圓補(bǔ)血口服液對(duì)D半乳糖和亞硝酸鈉所致癡呆模型小鼠生化指標(biāo)的影響

1、圓補(bǔ)血口服液對(duì)D半乳糖和亞硝酸鈉所致癡呆模型小鼠生化指標(biāo)的影響    【摘要】     目的 研究以何首烏和桂圓肉為原料的烏圓補(bǔ)血口服液對(duì)老年癡呆小鼠模型大腦和血液生化指標(biāo)的影響。方法 用D半乳糖和亞硝酸鈉混合液給小鼠腹腔注射，每天1次，連續(xù)60 d造模。造模30 d后，治療組用烏圓補(bǔ)血口服液灌胃治療，模型組和正常組用等體積蒸餾水灌胃。實(shí)驗(yàn)結(jié)束，取血分離血清，處死小鼠，取大腦制備10%腦勻漿，測(cè)定血清和腦勻漿生化指標(biāo)。結(jié)果 腦勻漿乙酰膽堿脂酶（TchE）活力，模型組、正常組和治療組分別為(1.709

2、77;0.498)、(1.436±0.313)、(1.182±0.157) U/mg port，模型組明顯高于其他兩組（P0.05和P0.01）；丙二醛（MDA）含量分別為(7.935±0.775)、(6.934±1.284)、(6.356±0.799) nmol/mg prot，模型組明顯高于治療組（P0.05）；血清谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSHPx）活力分別為(329.760±28.438)、(370.038±25.130)、(311.300±29.952) U/ml，正常組明顯高于模型組和治療組（P0.01）；

3、腦（O2）氧自由基清除率（%）分別為(2.346±1.167)、(7.366±3.413)、(8.672±3.519)，治療組和正常組明顯高于模型組（P0.01）；腦蛋白含量、腦GSHPx、血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、尿素等，各組間無(wú)明顯差異。結(jié)論 烏圓補(bǔ)血口服液有明顯改善D半乳糖和亞硝酸鈉聯(lián)合癡呆模型小鼠大腦乙酰膽堿酯酶活性和增強(qiáng)抗氧化功能。     【關(guān)鍵詞】  老年癡呆癥模型；烏圓補(bǔ)血口服液；乙酰膽堿脂酶    老年癡呆癥（AD）

4、以認(rèn)知能力和記憶力迅速減退為主要特征，而認(rèn)知能力和記憶力目前認(rèn)為與大腦膽堿能神經(jīng)有關(guān)。乙酰膽堿是膽堿能神經(jīng)的神經(jīng)遞質(zhì)，膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶和乙酰膽堿酯酶(TchE)活性分別控制乙酰膽堿的生成和分解。因此，膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶和TchE活性成為測(cè)定的重要指標(biāo)。本研究利用D半乳糖和亞硝酸鈉聯(lián)合造模1，用烏圓補(bǔ)血口服液灌胃治療，測(cè)定大腦TchE活性、丙二醛(MDA)和血清生化指標(biāo)的變化，并與對(duì)照組對(duì)比分析?，F(xiàn)將實(shí)驗(yàn)結(jié)果報(bào)道如下。    1  材料與方法    1.1  試劑  D半乳糖、亞硝酸鈉、氯化鈉、過(guò)硫酸銨、鹽酸羥胺

5、、對(duì)氨基苯磺酸、萘胺、HCl、Tris、TEMED、正丁醇，均為國(guó)產(chǎn)分析純。TchE測(cè)定試劑盒、MDA測(cè)定試劑盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSHPx）測(cè)定試劑盒、考馬斯亮蘭試劑盒，均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、尿素、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）測(cè)定試劑盒、總蛋白測(cè)定試劑盒，均購(gòu)自四川省邁克科技有限責(zé)任公司。    1.2  動(dòng)物  小白鼠45只，鼠齡5個(gè)月，健康，雌雄各半，由右江民族醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供。分成3組，每組15只，即模型組、正常組、治療組。分籠喂養(yǎng)，每籠5只。    1.3

6、  動(dòng)物實(shí)驗(yàn)造模  模型組和治療組造模。用D半乳糖按100 mg/kg體重劑量，亞硝酸鈉按90 mg/kg體重劑量，用生理鹽水溶解稀釋，兩液混合后腹腔注射，每天1次，連續(xù)60 d。    1.4  治療  造模到30 d后，治療組用烏圓補(bǔ)血口服液，按0.05 ml/只劑量，用蒸餾水稀釋至0.3 ml灌胃，每天1次，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。其余兩組用等體積蒸餾水代替。    1.5  中藥  烏圓補(bǔ)血口服液何首烏（制）0.5 g/ml生藥（干），龍眼肉0.3 g/ml生藥（干）。

7、0;   1.6  測(cè)定方法  超氧陰離子自由基（O2）清除率用化學(xué)比色法測(cè)定2；MDA用TBA（硫代巴比妥酸）顯色法測(cè)定；GSHPx用其催化H2O2與GSH反應(yīng)，GSH可與二硫代二硝基苯甲酸作用生成黃色化合物，進(jìn)行比色測(cè)定；TchE測(cè)定用TchE催化水解乙酰膽堿生成膽堿和乙酸，膽堿與巰基顯色劑反應(yīng)生物TNB黃色化合物，進(jìn)行比色測(cè)定。具體操作按各試劑盒說(shuō)明書(shū)。    實(shí)驗(yàn)結(jié)束從眼球取血，分離血清待測(cè)。處死動(dòng)物，取大腦，用生理鹽水洗去血液，濾紙吸干多余水分，稱重，在冰浴下用玻璃勻漿器勻漿，用生理鹽水制成10%腦勻漿，在3 50

