嘌呤類藥物作用及巰基嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶遺傳多態(tài)性的研究進(jìn)展

1、嘌呤類藥物作用及巰基嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶遺傳多態(tài)性的研究進(jìn)展 目前研究結(jié)果表明,治療急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)的抗嘌呤代謝藥物?6-巰基嘌呤(6-MP)和6-巰代鳥嘌呤(6-TG)均是無內(nèi)在生物活性的藥物,必須通過體內(nèi)一系列代謝后才能發(fā)揮抗白血病效應(yīng)。而人體一種被稱為巰基嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶(TPMT)的代謝酶在此類藥物代謝和抗白血病作用中起關(guān)鍵作用。此酶是存在于哺乳動物和禽類細(xì)胞中的一種細(xì)胞內(nèi)酶,非金屬依賴性,能利用S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)作為甲基的供體和底物結(jié)合,特異地催化雜環(huán)類和芳香類化合物苯環(huán)6-位硫原子的甲基化,其內(nèi)在底物和主要的生物學(xué)功能仍然未完全清楚1，2，而其DNA編碼順序上某個

2、核苷酸堿基點(diǎn)突變,是造成嘌呤類藥物不同強(qiáng)度的細(xì)胞毒作用的基礎(chǔ)3。所以,對于TPMT酶學(xué)特點(diǎn)、其遺傳多態(tài)性的分子生物學(xué)機(jī)制以及6-MP、6-TG臨床關(guān)系的研究成為當(dāng)前研究藥代動力學(xué)的熱點(diǎn)之一。16-MP和6-TG的代謝4，56-MP的代謝途徑：由次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HPRT)催化先形成硫基次黃嘌呤單磷酸鹽(TIMP),硫基黃嘌呤單磷酸鹽(TXMP),硫基鳥嘌呤單磷酸鹽(TGMP),后者經(jīng)磷酸化后分別形成二磷酸鹽和三磷酸鹽。后三種物質(zhì)統(tǒng)稱為TGNs,它整合到腫瘤細(xì)胞中影響DNA的復(fù)制及RNA的表達(dá),發(fā)揮抗腫瘤作用。6-MP,TIMP,TGMP均可由TPMT催化生成甲基化的衍生物6-meMP,6

3、-meTGMP,6-meTIMP,這些甲基化的化合物屬于“無活性”的物質(zhì),它們能夠抑制磷酸核糖焦磷酸化氨基轉(zhuǎn)移酶(PRPP-AT)的活性,后者是細(xì)胞重新合成嘌呤步驟中的關(guān)鍵酶,因此,抑制PRPP-AT的活性就阻斷了腫瘤細(xì)胞遺傳信息的表達(dá),從而達(dá)到抗白血病的作用。由黃嘌呤氧化酶催化形成6-硫基黃嘌呤后再形成尿酸也可生成尿酸排出。6-TG的代謝途徑：由HPRT催化直接形成硫基鳥嘌呤磷酸化合物(TGNs)發(fā)揮抗白血病作用。也可由TPMP催化生成甲基化的產(chǎn)物如6-meTG,或me-TGMP,達(dá)到抗腫瘤的作用。但組織中TPMP對6-TG的催化效力遠(yuǎn)比6-MP低(約為1/12)4，故此過程并非6-TG的主

4、要代謝途徑。6-TG由鳥嘌呤脫氫酶催化生成6-硫基黃嘌呤再由黃嘌呤氧化酶催化生成尿酸排出。2TPMT的酶學(xué)特點(diǎn)2.1TPMT的組成結(jié)構(gòu)：由兩個具有相同的催化功能單體組成,說明TPMT的結(jié)構(gòu)并非引起遺傳多態(tài)性的原因。TPMT的分子量大約為30000。通過提取和分析人腎臟組織中的TPMT,發(fā)現(xiàn)它由245個氨基酸殘基組成。另有人還發(fā)現(xiàn)幾乎每個依賴SAM的甲基轉(zhuǎn)移酶均含有3個結(jié)構(gòu)保守的序列(motif，)，分別含24-，12-，12-三個單體結(jié)構(gòu),估計這些序列為酶結(jié)合底物的結(jié)構(gòu)域68。2.2TPMT的組織分布：人類TPMT首先在肝臟、腎臟中被發(fā)現(xiàn),隨后陸續(xù)地在胃腸道、肺、腦、血液、胎兒、胎盤等組織中發(fā)

