內(nèi)源性接觸激活系統(tǒng)對單核細(xì)胞粘附的影響

1、    內(nèi)源性接觸激活系統(tǒng)對單核細(xì)胞粘附的影響        摘要目的：研究接觸激活系統(tǒng)對尿激酶型纖溶酶原激活物（U-PA)引起單核細(xì)胞粘附的影響及它們之間的相互關(guān)系。方法：3H-TdR標(biāo)記的U937細(xì)胞培養(yǎng)于24孔板，在高分子激肽原(HK/HKa)，激肽釋放酶(kallikrein,KK),因子(factor )和纖溶酶原(plasminogen)的作用下，觀察U937細(xì)胞的粘附情況。結(jié)果：Hka、KK抑制U-PA引起的單核細(xì)胞粘附，因子X和Plasminogen促進(jìn)單核細(xì)

2、胞粘附。結(jié)論：接觸激活系統(tǒng)是單核細(xì)胞粘附的重要調(diào)節(jié)因素。主題詞尿激酶； 單核細(xì)胞； 細(xì)胞粘附中分類號Q461文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A文章編號1000-4718(2000)03-0233-04 Effect of contact system in monocyte adhesion induced by urokinase-type plasminogen activatorLIU Jian-xia, ZUO Jian-ling, QIN Lei, QIAN Hai-xin(The First Affiliated Hospital of Suzhou Medical College, Suzhou 2

3、15006, China)LIU Jian-ning(Vascular ReserchLaboratory, Deaconess Hospital, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts 02215, USA)Abstract AIM:To study the effect of contact system in monocyte adhesion induced by urokinase-type plasminogen activator (U-PA). METHODS:U937 cells were labeled with H t

4、hymidine in the culture medium, test reagents were added into the cell suspension in 24-well plates. The counts*min-1 were counted in a liquid scintillation counter. RESULTS:U-PA-induced monocyte adhesion was inhibited by high-molecular-weight kininogen and kallikrein, and promoted by factor and pla

5、sminogen. CONCLUSION:these contact system proteins may be important modulators of U-PA-induced monocyte adhesion, a process which is involved in many pathophysiological events.MeSH Urokinase; Monocytes; Cell adhesion單核細(xì)胞粘附參與許多病理生理過程如創(chuàng)口愈合、感染、腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移等。尿激酶型纖溶酶原激活物（urokinase-type plasminogen activator,U

6、-PA）在單核細(xì)胞粘附中起著重要作用,它和U-PA受體結(jié)合后，通過cAMP介導(dǎo)的信號傳遞，引起細(xì)胞粘附，從而引發(fā)一系列病理生理反應(yīng)。由于U-PA和內(nèi)源性接觸激活系統(tǒng)中的3種因子激肽釋放酶（kallikrein,KK）、高分子量激肽原（high-molecular-weight kininogen,HK/HKa）、十二因子（）及纖溶酶原（plasminogen）與U-PA在功能上密切相關(guān)，故本文探討4種因子對U-PA引起單核細(xì)胞粘附的影響。材料和方法一、試劑和細(xì)胞株人激肽釋放酶、HK(HKa)和(a)購于Enzyme Research Laboratories(美國)；U-PA(MW 54 KD

7、a)購于Green cross（日本）；RPMI 1640購于Gibco BRL(美國)；氟磷酸二異丙酯（diisopropyl fluorophosphate,DFP)及胎牛血清（fetal calf serum,FCS）購于Sigma(美國),單核細(xì)胞株U937購于Type Culture Collection(美國)。酶的底物S2444和S2302購于Kabi(美國)。二、U-PA、激肽釋放酶、a活性滅活在室溫下,U-PA、激肽釋放酶、a分別在DFP(5 mmol/L)中孵育2 h,充分透析后用S2444檢測U-PA的酶活性,S2302檢測激肽釋放酶和a的酶活性，經(jīng)DFP處理后，它們的酶

8、活性均消失。三、細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞粘附測定單核細(xì)胞株U937細(xì)胞生長于RPMI 1640培養(yǎng)基中,含10% FCS;青霉素(100 U/mL),鏈霉素(100g/mL),二性霉素B(0.25g/mL),在37,5% CO2培養(yǎng)。細(xì)胞粘附測定按WALTG1方法略加改進(jìn)。U937細(xì)胞(1×106/mL)和3H-TdR(3.7×10Bq/mL)共同培養(yǎng)24 h,離心收集細(xì)胞(350×g,4 min,4),用無血清RPMI 1640洗滌3次，用含10% FCS的RPMI 1640重懸細(xì)胞(1×106/mL)，加入被測試劑后，在24孔板中（300L/孔）37,5% C

