基因槍法介導(dǎo)的魔芋遺傳轉(zhuǎn)化研究

1、收稿日期:2004-03-19*國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(39870541資助李貞霞,女,1973年生,碩士,講師.工作單位:河南職業(yè)技術(shù)師范學(xué)院園藝系,新鄉(xiāng)453003基因槍法介導(dǎo)的魔芋遺傳轉(zhuǎn)化研究*李貞霞1,2張興國(guó)2(1河南職業(yè)技術(shù)師范學(xué)院園藝系,新鄉(xiāng)453003;2西南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院,重慶400716摘要 利用基因槍轟擊法建立了魔芋的遺傳轉(zhuǎn)化體系。試驗(yàn)結(jié)果表明,氦氣壓力/轟擊距離以7.58GPa/9cm 最適。在轟擊前4h 和轟擊后16h 用附加有0.4mol/L 甘露醇的M S 培養(yǎng)基進(jìn)行高滲處理、轟擊后恢復(fù)培養(yǎng)67d,有利于減少逆境傷害,增加轉(zhuǎn)化成功的幾率。早期選用1mg/L B

2、asta 作為選擇壓,而后期的篩選使用2mg /L 較高濃度的Basta 可以獲得真正的轉(zhuǎn)化子。對(duì)獲得的91株抗性植株進(jìn)行了P CR 檢測(cè),結(jié)果顯示21株呈陽性,表明PA T 基因和A GPS 1反義基因均已整合進(jìn)魔芋基因組。關(guān)鍵詞 魔芋;基因槍;遺傳轉(zhuǎn)化中圖法分類號(hào) S 623.3 Q 785魔芋是由天南星科(Araceae魔芋屬(A mor p hop hallus Blume的多年生草本植物1,其品種退化和更新緩慢是生產(chǎn)上的難題。因此對(duì)魔芋現(xiàn)有品種的品質(zhì)進(jìn)行改良,選育更優(yōu)質(zhì)的新品種是一個(gè)亟待解決的課題。品質(zhì)改良的主要目標(biāo)在于增加魔芋的葡甘露聚糖含量和減少淀粉的積累。葡甘露聚糖含量越高和淀

3、粉含量越低的品種,品位越高,加工出來的魔芋精粉產(chǎn)量越高,質(zhì)量越好。腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGP是植物淀粉生物合成的關(guān)鍵酶。它催化1 P G 和ATP 生成ADP 葡萄糖(ADPG。后者將作為淀粉合成酶的底物直接參與直鏈淀粉和支鏈淀粉的合成。在植物中,該酶是由2個(gè)大亞基(AGPL和2個(gè)小亞基(AGPS組成的異源四聚體。目前,該酶及其基因已經(jīng)從玉米、小麥、菠菜等多種植物中得到分離純化和研究。在不同物種間,小亞基高度保守,而大亞基相對(duì)變幅較大;小亞基是酶的活性中心,而大亞基則主要起調(diào)節(jié)作用。1993年美國(guó)M osounto 公司將來自大腸桿菌的A GP 基因?qū)腭R鈴薯,其塊莖的淀粉和干物質(zhì)含量

4、平均提高24%;相反,若導(dǎo)入該酶的反義基因,則淀粉含量下降到只有對(duì)照的2%。因此通過對(duì)該酶的遺傳操作,可以達(dá)到顯著增加或減少植物體內(nèi)淀粉含量的目的。本研究探討了魔芋基因槍轉(zhuǎn)化A GPS 1基因的條件,并對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR 驗(yàn)證、為今后利用基因工程技術(shù)進(jìn)行魔芋育種和品質(zhì)改良打下基礎(chǔ)。1 材料與方法1.1 材 料受體材料為白魔芋愈傷組織。質(zhì)粒為pPAT AGPS1,上含有p at 基因(除草劑抗性基因和A G PS 1反義基因。愈傷培養(yǎng)基為M S +1mg/L 6 BA +1mg/L NAA +6g/L 瓊脂+30g/L 蔗糖。分化培養(yǎng)基為M S +1mg /L 6 BA +0.05mg

5、/L NAA +6g/L 瓊脂+30g/L 蔗糖。1.2 微彈的制備稱取7.5mg 直徑為1mm 的金粉放入滅菌的離心管中。加入1mL 70%的乙醇振蕩懸浮,放置過夜。5000r/min 離心3min,棄上清,收集金粉。重復(fù)以下步驟3次:加1m L 的無菌水,渦旋1min,放置1min,離心沉淀金粉,去上清。加入無菌雙蒸水120 L 重懸,于4 保存?zhèn)溆?。每次使用前吸取上述金粉懸浮?0 L 至離心管中。加入5 L 質(zhì)粒DNA(1 g/ L,充分振蕩。加入50 L 2.5mol/L 的CaCl 2和0.1mol 亞精安,并充分混勻。靜置2min 后分別用70%和100%的乙醇洗2遍。最后加入5

