生化檢測方法匯總

1、.一、血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（SGPT）賴氏改良法器材:試管及試管架、移液器或吸量管、恒溫水浴鍋、721型分光光度計(jì)、溫度計(jì)、動(dòng)物血清試劑:（1）0.1mol/L pH7.4磷酸鹽緩沖液：0.1mol/L磷酸氫二鈉溶液：稱取Na2HPO414.22g或Na2HPO4·2H2O17.8g溶 解于蒸餾水中，并稀釋至1 000ml,4保存。0.1mol/L磷酸二氫鉀溶液：稱KH2PO413.61g溶解dH2O中，稀釋至1000ml, 4保存。將0.1mol/L磷酸氫二鈉溶液420ml和0.1mol/L磷酸二氫鉀溶液80ml混和即 為0.1mol/L pH7.4的磷酸鹽緩沖液。加氯仿數(shù)滴，4保存。（

2、2）標(biāo)準(zhǔn)丙酮酸（含丙酮酸2.0mol/mL） ： 取標(biāo)準(zhǔn)丙酮酸鈉10mg，用上述緩沖液準(zhǔn)確定容為50mL。此液須當(dāng)日用當(dāng)日配。（3）SGPT底物液(含-酮戊二酸2mol/ml及DL-丙氨酸200mol/ml) :取-酮戊二酸29.2mg，DL-丙氨酸7g ,用試劑1溶成100ml，在稀釋到刻度前，以1mol /L NaOH調(diào)pH 7.4（因?yàn)檗D(zhuǎn)氨酶在pH7.3以下或7.6以上的環(huán)境中酶活性下降），加數(shù)滴氯仿防腐。此液于冰箱保存可使用4天。（4）GOT底物液(DL天冬氨酸200mmol/L ,-酮戊二酸 2mmol/L):稱取- 酮戊二酸29.2mg和DL-門冬氨酸2.66g置于一小燒杯中,加入

3、1mol/L氫氧化鈉20.5ml使溶解,并校正pH至7.4,然后將溶液移入100ml容量瓶內(nèi),用0.1mol/L磷酸鹽緩沖液定容至刻度。放置冰箱內(nèi)保存。（5）2.4-二硝基苯肼溶液: 取分析純2,4-二硝基苯肼19.8mg，用1mol/LHCl溶于100ml，置棕色瓶中保存。（6）0.4mol/L NaOH溶液:稱取16g固體NaOH，用蒸餾水溶解，冷卻至室溫，定容至1000mL，備用。操作步驟：1、 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：取試管18支按下表操作。試 管 號對 照12345丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)液（1毫升2微克分子）00.050.100.150.200.25SGPT或SGOT底物0.500.450.400.350

4、.300.250.1M磷酸鹽緩沖液PH7.40.10.10.10.10.10.1相當(dāng)于谷丙轉(zhuǎn)氨酶單位0285797150200相當(dāng)于谷草轉(zhuǎn)氨酶單位02461114190每個(gè)樣做3個(gè)平行，置37水浴30分鐘，各管加2，4-二硝基苯肼液0.5mL，混勻，再在37水浴中放置20mL，各管加0.4mol/L氫氧化鈉溶液5mL，混勻，10分鐘后，從水浴箱中取出，以蒸餾水調(diào)“零”點(diǎn)，用520nm波長比色，讀取各管之吸光值，各管之吸光值均減去空白的吸光值，然后以吸光值為縱坐標(biāo)，各管相應(yīng)的轉(zhuǎn)氨酶單位為橫坐標(biāo)。繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。為了方便，可列出各光度相當(dāng)于轉(zhuǎn)氨酶單位表。2、酶活性測定：取試管兩支，注明測定管及對照