9、O2,培養(yǎng)17h，去上清，用PBS洗滌3次，殘留的細(xì)胞即為粘附在24孔板上的單核細(xì)胞。每孔加入1 mL裂解液(10% glycerol,0.2% sodium dodecyl sulfate,0.2% tritonX-100),每1 mL裂解物加入10 mL液閃液（formula-989 high flash-point cocktail),用液閃儀測定Counts.min-1,單核細(xì)胞粘附的程度用每1000個細(xì)胞所對應(yīng)的Counts.min-1值表示。結(jié)果一、U-PA增強(qiáng)U937細(xì)胞的粘附作用按方法所述，U-PA的濃度選擇05 nmol/L和U937細(xì)胞共同培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的粘附作用隨U-PA

10、的濃度增高而增強(qiáng)。未發(fā)現(xiàn)對照組細(xì)胞粘附現(xiàn)象發(fā)生（見1)。用DFP預(yù)處理滅活U-PA的酶活性后，U-PA的這種促粘附作用不受影響（見2B）。二、HK抑制U-PA引起的細(xì)胞粘附HK和HKa是血清中的抗粘附蛋白，其中HKa的作用更強(qiáng)。U937細(xì)胞培養(yǎng)在含10% FCS和10 nmol/L U-PA的培養(yǎng)基中，再加人HK（含10% Hka），HK的濃度由0 nmol/L遞增至10 nmol/L。1顯示：HKa可抑制U-PA引起的細(xì)胞粘附，HKa對細(xì)胞的抗粘附作用隨著HKa濃度的增高而加強(qiáng)(見1）。三、激肽釋放酶對U-PA引起細(xì)胞粘附的影響由于HKa的抗粘附作用明顯強(qiáng)于HK，而激肽釋放酶催化HK轉(zhuǎn)化為H

11、Ka，因此我們也探討激肽釋放酶在細(xì)胞粘附中的作用。U937細(xì)胞培養(yǎng)在含2 nmol/L的U-PA的培養(yǎng)基中，激肽釋放酶的濃度范圍0640nmol/L，結(jié)果顯示：低濃度的激肽釋放酶（200nmol/L）能輕度增強(qiáng)細(xì)胞粘附作用。而高濃度激肽釋放酶（400nmol/L），則起抑制作用（見2A）。用DFP預(yù)處理使激肽釋放酶的酶活性被滅活，激肽釋放酶抑制作用即消失（見2B）。     Fig1U-PA induced monocyte U937 adhesion and the anti-adhesion effect of Hka3H-labeld U937 c

12、ells at 1×106/mL were incubated with U-PA (010 nmol/L) in the absence or the presence of Hka in 24-well plates. The quantity of the adherent cells were measured and expressed in counts.min-1     Fig 2Effect of KK on U-PA-induced monocyte U937 adhesionA.3H-labeled U937 cells

13、were cultured in a medium containing 2 nmol/L U-PA and KK(0640 nmol/L). B.3H-labeled U937 cells were incubated with (a) control , (b)1nmol/LU-PA, (c)1nmol/L DFP-U-PA, (d)1nmol/L U-PA and 400nmol/L KK, (e)1nmol/L U-PA and 400 nmol/L DFP-KK. The quantity of the adherent cells were expressed in counts.

14、min-1四、因子和纖溶酶原在細(xì)胞粘附中的作用因子和纖溶酶原具有促單核細(xì)胞粘附作用，當(dāng)因子和纖溶酶原存在時，U-PA促進(jìn)單核細(xì)胞粘附作用明顯加強(qiáng)，預(yù)先用DFP處理，將其酶活性滅活，不影響其調(diào)節(jié)作用（見3）。     Fig 3Effects of and plasminogen on U-PA induced monocyte U937 cell adhesion3討論已知纖溶和凝血系統(tǒng)之間有密切的關(guān)系，U-PA和內(nèi)源性接觸激活系統(tǒng)各因子（a,HKa,KK）相互作用，調(diào)節(jié)凝血和纖溶反應(yīng)。近年的研究表明，U-PA可誘導(dǎo)單核細(xì)胞粘附，該反應(yīng)參與多種病理生理反