6、0 L 的100%乙醇,4 保存,每槍上樣10 L,可轟擊5槍。1.3 轟擊前后材料的處理轟擊前將3040塊0.5cm 2見方大小的受體材料置于培養(yǎng)皿(直徑9cm中心直徑不大于3cm的范圍內(nèi)。分別于轟擊前4h和轟擊后16h內(nèi)進(jìn)行滲透處理,滲透培養(yǎng)基為愈傷組織培養(yǎng)基附加0.4 mol/L的甘露醇。1.4 轟擊后轉(zhuǎn)化子的篩選轟擊后的材料經(jīng)滲透處理后轉(zhuǎn)入愈傷組織培養(yǎng)基附加100mg/L的Carb中恢復(fù)培養(yǎng)67d。再轉(zhuǎn)入含有除草劑Basta的分化培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)篩選。1.5 受體材料對(duì)除草劑Basta的敏感性試驗(yàn)將愈傷組織置于含有Basta0、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50

7、、1.75、2.00mg/L的分化培養(yǎng)基上,每隔2周換1次培養(yǎng)基,45d后觀察并記錄存活外植體數(shù),芽分化外植體數(shù)。1.6 最適的氦氣壓力及轟擊距離不同的氦氣壓力及轟擊距離對(duì)受體材料造成的創(chuàng)傷不同。受體材料轟擊后培養(yǎng)3個(gè)月,觀察統(tǒng)計(jì)愈傷組織存活數(shù)及抗性芽數(shù),確定最適于魔芋愈傷組織的最佳轟擊距離及壓力。1.7 抗性芽的PCR檢測(cè)對(duì)獲得的抗性芽先進(jìn)行A GPS1反義基因的PCR檢測(cè),對(duì)呈陽性的植株再進(jìn)行PAT基因的檢測(cè)。反應(yīng)體系及反應(yīng)程序如下:200 L薄壁管中含有無菌水17.378 L,10!PCR buffer2.5 L,25 mmol/L MgCL21.5 L,10mmol/L dNPTs0.

8、5 L, 5引物1 L,3引物1 L,TaqDNA酶0.125 L,模板DNA1 L,共25 L。PCR反應(yīng)程序:943min,1個(gè)循環(huán);941 min,551min30s,722m in30s,共35個(gè)循環(huán);7210min,1個(gè)循環(huán)。以質(zhì)粒pBIN AGPS1的DNA為陽性對(duì)照(+ CK,非轉(zhuǎn)化植株基因組DNA為陰性對(duì)照(-CK。10 L PCR產(chǎn)物在含EB的1%瓊脂糖凝膠中電泳,紫外燈下觀察照相。2 結(jié)果與分析2.1 除草劑Basta對(duì)魔芋愈傷組織分化的影響在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)不同濃度的Basta均會(huì)在一定程度上抑制愈傷組織的生長(zhǎng)。2mg/L的Basta使愈傷組織致死。在愈傷組織的分化過程中,1m

9、g/L Basta就足以抑制正常的芽的再生,即使分化的芽也很難生長(zhǎng)(見表1。表1 Basta對(duì)魔芋愈傷組織分化的影響Table1 Effects of Basta on the differention of calliof Am orphophallus albusB asta濃度/mg#L-1接種愈傷組織數(shù)1存活外植體數(shù)2分化芽外植體數(shù)3芽分化率/%41.50800001.75800002.00800001I n oculated callus numbers;2Survived explant numbers;3Explant nu mbers with bud differentiat

10、ion;4Differentiation rate of buds 在實(shí)際的篩選過程中為了得到真正的轉(zhuǎn)化子,我們初期采用1mg/L的Basta為篩選壓,篩選培養(yǎng)68周后降為Basta 0.75mg/L,以利于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的再生,得到抗性芽后再逐步提高篩選壓的濃度。后期篩選驗(yàn)表明,真正的轉(zhuǎn)化子即使在2mg/L Basta的高濃度篩選壓下也能繼續(xù)生長(zhǎng)。2.2 轟擊的氦氣壓力及轟擊距離對(duì)轉(zhuǎn)化的影響基因槍的轟擊參數(shù)中,氦氣壓力對(duì)轉(zhuǎn)化效率有一定的影響。氣壓大小決定子彈的速度和入射深度,能否有效地將子彈射入具有分化潛能的細(xì)胞層是轉(zhuǎn)化能否成功的關(guān)鍵之一5。本研究采用4種不同的氦氣壓力及轟擊距離,比較結(jié)果發(fā)現(xiàn)較低