5、管。試劑樣品測定（每個(gè)樣3個(gè)平行）對 照（每個(gè)樣3個(gè)平行）血 清（mL）0.10.1SGPT或SGOT底物（mL）0.5置37水浴30分鐘（SGOT為37，60分鐘后再加枸櫞酸苯胺1滴）2.4-二硝基苯肼（mL）0.50.5置37水浴20分鐘SGPT或SGOT底物（mL）0.5NaOH溶液（mL）5.05.0對照及樣品各做3個(gè)平行，充分搖勻，靜置10分鐘后，用520nm波長比色，以蒸餾水調(diào)節(jié)零點(diǎn)，讀取吸光值，用樣品減去對照吸光值，求得樣品的谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力。l 谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性單位： 37， pH7.4，每小時(shí)每毫升血清催化生成1mol 丙酮酸為1個(gè)單位。例：0.1ml血清每小時(shí)催化生成0.1mo

6、l丙酮酸, 即相當(dāng)于GPT 100U / 100ml 血清。l 注意：1. 在測定SGPT時(shí)，應(yīng)事先將底物、血清在37水浴中 保溫，然后在血清管中加入底物，準(zhǔn)確記時(shí)。2. 標(biāo)準(zhǔn)曲線上數(shù)值在20500U是準(zhǔn)確可靠的，超過 500U時(shí)，需將樣品稀釋。3. 轉(zhuǎn)氨酶只能作用于L氨基酸，對D氨基酸無 作用。實(shí)驗(yàn)室多用DL氨基酸（較L氨基酸 價(jià)廉），若用L氨基酸，則用量減半。4. 溶血標(biāo)本不宜使用，因血細(xì)胞中轉(zhuǎn)氨酶活力較高， 會(huì)影響測定效果。5. 血清樣品的測定需在顯色后30分鐘內(nèi)完成。6.丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)液的濃度要求十分精確。由于丙酮酸開封后易變質(zhì)為多聚丙酮酸，而影響丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)液的有效濃度而不易察覺。建議使用

7、質(zhì)量可靠的市售丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)液。7.每批試劑的空白管吸光度上下波動(dòng)不應(yīng)超過0.015A，若有超出，應(yīng)仔細(xì)檢查試劑與儀器方面的問題。8.嚴(yán)重脂血、黃疸、溶血和糖尿病酮癥酸中毒病人血清標(biāo)本可增加測定的吸光度，測定這類標(biāo)本應(yīng)做血清標(biāo)本對照管優(yōu)點(diǎn)：盡管基質(zhì)液中余下的a-酮戊二酸同樣可生成紅棕色苯腙硝醌化合物而影響測定結(jié)果,但因其量不多,加之對505nm的吸光度遠(yuǎn)不如丙酮酸生成的苯腙硝醌化合物強(qiáng),尤其用標(biāo)準(zhǔn)曲線作測定時(shí),所用的酶活性單位通過卡門氏分光光度速率法矯正,擯棄了賴氏法一些固有弊端,結(jié)果比其他比色法準(zhǔn)確.故衛(wèi)生部臨檢中心建議國內(nèi)無條件使用連續(xù)監(jiān)測法的單位使用賴氏法.1981年全國常規(guī)生化檢驗(yàn)方法學(xué)術(shù)

8、討論會(huì)認(rèn)為賴氏法測定ALT活性較為合理, 缺點(diǎn)：由于賴氏法設(shè)計(jì)的底物濃度,如a-酮戊二酸不足,反應(yīng)速度只能達(dá)到最大速度的65%;顯色劑2,4-二硝基苯肼的用量只及反應(yīng)液中酮酸濃度的一半;保溫30min的酶促反應(yīng)后,新生成的丙酮酸和未用完的a-酮戊二酸存在著無法人為控制的競爭顯色的幾率問題,如此等等,使賴氏法的重現(xiàn)性較差,在測量精度上仍與連續(xù)監(jiān)測法相差甚大.* 1個(gè)卡門氏單位的定義是：在溫度25，pH7.4，波長340nm，光徑1cm的條件下，1ml血清使NADH的吸光度下降0.001的轉(zhuǎn)氨酶活性。* 國際單位：在最適溫度（25）下，1分鐘產(chǎn)生1mol丙酮酸的酶量為1個(gè)活性單位，即1IU=1um

