抗生素產(chǎn)生菌初步培養(yǎng)和獲取

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上 抗生素產(chǎn)生菌獲得和初篩一：實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)從土壤中分離微生物的方法學(xué)習(xí)采集樣品和制備培養(yǎng)基學(xué)習(xí)無(wú)菌操作技術(shù) 二：實(shí)驗(yàn)原理 自然界含菌樣品極其豐富，土壤、水、空氣、枯枝爛葉、植物病株、爛水果等都含有眾多微生物，種類數(shù)量十分可觀。但總體來(lái)講土壤樣品的含菌量最多。 土壤由于具備了微生物所需的營(yíng)養(yǎng)、空氣和水分，是微生物最集中的地方。從土壤中幾乎可以分離到任何所需的菌株，空氣、水中的微生物也都來(lái)源于土壤，所以土壤樣品往往是首選的采集目標(biāo)。一般情況下，土壤中含細(xì)菌數(shù)量最多，且每克土壤的含菌量大體有如下的遞減規(guī)律：細(xì)菌（108）>放線菌（107）>霉菌（106）>酵

2、母菌（105）>藻類（104）>原生動(dòng)物（103），其中放線菌和霉菌指其孢子數(shù)同時(shí)也可以從其他微生物富集地方（醫(yī)院附近，廢水等）采集樣品。 抗生素（antibiotics）是由微生物（包括細(xì)菌、真菌、放線菌屬）或高等動(dòng)植物在生活過程中所產(chǎn)生的具有抗病原體或其它活性的一類，能干擾其他生活細(xì)胞發(fā)育功能的化學(xué)物質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)采用的抗生素為類青霉素類和）四環(huán)素類。青霉素屬于青霉素類抗生素，干擾細(xì)菌細(xì)胞壁的合成而產(chǎn)生抗菌作用；土霉素屬于四環(huán)素類抗生素，作用于病原微生體核糖體30S亞基，抑制肽鏈的增長(zhǎng)，影響細(xì)菌或微生物的蛋白質(zhì)合成。 重鉻酸鉀可作為比較理想的放線菌分離抑制劑。根據(jù)目標(biāo)菌落出現(xiàn)數(shù)量和

3、抑制劑的價(jià)格成本, 重鉻酸鉀是一種理想的放線菌分離抑制劑, 它具有3 個(gè)顯著特點(diǎn): 可抑制土壤中細(xì)菌和真菌的生長(zhǎng); 不影響放線菌的正常生長(zhǎng), 有時(shí)還可刺激一些放線菌的生長(zhǎng); 價(jià)格低廉, 在進(jìn)行土壤放線菌大量分離工作中可推廣使用。 高氏一號(hào)培養(yǎng)基適合放線菌生長(zhǎng)。三：實(shí)驗(yàn)材料四：實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 1.培養(yǎng)基配制高氏一號(hào)改良培養(yǎng)基：可溶性淀粉20g，硝酸鉀1g,氯化鈉0.5g，K2HPO4 3H2O 0.5g，MgSO47H2O 0.5g，F(xiàn)eSO47H2O 0.01g，瓊脂20g，水1000ml，終濃度為50×10-5重鉻酸鉀，pH7.27.4。配制時(shí)，先用冷水，將淀粉調(diào)成糊狀，倒入煮沸的水中，

4、在火上加熱，邊攪拌邊加入其他成分，溶化后，補(bǔ)足水分至1000ml。112滅菌20分鐘。冷卻后，倒制平板數(shù)個(gè)。初篩培養(yǎng)基：改良高氏一號(hào)培養(yǎng)基（在原來(lái)配置的高氏一號(hào)瓊脂培養(yǎng)基滅菌后，再分別加入青霉素終濃度為10-5，10-4，10-3的藥劑），倒制平板數(shù)個(gè)2.樣品采集分別從土壤中（將表層5cm左右的浮土除去，取525處的土樣1025，裝入事先準(zhǔn)備好的塑料袋內(nèi)扎好，給塑料袋編號(hào)并記錄地點(diǎn)、土壤質(zhì)地、植被名稱、時(shí)間及其他環(huán)境條件。一般樣品取回后應(yīng)馬上分離，以免微生物死亡），廢水（分別取流動(dòng)處和靜止處，并記錄相關(guān)數(shù)據(jù)）3 制備稀釋液： （1）. 稱取土壤1g（或量取1nl水樣），放入99mL無(wú)菌水的三角