5、現(xiàn)。成年人肝細(xì)胞的TPMT濃度和血液組織中幾乎呈直線相關(guān)。第3個月的胎兒即有TPMT的存在,其中第6個月的濃度及活性和新生兒類似,說明TPMT的濃度及活性在人體各組織內(nèi)，甚至腫瘤組織中均存在密切相關(guān)性,測定紅細(xì)胞中的TPMT濃度即可大致估計其它組織的酶活性9,10。2.3TPMT的酶學(xué)動力學(xué)特征：酶活性隨孵育時間、底物濃度、pH值和離子濃度、底物濃度(紅細(xì)胞濃度)的變化而變化11。TPMT最佳孵育時間為60分鐘10,其它參數(shù)符合Michaelis-menten曲線。同時,Krynetski等11發(fā)現(xiàn)在一般組織中(肝、腎等)酶作用最佳pH值為7.5,而血液中為6.7。2.4TPMT的底物及抑制物

6、：Krynetski等做了18種6-MP和6-TG衍生物的酶學(xué)實(shí)驗(yàn),包括它們的核苷酸和核糖核酸,描述了它們的反應(yīng)特性：大多數(shù)的衍生物均可作為TPMT的底物,它們的酶促動力學(xué)特性均符合Michaelis-menten曲線,發(fā)現(xiàn)6-MP比6-TG與酶結(jié)合的能力強(qiáng)。在所有前體藥物(6-MP,6-TG)和衍生物中,8-羥基-6-MP和6-TG分別是兩個藥物家系中活性最大者,而它們的核苷酸鹽類則是這些化合物中活性最低的,其原因可能是它們較易被水解。Mcleod等10發(fā)現(xiàn)當(dāng)化合物中7,9位被烷基化后,其與酶結(jié)合的能力有所加強(qiáng)。同時發(fā)現(xiàn)前體藥物的Km、Vm和Km/Vm值均比其衍生物低,說明6- MP和6-T

7、G并非TPMT的自然底物。另外,6-硒基嘌呤(Selenopurine)及其衍生物也可以作為TPMT的底物,但是它們的Km和Vm值均顯著比硫基嘌呤及其衍生物低。黃嘌呤8位上有-OH基者是底物，而2位上有-OH則為抑制物12。除2-OH-黃嘌呤外,S-腺苷-L-半胱氨酸、Sinefungin、6-甲基硫基嘌呤、3，4-雙甲氧-5-對羥基苯甲酸為TPMT的抑制物2。3TPMT的遺傳多態(tài)性從人類T84結(jié)腸癌患者細(xì)胞中提取分析DNA及cDNA寡核苷酸探針篩查文庫,發(fā)現(xiàn)TPMT基因總長為3.4kb,編碼序列總長2.7kb,開放閱讀框架含735個堿基。國外多個文獻(xiàn)調(diào)查顯示,大約有89%的人TPMT酶活性6

8、U/ml pRBC,屬于高活性,而11%的人酶活性為15U/ml pRBC,屬于中度活性。而大約1/300的人活性低于1U/ml pRBC或其活性無法測出。造成這種結(jié)果的原因是編碼TPMT的核苷酸堿基順序發(fā)生點(diǎn)突變,而是否有染色體易位或丟失尚無文獻(xiàn)報道。美國和英國學(xué)者已在白種人中發(fā)現(xiàn)和克隆出兩個點(diǎn)突變位點(diǎn),分別命名為TPMT*2和TPMT*3。其中前者是核苷酸序列中第238位的鳥嘌呤(G)胞嘧啶(C),使得氨基酸序列第80位的Ala(丙氨酸)Pro(脯氨酸),后者是第460位的鳥嘌呤(G)腺嘌呤(A),第719位的腺嘌呤(A)鳥嘌呤(G),結(jié)果是氨基酸序列第154位的AlaThr(蘇氨酸),第

9、240位的Tyr(酪氨酸)Cys(半胱氨酸),這樣就造成了酶活性的減低或喪失，從而導(dǎo)致在使用6-MP時形成高濃度的TGNs,引起明顯的造血組織細(xì)胞毒性,產(chǎn)生嚴(yán)重后果,甚至引起死亡。兩種突變類型中,TPMT*3出現(xiàn)的頻率占兩種類型的70%，而TPMT*2占30%13,14。4影響TPMT活性的因素4.1種族特異性：美國弗羅里達(dá)州黑種人平均TPMT酶活性為8.643.47U/ml pRBC,未發(fā)現(xiàn)缺陷患者。而白種人平均為12.33.88U/ml pRBC,酶活性的分布比例與前述類似15。Mcleod等16發(fā)現(xiàn)白種人的酶活性平均值為16.8U/ml pRBC,黑種人則為14.4U/ml pRBC(P