9、ol/min。* King法單位定義是：每1ml血清在37條件下與底物作用60 min，生 成1mol丙酮酸稱為一個(gè)單位。* Mohun 法單位定義是：每毫升血清在pH=7.4，37條件下與底物作用30 min，每生成2.5微克丙酮酸為1單位。二、尿素氮（BUN）（二乙酰一肟法尿素測定）（一）儀器設(shè)備：水浴鍋、紫外分光光度計(jì)、10mL試管（二）試劑：1、 尿素氮試劑：蒸餾水100mL，濃硫酸44mL，85%磷酸66mL，冷卻至室溫后，加氨基硫脲50mg，硫酸鎘（3CdSO4·8H2O）2g，溶解后稀釋至1000mL。2、 20g/L二乙酰一肟試劑：稱取二乙酰一肟20g，加入蒸餾水溶解

10、，定容至1000mL。3、 尿素氮標(biāo)準(zhǔn)貯存液（357mmol/L）：稱取尿素1.072g溶解于蒸餾水中定容至1000mL，至于棕色瓶中貯存。4、 尿素氮標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液（17.85mmol/L）：取貯存液5mL，加蒸餾水定容至100mL。（三）操作步驟按下面表格的試劑配比操作：試劑測定管標(biāo)準(zhǔn)管空白管血清（ml）0.02-尿素氮標(biāo)應(yīng)用準(zhǔn)液（ml）-0.02-蒸餾水（ml）0.02二乙酰-肟試劑（ml）0.50.50.5尿素氮試劑（ml）5.05.05.0按上述表的配方每個(gè)樣做3個(gè)平行樣，混勻，置沸水浴中加熱15min，立即用自來水冷卻5分鐘。分光光度計(jì)選用540nm波長，以空白管調(diào)零點(diǎn)，讀取各管吸光度

11、。尿素（mg%）=測定管吸光度/標(biāo)準(zhǔn)管吸光度×17.85(mg/ml)n 1. 此法靈敏度高，用量極微（一般只需0.02ml血清即可）。本實(shí)驗(yàn)是先將血清用生理水以1：4加以稀釋再取0.1ml，故最后計(jì)算時(shí)，應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)“5”n 2. 試劑中加入硫胺脲和鎘離子，可增進(jìn)顯色強(qiáng)度和色澤穩(wěn)定性，但仍有輕度褪色現(xiàn)象（小于5%/h）。n 3. 此法操作簡單，特異性強(qiáng)，不受其他非蛋白質(zhì)含氮化合物如尿酸、肌酸等影響，但應(yīng)控制好實(shí)驗(yàn)條件。n 4. 吸管必須校正，使用時(shí)務(wù)必注意清潔干凈，加量務(wù)必準(zhǔn)確。n 5.尿液中的尿素氮也可用此法進(jìn)行測定。由于尿液中尿素氮含量高，標(biāo)本需用蒸餾水以1:50稀釋。如果呈

12、色后吸光度仍超過本法的線性范圍，還需將尿液再稀釋，重新測定。n 3尿素濃度以前習(xí)慣用尿素氮表示，尿素分子中含有二個(gè)氮原子，因此1mmol/L尿素等于2 mmol/L尿素氮。世界衛(wèi)生組織推薦使用尿素，并以mmol/L表示濃度單位，我國衛(wèi)生部也已規(guī)定一律使用尿素，不再使用尿素氮一詞。 尿素氮mg% = 測定管/標(biāo)準(zhǔn)管×0.002×100/0.1×5 = 測定管/標(biāo)準(zhǔn)管×10 【參考范圍】 5-20 mg/dl 三、肌酐（Cr）四、血糖（Glu）（鄰甲苯胺法）血糖是指血液中的葡萄糖，葡萄糖與冰醋酸、鄰甲苯胺共熱時(shí)，葡萄糖先脫水轉(zhuǎn)化為羥甲基糠醛，再與鄰甲苯胺縮合

