān)蛋白（MRP）表達(dá)的調(diào)節(jié) 轉(zhuǎn)錄因子spl是MRP基因啟動(dòng)子的強(qiáng)激動(dòng)劑，wt-姢與spl結(jié)合，消除spl作用，從轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)MRP表達(dá)。Wang13將帶有蟲熒光素酶標(biāo)記報(bào)告基因的MRP啟動(dòng)子與wt-p53共同轉(zhuǎn)染p53陰性的人類非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株H1299和鼠（10）1細(xì)胞，結(jié)果顯示wt-p53能呈劑量依賴性地顯著抑制MRP啟動(dòng)子活性，wt-忍氣吞聲作用位點(diǎn)為-91到+103bp，該處有數(shù)個(gè)spl結(jié)合位點(diǎn)；而突為型p53只有很弱的作用。同時(shí)研究還發(fā)現(xiàn)wt-p53還能抑制高表達(dá)MRP的CEM/VM-1-5細(xì)胞的內(nèi)源性MRP表達(dá)。Oshika14采用免疫組化技術(shù)檢測(cè)107例非小細(xì)胞肺癌標(biāo)本，MRP和突變型p53表達(dá)有明顯相關(guān)性，雙染色技術(shù)顯示p53和MRP在一些細(xì)胞上同時(shí)表達(dá)，這些病人預(yù)后明顯羅無(wú)MRP和突變型p53患者差。 2.2 p53CF p-糖蛋白（P-gp）表達(dá)的調(diào)節(jié) P-gp是有MDR1基因編碼的多藥耐藥蛋白。wt-作用