10、0.001)。法國人平均15.47.0U/ml pRBC,其TPMT遺傳多態(tài)性的分布和美國人相同1。新加坡的調(diào)查顯示,健康華人中TPMT的多態(tài)性結(jié)論和美國人相似,而實(shí)際的數(shù)值卻大大超過了國外報道的結(jié)果17。挪威Saami人的平均值為17.03.3U/ml pRBC,白種人為13.12.9U/ml pRBC(P0.001),而酶活性的分布比例與前面結(jié)果相似18。同時,他們與韓國合作檢測韓國人群的酶活性,其結(jié)果也類似19。4.2性別：3篇文獻(xiàn)報告在白血病患者中女性的酶活性似比男性高,而健康人無明顯差別5，8，20。其它的文獻(xiàn)結(jié)果為無顯著差異2，3，17。4.3年齡：文獻(xiàn)提示TPMT的活性與年齡無相

11、關(guān)性9。4.4紅細(xì)胞壽命及免疫分型：無相關(guān)性11。4.5使用6-MP前后TPMT活性：患者在進(jìn)行化療時其體內(nèi)TPMT的活性與用藥前相比大約要上升30%,其中以用藥前活性最低的患者上升得最快。而用藥后約3個月又逐漸回到原來水平,其中下降得最快者是用藥期間活性上升最高者5，11。4.6慢性疾?。簾o相關(guān)性11。5TGNs和TPMT的關(guān)系TGNs和TPMT甲基化是嘌呤類藥物治療白血病的兩個重要途徑,它們之間的關(guān)系可以歸結(jié)如下：高TPMT活性的人群形成的TGNs量少,甲基化產(chǎn)物多；低活性的人群形成的量多,甲基化產(chǎn)物少。因此,低活性人群TGNs雖然能產(chǎn)生強(qiáng)烈的抗腫瘤作用,但同時也容易產(chǎn)生毒副作用,引起造血

12、組織的致命損傷；而高活性的人群由于體內(nèi)的TGNs量少,雖然此副作用弱,但出現(xiàn)復(fù)發(fā)的機(jī)率也大21。66-TG和6-MP的臨床關(guān)系由于6-TG直接衍生為TGNs,而且臨床發(fā)現(xiàn)患者在使用6-TG時較少出現(xiàn)造血組織毒副作用及具較低復(fù)發(fā)性,因此,有人建議以它 替代6-MP。但6-TG可引起門脈高壓，與別嘌呤醇合用時引發(fā)較高的毒性,而且價格昂貴、半衰期短,所以目前臨床醫(yī)生建議和6-MP按需選擇性交替使用22。此外,6-MP和6-TG的作用機(jī)制也稍有不同,前者作用于細(xì)胞周期的G1/S期,而后者作用于S/G2晚期,6-MP使嘌呤再合成受阻,而6-TG則使染色體“變性”,可能引起嚴(yán)重的治療后期不良反應(yīng),故當(dāng)患者

13、酶活性低時可適當(dāng)降低藥物劑量,有文獻(xiàn)報道將劑量降低90%時所產(chǎn)生的療效和正常劑量無顯著差異。另有文獻(xiàn)報道酶活性低患者當(dāng)降低6-MP劑量時如果和甲氨喋呤(MTX)聯(lián)用可產(chǎn)生較好的療效。其機(jī)制為抑制嘌呤合成后產(chǎn)生大量磷酸核糖焦磷酸鹽,后者可以整合到細(xì)胞DNA中抗腫瘤。而當(dāng)患者酶缺陷時應(yīng)大規(guī)模減少劑量或選擇換用其它藥物。由于大多數(shù)患者在治療前其體內(nèi)TPMT活性未知,因此,在用藥時較難避免造血組織毒性,加大了治療的難度及影響療效。此外,輸血可能造成測定時的誤差,應(yīng)引起注意23。7研究嘌呤類藥物和TPMT的意義進(jìn)行此項(xiàng)研究的意義在于：測定6-MP原發(fā)性耐藥個體,避免患者對藥物不敏感,造成維持治療期的復(fù)發(fā)

14、,貿(mào)然加大劑量同時也易產(chǎn)生毒副反應(yīng)。測定TGNs濃度,避免高濃度時患者對藥物過度敏感,產(chǎn)生造血組織抑制和肝臟損害,被迫終止維持治療,使化療不能長期、規(guī)則、正常地進(jìn)行,從而容易復(fù)發(fā)。避免由于造血組織的毒性使得全身免疫能力下降,產(chǎn)生繼發(fā)感染,引發(fā)死亡或其它嚴(yán)重的反應(yīng)。因此,認(rèn)識中國人6-MP藥代動力學(xué),深入研究TPMT表現(xiàn)型和基因型,了解其遺傳多態(tài)性的分布和機(jī)制,掌握藥物代謝過程中的各種數(shù)據(jù),就可針對每個患者不同酶活性和TGNs而制定相應(yīng)的用藥方案,使治療個體化,提高急性白血病尤其是ALL的遠(yuǎn)期療效乃至提高長期無病生存率。參 考 文 獻(xiàn)1Tinel m,Berson A,Ersayre D,et

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