13、為藍(lán)綠色的薛夫堿，其顏色的深淺與葡萄糖含量成正比?？捎帽壬ㄟM(jìn)行定量測定。 1、儀器：紫外分光光度計(jì)、水浴鍋2、試劑：（1）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)母液（10mg/ml，用飽和苯甲酸溶液配制）（2）鄰甲苯胺溶液：2.5g硫脲溶于冰醋酸，加入鄰甲苯胺150ml及2.4%硼酸100ml，用冰醋酸定容至1升。3、操作步驟：（1）配置不同濃度葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液：取5支10ml容量瓶，標(biāo)號，依次加入葡萄糖母液0.25，0.5，1.0，2.0，3.0ml，用飽和苯甲酸稀釋至10ml，混勻（則上述溶液100ml葡萄糖含量為25，50，100，200，300mg ）；（2）分別精密吸取不同濃度葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液于試管中，設(shè)平行管，

14、空白管加0.1mL蒸餾水，各管加入鄰甲苯胺試劑5.0mL，混勻后，置沸水中 15分鐘，立即移入冷水浴中冷卻；（3）以空白號管調(diào)零，于紫外分光光度計(jì)波長630nm 處測吸光值，以各管的吸光度為縱坐標(biāo)，相應(yīng)管中葡萄糖含量（mg）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出線性方程。（4）測試樣品：取全血0.1mL，設(shè)平行樣，按上述方法測出其A630nm吸光值，通過線性方程求出其血糖含量。試劑（mL）012345鄰甲苯胺試劑5.05.05.05.05.05.0不同濃度葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液00.10.10.10.10.1蒸餾水0.100000100mL全血相當(dāng)于葡萄糖質(zhì)量mg02550100200300A630nm0.00

15、0注意事項(xiàng)： 1. 本法不需要除去蛋白質(zhì)，鄰甲苯胺試劑只與醛糖顯色，血液中其他還原性物質(zhì)基本上無影響。 2. 鄰甲苯胺試劑與葡萄糖顯色的深淺及其穩(wěn)定性與試劑中鄰甲苯胺濃度、冰醋酸濃度、加熱時(shí)間有關(guān)。此法顯色穩(wěn)定，24小時(shí)內(nèi)無變化。如將加熱時(shí)間縮短，生成顏色容易消褪。 3. 輕度溶血的血清對結(jié)果無明顯影響。根據(jù)推導(dǎo)，血清中含血紅蛋白 450毫克/100毫升時(shí)，可使測定結(jié)果降低約10%。 4.高脂血的標(biāo)本最后顯色有時(shí)會(huì)出現(xiàn)渾濁，影響測定結(jié)果?？上戎苽溲獮V液后再行測定。五、血清白蛋白（Alb）（溴甲酚綠法BCG）原理：血清白蛋白在PH4.2的緩沖液中帶正電荷，在有非離子型表面活性劑存在時(shí)，可與帶負(fù)電

16、荷的染料溴甲酚綠（BCG）結(jié)合形成藍(lán)綠色復(fù)合物，在波長630納米處有光吸收峰，其顏色的深淺與白蛋白濃度成正比，與同樣處理的白蛋白標(biāo)準(zhǔn)比較，可求得血清白蛋白含量。試劑：1. 溴甲酚綠（BCG）貯存液：取BCG 419mg，用10ml 0.1mol/L NaOH溶解，加NaN3 100mg ，定容至1000mL。貯于棕色瓶備用。如用溴甲酚綠鈉鹽應(yīng)稱取432mg.加水溶解。2.0.1mol/L檸檬酸緩沖液（pH 4.2）：分別配制0.1mol/L檸檬酸和檸檬酸鈉溶液，然后按12.3：7.7的體積比例混合。每1000ml混合液加入NaN3 100mg。3.30%聚氧化乙烯月桂醚(Brij-35)溶液：