8、0 r/min離心10 min，取上清于另一試管內(nèi)，放冰箱內(nèi)冷凍待用。    1.7  統(tǒng)計(jì)學(xué)處理  用上?？萍汲霭嫔鏢STP軟件（2.00版）處理數(shù)據(jù)并進(jìn)行方差分析。    2  結(jié)  果    2.1  腦蛋白、TchE和MDA測(cè)定結(jié)果  見(jiàn)表1。每組腦蛋白無(wú)顯著性差異（P0.05）；模型組TchE活力明顯高于正常組和治療組（P0.05和P0.01）；MDA含量模型組明顯高于治療組（P0.05）。表1  各組腦蛋白、TchE和MDA

9、比較與模型組比較：1）P0.05，2）P0.01；與治療組比較：3）P0.05    2.2  血清、腦組織GSHPx、超氧陰離子自由基（O2）清除率測(cè)定結(jié)果  見(jiàn)表2。血清GSHPx活力正常組明顯高于模型組和治療組（P0.01）；模型組與治療組尚無(wú)明顯差異（P0.05）；腦GSHPx活力正常組也高于治療組和模型組，但尚無(wú)明顯差異；腦O2清除率治療組和正常組均明顯高于模型組（P0.01），治療組和正常組無(wú)明顯差異（P0.05）；腦O2濃度模型組明顯高于治療組和正常組（P0.01）。    2.3  血清A

10、LT、TG、TC、尿素測(cè)定結(jié)果  見(jiàn)表3。各組間均無(wú)明顯差異（P0.05）。表2  各組血清、腦勻漿GSHPx活力、腦O2清除率和濃度比較與正常組比較:1)P0.01；與模型組比較：2）P0.01表3  各組血清ALT、TG、TC和尿素含量    3  討  論    3.1  模型組腦組織TchE活力明顯升高  本次實(shí)驗(yàn)采用D半乳糖和亞硝酸鈉聯(lián)合造模。D半乳糖注射進(jìn)入體內(nèi)后，其代謝產(chǎn)物半乳糖醇不能被進(jìn)一步代謝而堆積在細(xì)胞內(nèi)，影響滲透壓，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹，代謝紊亂，體內(nèi)

11、活性氧水平升高，細(xì)胞生物膜脂質(zhì)受損，腦神經(jīng)元發(fā)生一系列退行性變化，出現(xiàn)AD模型特點(diǎn)。目前也常采用1次性腹腔注射亞硝酸鈉120 mg/kg體重造模小鼠記憶障礙模型，由于亞硝酸鈉進(jìn)入體內(nèi)，使血紅蛋白氧化為高鐵血紅蛋白而失去攜帶氧的功能，引起組織缺氧，導(dǎo)致大腦意識(shí)和行為上障礙。本次采用90 mg/kg（體重）較小劑量長(zhǎng)時(shí)間注射，而D半乳糖也采取較小劑量100 mg/kg體重造模。模型組腦TchE活力明顯高于正常組（P0.05）和治療組（P0.01）。文獻(xiàn)研究中，有關(guān)AD動(dòng)物模型腦內(nèi)TchE活性變化的報(bào)道不盡一致，有的降低3，有的升高4，5，主要是因?yàn)樵炷７椒ú煌?。本文采用文獻(xiàn)1的造模方法，結(jié)果腦

12、內(nèi)TchE活性明顯升高。臨床上由于AD病人中TchE活性升高，對(duì)AD病人治療目前最有效的方法是膽堿酯酶抑制劑4，抑制TchE活性而使乙酰膽堿分解減慢，以維持膽堿能神經(jīng)功能而達(dá)到治療的目的。近年實(shí)驗(yàn)研究表明，何首烏有效成分二苯乙烯苷對(duì)AD治療有明顯效果3，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果治療組腦內(nèi)TchE活性明顯低于模型組，而與正常組接近，與文獻(xiàn)報(bào)道一致6，從而維持膽堿能神經(jīng)正常功能。    3.2  模型組腦組織抗氧化能力明顯降低。模型組腦組織MDA含量和O2濃度明顯高于治療組和正常組6，而O2清除率卻明顯低于治療組和正常組。血清GSHPx活力正常組明顯高于模型組和治療組，說(shuō)

13、明模型組抗氧化能力已明顯降低，而治療組已接近正常組，說(shuō)明藥物對(duì)能夠防止AD的發(fā)生或改善AD的癥狀，起到治療作用。    3.3  其他生化指標(biāo)未見(jiàn)明顯變化  ALT、尿素、TG、TC、腦蛋白等各組未見(jiàn)明顯差異，說(shuō)明造模未造成肝、腎系統(tǒng)損害，也未造成脂類代謝障礙。    【參考文獻(xiàn)】  1 羅煥敏，陳子晟.一種新的老年癡呆動(dòng)物模型J.中國(guó)老年學(xué)雜志，2003；23（3）：17982.    2 蕭華山，何文錦，傅文慶，等.一種用分光光度計(jì)檢測(cè)氧自由基的新方法J.生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，1999；26（2）：1802.    3 秦海強(qiáng)，李 亞，田蘇平.淀粉樣蛋白及D半乳糖對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶和膽堿酯酶活性的影響J.南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2000；20（3）：1957.    4 田金洲，楊承芝，楊惠民.復(fù)方大黃制劑對(duì)老齡小鼠大腦皮質(zhì)和海馬ChAT、AchE活性及Ach含量