11、的氦氣壓力和適當(dāng)?shù)霓Z擊距離有利于愈傷組織的轉(zhuǎn)表2 氦氣壓力/轟擊距離對(duì)轉(zhuǎn)化的影響T able2 Effects of H e press ure and bombardmentdis tance on transformation氦氣壓力/轟擊距離1Gpa/cm受體愈傷組織數(shù)2存活愈傷組織數(shù)3抗性芽數(shù)410.7/121751129.31/121852167.58/1220027137.58/919042231He pres sure/bombardment distance;2Callu s numbers of acceptors;3Survival callu s numbers;4Num

12、bers of buds with resis tance660 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)第23卷化(見表2。魔芋具有分化潛能的細(xì)胞位于愈傷組織的表層,較低的氦氣壓力和適當(dāng)?shù)霓Z擊距離將有助于子彈擊中這些細(xì)胞層,提高轉(zhuǎn)化的發(fā)生頻率。2.3 轉(zhuǎn)化體的篩選和抗性植株的獲得基因槍轟擊后的愈傷組織在愈傷組織培養(yǎng)基附加100mg/L Carb 的培養(yǎng)基中過渡培養(yǎng)67d 后,轉(zhuǎn)接于分化培養(yǎng)基附加有100mg/L Carb 和Basta 1mg/L 的培養(yǎng)基中篩選培養(yǎng),每隔2周換1次培養(yǎng)基。經(jīng)過34次轉(zhuǎn)接后,大部分愈傷組織褐化或白化,死亡,少部分愈傷組織色澤正常,并有所增大,繼續(xù)培養(yǎng)后發(fā)出綠芽(見圖1。2.4 抗性芽

13、的PC R 檢測(cè)1抗性芽的AG PS 1反義基因的PC R 檢測(cè)。在基因槍轉(zhuǎn)化試驗(yàn)中,共轟擊5次,每次5槍,轟擊魔芋愈傷組織近1000塊,經(jīng)69個(gè)月的培養(yǎng),共得抗性植株91株,PC R 檢測(cè)結(jié)果顯示21株呈陽性。擴(kuò)增仍以未轉(zhuǎn)化植株D NA 為陰性對(duì)照(-C K,質(zhì)粒pPA T AG PS 1為陽性對(duì)照(+C K。(見圖2。2抗性芽的Pat 基因檢測(cè)。對(duì)AGPS 1反義基因PCR 檢測(cè)呈陽性的抗性植株,進(jìn)行Pat 基因檢測(cè),以質(zhì)粒pPAT AGPS 為陽性對(duì)照, 以未轉(zhuǎn)化植圖1 抗Basta 魔芋愈傷組織的篩選Fig.1 Selection of Basta resistant calli of

14、 Konj ak onmedium containing 1mg/L of Basta左:對(duì)照Left CK;右:轉(zhuǎn)化體Right T ransformant圖2 A GPS 1反義基因轉(zhuǎn)化植株的PC R 檢測(cè)Fig.2 PCR detection of transgenic plants of AGPS 1antonymy gene (primersA/DM:1kb Marker ;16:轉(zhuǎn)化植株Transgenic plants ;7:未轉(zhuǎn)化植株No transgenic plants;8:pPAT AGPS 1圖3 轉(zhuǎn)化植株P(guān)at 基因PCR 檢測(cè)Fig.3 Pat gene of tr

15、ansgenic plants by PCR amplif icationM:Marker 16:轉(zhuǎn)化植株Transgenic plants;7:陰性對(duì)照Negative control;8:陽性對(duì)照Positive control株的基因組DNA 為陰性對(duì)照(見圖3。結(jié)果發(fā)現(xiàn),AGPS 1反義基因PC R 檢測(cè)呈陽性的,Pat 基因檢測(cè)有的并未呈陽性,這可能與基因整合的過程有關(guān)。3 討 論基因槍法是繼原生質(zhì)體介導(dǎo)法之后廣泛使用的單子葉植物遺傳轉(zhuǎn)化手段。該方法具有多種優(yōu)點(diǎn)如:(1能轉(zhuǎn)化任何植物,特別是那些由原生質(zhì)體再生較為困難和農(nóng)桿菌感染不敏感的單子葉植物。(2能轉(zhuǎn)化植物的任何細(xì)胞和組織。目前