17、取Brij-35 30g，加少量水，60水浴溶解，加水至100ml（此可用Tween-20或Tween-80代替)。4.BCG應(yīng)用液：BCG貯存液250ml，0.1mol/L檸檬酸緩沖液（pH4.2)750ml，30%Brij-35 8ml(也可以用Tween-20 8ml或Tween-80 10ml代替）混合而成。5.標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液（10mg/ml)：稱取白蛋白1.00g，用生理鹽水。實(shí)驗(yàn)操作：1. 白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制(1) 稀釋白蛋白標(biāo)準(zhǔn)液：分別精密量取白蛋白標(biāo)準(zhǔn)液0.10 mL，0.20 mL，0.40 mL，0.60 mL于試管中，再在每個(gè)管中依次加入蒸餾水0.9 mL，0.8 mL，0

18、.6 mL，0.4 mL，混勻，得到稀釋后白蛋白標(biāo)準(zhǔn)液含量分別為1.0 mg/ml，2.0 mg/ml，4.0 mg/ml，6.0 mg/ml。(2) 分別精密量取每個(gè)不同濃度稀釋白蛋白標(biāo)準(zhǔn)液0.2mL于試管中，空白管加入生理鹽水0.2mL，設(shè)平行樣，再在每個(gè)管中加入BCG應(yīng)用液5.0mL，混勻后以空白管調(diào)零，立即于紫外分光光度計(jì)測吸光值，吸收波長為620mn，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出線性方程。(3) 樣品血清白蛋白測定：用生理鹽水按1：10的比例稀釋血清，取稀釋后的血清0.2ml按上述方法測出其吸光值，求得其白蛋白含量。注意事項(xiàng)n 1BCG是一種PH指示劑，變色域?yàn)镻H3.8（顯黃色）5.4（顯藍(lán)

19、綠色），因此控制反應(yīng)液的PH是本法測定的關(guān)鍵。n 2配制BCG試劑也可用其他緩沖液如枸椽酸鹽或乳酸鹽緩沖液。但以琥珀酸緩沖液的校正曲線通過原點(diǎn)，線性好，靈敏度高，成為首選推薦配方。n 3試劑中的Brij-35也可用其他表面活性劑代替，如吐溫20或吐溫80，終濃度為2ml，靈敏度和線性范圍不變。n 4當(dāng)白蛋白標(biāo)準(zhǔn)與BCG結(jié)合后，溶液光徑1，在630處測定的吸光度應(yīng)為0.811±0.035，如達(dá)不到此值，表示靈敏度較差。n 5蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液是一個(gè)復(fù)雜的問題，實(shí)驗(yàn)證明，BCG不但與白蛋白呈色，而且與血清中多種蛋白質(zhì)成分呈色，其中以球蛋白、運(yùn)鐵蛋白、結(jié)合珠蛋白更為顯著，其反應(yīng)速度較白蛋白稍慢。

20、由于30S內(nèi)呈色對白蛋白特異，故BCG與血清混合后，在30S內(nèi)讀取吸光度，可明顯減少非特異性呈色反應(yīng)。為了減少本法基質(zhì)效應(yīng)的影響，最好用參考血清作標(biāo)準(zhǔn)。n 1本法操作簡便、快速、膽紅素、溶血和中度脂血無干擾，既可手工操作，也能自動(dòng)化分析，是目前國內(nèi)測定血清白蛋白的最常用方法。n 2本法線性范圍10-60g/L，RCV4%。但該法與溴甲酚紫法比較，對血清白蛋白特異性稍差。六、血清總蛋白（TP）（雙縮脲法）原理：血清中蛋白質(zhì)分子的肽鍵與雙縮脲試劑中的Cu+ 結(jié)合形成紫色化合物；其色度與總蛋白的濃度成正比，在546波長下進(jìn)行比色測定。實(shí)際上凡是分子內(nèi)含有兩個(gè)氨基甲?；?CONH2）的化合物，不論直