15、應(yīng)。內(nèi)源性接觸激活系統(tǒng)對U-PA的這種作用有何影響，尚未見報道。我們的實驗表明，在體外實驗中，內(nèi)源性接觸激活系統(tǒng)3因子（高分子激肽原HK/HKa、激肽釋放酶KK、十二因子）和纖溶酶原是調(diào)節(jié)U-PA誘導(dǎo)的單核細(xì)胞粘附的重要因素。HK/HKa及激肽釋放酶可下調(diào)U-PA誘導(dǎo)的單核細(xì)胞粘附，及纖溶酶原可上調(diào)U-PA誘導(dǎo)的單核細(xì)胞粘附。Waltz等1報道，U-PA和U-PA受體結(jié)合后，通過cAMP介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)，引起單核細(xì)胞粘附，從而觸發(fā)人體一系列生理和病理反應(yīng)。在實驗中，U-PA經(jīng)DFP預(yù)處理去除酶活性后，其作用不受影響，由此推測，U-PA的作用與酶活性無關(guān)。有學(xué)者報導(dǎo)，U-PA存在EFG區(qū)域，該區(qū)域

16、與U-PA受體結(jié)合，激發(fā)一系列反應(yīng)2。在我們實驗中，U-PA的濃度1 nmol/L,比人體血漿的濃度高10倍以上，因為在某些病理狀態(tài)下，如腫瘤轉(zhuǎn)移，炎癥，風(fēng)濕病，細(xì)胞表面U-PA和U-PA受體過表達(dá)，產(chǎn)生很高的局部濃度3，4。HK/HKa、激肽釋放酶與U-PA及其受體之間存在著復(fù)雜的相互作用，Colman等5報道，U-PA受體有3個結(jié)合位點，HKa和其中2個結(jié)合，影響U-PA和其受體的結(jié)合，從而抑制了U-PA的促粘附作用。激肽釋放酶可以激活單鏈U-PA轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈U-PA6，后者活性更強(qiáng)（約100倍），它和PAI-1快速結(jié)合，被細(xì)胞吞飲而滅活7。高濃度激肽釋放酶促進(jìn)HKHKa，抑制細(xì)胞粘附。在實

17、驗中，激肽釋放酶的調(diào)節(jié)作用較為復(fù)雜，在低濃度時，表現(xiàn)為輕度的促細(xì)胞粘附作用，我們認(rèn)為可能與其將單鏈U-PA轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈有關(guān)。在高濃度時（400nmol/L以上），它表現(xiàn)為抑制作用為主。我們推測激肽釋放酶下調(diào)U-PA的粘附作用通過以下2個途徑：KK促進(jìn)牛血清HKHKa；促進(jìn)單鏈U-PA雙鏈U-PA,后者和PAI-1結(jié)合而滅活。由于血漿中激肽釋放酶的濃度為500600nmol/L，因此，激肽釋放酶在體內(nèi)主要表現(xiàn)為抑制作用。用DFP預(yù)處理激肽釋放酶，其酶活性消失后，對U-PA的調(diào)節(jié)作用也隨之消失，所以激肽釋放酶的作用和酶活性有關(guān)。、纖溶酶原和U-PA之間也有著復(fù)雜的相互作用，a可以促使激肽釋放酶前體轉(zhuǎn)

18、變?yōu)榧る尼尫琶?，后者可使HKHKa，單鏈U-PA雙鏈U-PA,雙鏈U-PA可激活纖溶酶原，從而引發(fā)一系列瀑布反應(yīng)。我們用DFP滅活a的活性，并不影響a的調(diào)節(jié)作用?？梢?，a的作用和酶活性無關(guān)。a和纖溶酶原上調(diào)U-PA誘導(dǎo)單核細(xì)胞粘附，其作用機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步研究?？傊佑|激活系統(tǒng)和U-PA在體內(nèi)廣泛存在，并且相互影響，在U-PA引起單核細(xì)胞粘附過程中，接觸激活系統(tǒng)是重要的調(diào)節(jié)因素。劉建夏（蘇州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，江蘇 蘇州 215006）左劍玲（蘇州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，江蘇 蘇州 215006）秦磊（蘇州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，江蘇 蘇州 215006）錢海鑫（蘇州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，江蘇

19、蘇州 215006）LIU Jian-ning（Vascular Reserch Laboratory, Deaconess Hospital, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts 02215, USA）參考文獻(xiàn)1Waltz DA, Sailor LZ, Chapman HA, et al. Cytokines induce urokinase-depend adhesion of human myeloid cells. A regulatory role for plasminogen activator inhibitors J.

20、J Clin Invest, 1993, 91: 15411552.2Wei Y,Waltz DA, Rao N, et al. Identification of the urokinase receptor as an adhesion receptor for vitronectin J. J Biol Chem, 1994, 269: 3238032388.3Blasi F. Urokinase and urokinase receptor: a paracrine/autocrine system regulating cell migration and invasiveness J. Bioessays,1993， 15: 105111.4Jankun J, Merrick HW,Goldblatt PJ. Expression and locali