16、,為了提高基因槍的轉(zhuǎn)化效率,多以優(yōu)化操作參數(shù),包括轟擊距離、轟擊速度、金粉及DNA 的用量等和轉(zhuǎn)化前后用高滲處理來提高瞬時(shí)表達(dá)。其中研究較多的就是金粉和DNA 的用量問題。金粉顆粒(吸附有一定量的DNA的數(shù)量越多,轟擊時(shí)對(duì)細(xì)胞造成的損傷程度越大,如果細(xì)胞受傷過大,以至于不能恢復(fù)或恢復(fù)得很慢,則外源基因的整合及表達(dá)就會(huì)受阻,從而降低轉(zhuǎn)化頻率。米慶莉等2在研究水稻時(shí)發(fā)現(xiàn):粳稻細(xì)胞對(duì)金粉顆粒造成的損傷程度不敏感,較高用量的金粉(1 g DNA 用500 g 金粉轉(zhuǎn)化時(shí),可得到較高的瞬時(shí)表達(dá)。秈稻細(xì)胞對(duì)金粉顆粒造成的損傷卻不敏感,只有當(dāng)金粉顆粒用量減少到一定程度(0.25 g DNA 用125 g 金

17、粉,才能得到較高的瞬時(shí)表達(dá)。梁輝等3轟擊培養(yǎng)14d 左右的小麥幼胚愈傷組織,每槍0.5 g DNA 用250 g 金粉較好?？梢?材料不同所選用的金粉和DNA 用量也是不同的。基因槍轟擊前后的高滲處理也是提高轉(zhuǎn)化效率的重要因素。Vain 等最先將滲透壓處理方法用于玉米的基因槍轉(zhuǎn)化,結(jié)果表明,用0.4Mpa 的滲透壓在轟擊前4h 和轟擊后16h 處理,可將G U S 瞬時(shí)表達(dá)提高2.7倍,穩(wěn)定表達(dá)增加6.8倍4。高滲處理影響轉(zhuǎn)化的原因在有關(guān)文獻(xiàn)中已有提及,但還不是很清楚。可能是因細(xì)胞在高滲條件下發(fā)生了質(zhì)壁分離,從而減少了在微彈穿孔時(shí)細(xì)胞質(zhì)泄漏,而提661 第6期李貞霞等:基因槍法介導(dǎo)的魔芋遺傳轉(zhuǎn)

18、化研究高了細(xì)胞的生存力。在我們的試驗(yàn)中,高滲透壓處理也顯示出較好的效果,但最適選擇壓濃度和處理時(shí)間各有不同,還需要進(jìn)一步探索和研究?；驑屴D(zhuǎn)化技術(shù)從誕生至今十幾年時(shí)間里,已取得了可喜的進(jìn)展,但還有不少問題值得進(jìn)一步研究,例如:轉(zhuǎn)化效率低,穩(wěn)定遺傳的比例較差,外源DNA的整合機(jī)理不清楚等。相信隨著科技的發(fā)展,基因槍轉(zhuǎn)化技術(shù)的理論研究和應(yīng)用研究都將得到更好的發(fā)展。參 考 文 獻(xiàn)究中心選編.中國(guó)魔芋論文選集(第一分冊(cè).重慶:西南農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社,1995.29332 米慶莉,何鍶浩,曹守云.秈稻及粳稻對(duì)基因槍轉(zhuǎn)化反應(yīng)的差異及提高轉(zhuǎn)化率的研究.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào),1998,6(3:2632683 梁 輝,

19、趙鐵漢,李良材.影響基因槍法轉(zhuǎn)化小麥幼胚的幾個(gè)因素的研究.遺傳學(xué)報(bào),1998,25(5:4434484 Vain P,McMuiien M D,Finer J J.Os motic treatment enhances particle bombardment mediated transient and stabletrans formation of maize.Plant Cell Reports,1993,12(2:84885 趙 虹,李名揚(yáng),裴 炎.基因槍轉(zhuǎn)化小麥幾個(gè)影響因素的研究.四川大學(xué)學(xué)報(bào),2001,38(4:570574Genetic Transformation of Am

20、orpho phallus Mediated by Gene GunLi Zhenx ia1,2 Zhang Xingguo2(1Dep ar tment of Horticulture,Henan Vocation T echnical Teachers College,X inx iang453003,China;2College o f H or ticulture and L andscap e,Southw est Agr icultur al Univer sity,Chongqing400716,ChinaAbstract Genetic transformation system of A morp hop hallus w as established via gene g un.Results showed t