21、接相連或是通過一個(gè)氮或碳原子間接連接，均能與雙縮脲試劑發(fā)生反應(yīng)。蛋白質(zhì)分子內(nèi)含有許多肽鍵（-CONH2 ），因此可用雙縮脲法作比色測定。但應(yīng)注意的是不僅僅是（-CONH2），凡含-CSNH2、-C（NH）NH2 或-CH2NH2 等基團(tuán)而具有累似結(jié)構(gòu)的化合物對雙縮脲試驗(yàn)亦呈陽性，所以本反應(yīng)并非為蛋白質(zhì)所特有。但在體液中，除蛋白質(zhì)外實(shí)際上不存在可與雙縮脲試劑顯色的物質(zhì)。各種血漿蛋白質(zhì)，包括病理的和正常的，呈色的程度基本相同，因此在血漿蛋白的比色測定中，雙縮脲反應(yīng)是比較理想的方法。儀器：紫外分光光度計(jì)、水浴鍋、電子天平、試劑：（1）10%氫氧化鈉溶液：稱取10.00g氫氧化鈉，用蒸餾水溶解，冷卻至

22、室溫后，定容至1L，備用。（2）雙縮脲試劑：取1.50g硫酸銅和6.0g酒石酸鉀鈉，用500mL水溶解，在攪拌下加入300mL10氫氧化鈉溶液，1.0g碘化鉀；用水稀釋到1000mL，避光保存。此試劑可長期保存。若貯存瓶中有黑色或暗紅色沉淀出現(xiàn)，則需重新配制。（3）標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液：10mg/mL牛血清白蛋白溶液或相同濃度的酪蛋白溶液（酪蛋白用0.05moL/L氫氧化鈉溶液配制）。作為標(biāo)準(zhǔn)用的蛋白質(zhì)要預(yù)先用微量凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)含量，根據(jù)其純度稱量，配制成標(biāo)準(zhǔn)溶液。（4）待測蛋白質(zhì)溶液：待測血清按1:10倍數(shù)稀釋，待用。（注意樣品濃度不要超過10mg/ml）操作方法：（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定：精密吸

23、取0 mL，0.2 mL，0.4 mL，0.6 mL，0.8 mL，1.0mL的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液于試管中，分別依次加入蒸餾水1.0mL，0.8mL，0.6mL，0.4mL，0.2mL，0mL，設(shè)平行樣，然后加入4mL雙縮脲試劑。充分搖勻后，37水浴10min，以空白管調(diào)零點(diǎn)，在540nm波長處測定吸光值。以蛋白質(zhì)的含量為橫坐標(biāo)，光吸收值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。（2）樣品的測定：用上述同樣的方法，測定稀釋的待測血清的蛋白質(zhì)濃度。注意：1.樣品中總蛋白含量超過100.0g/L，則用生理鹽水稀釋后測定，結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)。2.試劑渾濁變色不能用。3.試劑使用后立即蓋緊瓶蓋。 1、白蛋白/球蛋白=1.52.

24、5/1，通過計(jì)算其比值可以判定肝臟的功能情況； 2、總蛋白升高：脫水，皮膚大面積燒傷、發(fā)燒、腹瀉、嘔吐。 3、總蛋白降低：大量輸液將機(jī)體血漿稀釋，某些水腫性疾病，長期營養(yǎng)不良和消耗性疾病。 4、球蛋白大量降低：機(jī)體免疫功能降低。七、總膽固醇（TCH）八、甘油三酯（TG）九、酪氨酸多巴氧化酶活性測定（多巴色素法）1、儀器設(shè)備：紫外分光光度計(jì)，離心機(jī)，秒表2、試劑：（1）0.10mol/L磷酸緩沖液（pH6.0）:50mL0.20mol/L Na2HPO4與22mL0.1mol/L HCl混合，稀釋至200mL。（2）0.010mol/L多巴溶液：稱取0.195g多巴，用pH6.0磷酸緩沖液溶解并

25、定容至100mL。3、實(shí)驗(yàn)方法：取0.1mL待測液于試管中，加入2.9mL pH6.0緩沖液，再加入2mL多巴溶液，立即搖勻于480nm波長下測吸光值，開始6min內(nèi)每分鐘讀一次數(shù)，以后各2min讀一次數(shù)，直至吸光度變化不大為止。以吸光度對時(shí)間作圖，從直線斜率求出酶活性。設(shè)平行樣，同樣方法測0.2mL和0.3mL待測液的吸光值，求出酶活力。試樣中酶活力計(jì)算公式：=k/V×106待測樣品的酶活性；k吸光值對時(shí)間作出的直線斜率；多巴溶液的摩爾吸收系數(shù)，L/g.cm；V待測樣品的體積，mL。十、SOD的測定方法1、試劑的配制（1）0.05mol/L磷酸緩沖液(PBS，pH7.8)：A母液：

26、0.2mol/L磷酸氫二鈉溶液: 取Na2HPO4·12H2O（分子量358.14）71.7g,用蒸餾水溶解并定容至1000mL；B母液：0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量156.01）31.2g，用蒸餾水溶解并定容至1000mL；0.05mol/L PBS(pH7.8）的配制：分別取A母液(Na2HPO4) 228.75mL，B母液(NaH2PO4) 21.25mL，用蒸餾水定容至1000mL。（2）14.5mM甲硫氨酸溶液(Met)：取2.1637g Met用磷酸緩沖液（pH7.8）定容至1000ml。（3）30M EDTA-Na2溶液：

27、取0.001gEDTA-Na2用磷酸緩沖液定容至100mL。（4）60M核黃素溶液：取0.0023g核黃素用磷酸緩沖液定容至100mL，避光保存。（5）2.25mM 氮藍(lán)四唑(NBT)溶液：取0.1840g NBT用PBS定容至100ml，避光保存。2、酶活性測定（1）反應(yīng)混合液配制(以60個(gè)樣為準(zhǔn))：分別取Met溶液162mL，EDTA-Na2溶液0.6mL，磷酸緩沖液5.4mL，NBT溶液6mL，核黃素溶液6mL,混合后搖勻；（2）分別取3ml反應(yīng)混合液和30L酶液于試管中（3）將試管置于光照培養(yǎng)箱中在4000 lux光照下反應(yīng)20min；同時(shí)做兩支對照管，其中1支試管取3mL反應(yīng)混合液加

28、入30LPBS（不加酶液）照光后測定作為最大光還原管，另1支只加緩沖液置于暗中測定時(shí)用于調(diào)零。（4）以不照光的對照管（只有緩沖液并置于暗處）調(diào)零后，避光測A560(出現(xiàn)顏色即可測定)。（5）酶活性計(jì)算：SOD活性單位以抑制NBT光化還原50所需酶量（測的樣品值要在最大管的一半左右才合適，否則要調(diào)整酶量）為1個(gè)酶活單位（U）。SOD總活性 ( Ack-AE )×V/（1/2Ack×Vt）式中Ack為照光對照管的吸光度； AE為樣品管的吸光度； V為樣品液總體積（ml,1.6ml，加入PBS的體積)； Vt為待測樣（ml，30ul）十一、CAT（過氧化氫酶）的測定方法1、試劑配

29、制：0.15mol/L磷酸緩沖液（pH7.0）：取A母液(Na2HPO4) 457.5 ml 和B母液(NaH2PO4) 292.5 ml混合后用蒸餾水定容至1000ml。2、酶活測定（1）反應(yīng)液配制：取200ml PBS（0.15M，pH7.0），加入0.309ml 30%的H2O2（原液）搖勻即可。（2）樣品測定：以PBS為對照調(diào)零，取3ml反應(yīng)液加入0.1ml（可視情況調(diào)整）樣品液，立即測定A240（紫外），1min測一次，連續(xù)4min。（3）酶活性計(jì)算：以每min OD值減少0.01為1個(gè)酶活性單位（u）。CAT（u/mL·min）=A240 /（Vs×0.01&#

30、215;t） 式中A240：為反應(yīng)時(shí)間內(nèi)吸光度的變化；T：為反應(yīng)時(shí)間(min)；Vs：為測定時(shí)樣品液體積（ml）。十二、MDA的測定方法1、試劑配制：（1）5%TCA（三氯乙酸）：5.0gTCA用蒸餾水定容至1000ml；Cm·mol/L（2）0.5%TBA（2-硫代巴比妥酸）：2.5g用TCA定容至500ml。（避光）2、操作方法：取待測樣2mL和3ml0.5%TBA混合后在沸水浴煮沸15min，然后迅速冷卻，4500r/min離心10min，用蒸餾水為空白調(diào)零，分別測定上清液在450nm、532nm和600nm處的吸光值。3、計(jì)算組織中MDA含量：MDA濃度C (mol/L)=6

31、.452(OD532-OD600)-0.559D450十三、谷胱甘肽過氧化物酶（GSHPx）活力測定方法原理谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）是體內(nèi)存在的一種含硒清除自由基和抑制自由基反應(yīng)的系統(tǒng)。對防止體內(nèi)自由基引起膜脂質(zhì)過氧化特別重要，其活力以催化GSH氧化的反應(yīng)速度，及單位時(shí)間內(nèi)GSH減少的量來表示，GSH和5,5-二硫?qū)ο趸郊姿幔―TNB）反應(yīng)在GSH-Px催化下可生成黃色的5-硫代2-硝基苯甲酸陰離子，于423nm波長有最大吸收峰，測定該離子濃度，即可計(jì)算出GSH減少的量，由于GSH能進(jìn)行非酶反應(yīng)氧化，所以最后計(jì)算酶活力時(shí)，必須扣除非酶反應(yīng)所引起的GSH減少。1、試劑和儀器儀器：可見

32、光分光光度計(jì)、低溫高速離心機(jī)、恒溫水浴鍋、微量加樣器試劑：（1） 疊氮鈉磷酸緩沖液 pH7.0：分別稱取NaN316.25mg，EDTA-Na27.44mg，Na2HPO4 1.732g，NaH2PO41.076g，加入蒸餾水溶解至100mL，用少量HCL、NaOH調(diào)pH7.0，4保存。 （2）1mmol/L谷胱甘肽（還原型GSH）溶液：稱取GSH30.7mg加疊氮鈉磷酸緩沖液至100mL，臨用前配制，冰凍保存1-2天。（3）1.25-1.5mmol/L H2O2溶液：取30H2O2 0.15mL-0.17mL，用雙蒸水稀釋至100mL，作為貯備液，4避光保存，臨用前將貯備液用雙蒸水稀釋10倍

33、即可。（4）偏磷酸沉淀液：稱取16.7gHPO3（先用蒸餾水溶解），0.5gEDTA，280gNaCl加蒸餾水溶解至1000mL，用普通濾紙過濾，室溫保存。（5）0.32mol/LNa2HPO4溶液：稱取22.7gNa2HPO4加蒸餾水至500mL，室溫保存。（6）DTNB顯色液：稱取40.0mgDTNB，1.000g檸檬酸三鈉加蒸餾水溶解至100mL，4避光保存1個(gè)月。2、實(shí)驗(yàn)步驟1.3.6.2.3.1 樣品制備溶血液：取鼠血10l加入到1mL雙蒸水中，充分振搖，使之全部溶血1:100待測，4h內(nèi)測定酶活力。若當(dāng)天來不及測定，將肝素抗凝全血置-20凍存，3d內(nèi)測定，若4存放，28h內(nèi)必須測完。測前取出樣品室溫自然解凍。組織上清液：動(dòng)物禁