5、瓶中，振蕩10min，即為稀釋102的土壤懸液。 （2）. 另取裝有無(wú)菌試管5支，用記號(hào)筆編上103、104、105、106 、107 。在每只試管中用無(wú)菌吸管加入4.5ml無(wú)菌水。 （3）.取已稀釋成102的土壤液，振蕩后靜止0.5min，用無(wú)菌吸管吸取0.5mL土壤懸液加入103的無(wú)菌水的試管中，并在試管內(nèi)輕輕吹吸數(shù)次，使之充分混勻，即成103土壤稀釋液。同法依次連續(xù)稀釋至10-410 -5 10-6土壤稀釋液。在土壤稀釋過程中，應(yīng)用一支吸管由濃到稀，稀釋到底，稀釋方法見圖（1）4：平板涂抹：取無(wú)菌培養(yǎng)皿，將上述每種培養(yǎng)基平板底面標(biāo)記稀釋度，然后用無(wú)菌吸管從最后三種稀釋度，即10-4、10

6、-5和10-6的試管中吸取0.1ml對(duì)號(hào)放入平板上，用無(wú)菌三角玻棒將稀釋液在平板表面涂抹均勻。（圖2）5：培養(yǎng)：將接種后的培養(yǎng)基靜置10min后，倒置于2830條件下培養(yǎng)34d，計(jì)數(shù)菌落，并計(jì)算出每g土壤中放線菌的數(shù)量。（每毫升樣品中微生物細(xì)胞數(shù)=每皿菌落平均數(shù)*稀釋倍數(shù)*1/取樣體積數(shù)）6：初篩：選取菌落生長(zhǎng)良好，排布均勻的培養(yǎng)基，用接種環(huán)分別均勻（3至5處）挑取培養(yǎng)基中的菌落，在無(wú)菌條件下分別接種于初篩培養(yǎng)基中，倒置于2830條件下培養(yǎng)34d。 抗生素產(chǎn)生菌復(fù)篩一：實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 掌握紫外光譜定性檢測(cè)青霉素的方法2. 了解青霉素的抗菌譜二 實(shí)驗(yàn)原理 青霉素是指從培養(yǎng)液中提制的分子中含有青霉烷

7、、能破壞細(xì)菌的細(xì)胞壁并在細(xì)菌細(xì)胞的繁殖期起殺菌作用的一類抗生素，青霉素在氫氧化鈉介質(zhì)中水解為具有還原性的青霉素噻唑酸后，在沸水加熱的條件下，于0.24mol/L硫酸介質(zhì)中，利用磷鉬酸被還原為鉬蘭的水相顯色反應(yīng)，在720nm處測(cè)定其吸光值。 青霉素為內(nèi)酰胺抗生素對(duì)革蘭陽(yáng)性菌及某些革蘭陰性菌有較強(qiáng)的抗菌作用，金黃色葡萄球菌(金葡菌)、肺炎球菌、淋球菌及鏈球菌等對(duì)本品高度敏感；腦膜炎雙球菌、白喉?xiàng)U菌、破傷風(fēng)桿菌及梅毒螺旋體也很敏感青霉素高活性的環(huán)與敏感細(xì)菌胞漿膜上靶分子青霉素酶結(jié)合蛋白（penicillin binding protein,PBPs）結(jié)合，呈現(xiàn)抑制轉(zhuǎn)肽酶的轉(zhuǎn)肽作用，阻礙黏肽合成的交叉

8、聯(lián)結(jié)過程，造成細(xì)胞壁缺損，由于敏感菌體內(nèi)滲透壓高，使水分不斷內(nèi)滲以至菌體膨脹，促使細(xì)菌裂解而死。三：實(shí)驗(yàn)材料四：實(shí)驗(yàn)內(nèi)容青霉素產(chǎn)出定性檢測(cè)1. 培養(yǎng)基配制 發(fā)酵培養(yǎng)基：10%葡萄糖 ，%-5%麩皮，0.5%-0.8% 苯乙酸，硝酸鉀1g,氯化鈉0.5g，K2HPO4 3H2O 0.5g，MgSO47H2O 0.5g，F(xiàn)eSO47H2O 0.01g，水1000ml pH6.46.8。分裝入三角瓶中，112滅菌20分鐘。2.青霉素標(biāo)液制備準(zhǔn)確稱取注射用青霉素鉀0.2009g無(wú)菌水中，然后移入250ml容量瓶中，無(wú)菌水定容至刻度，即得每毫升含0.8162毫克的青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液。2. 接種選取經(jīng)初篩后，

9、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的單菌落，在無(wú)菌條件下，用接種環(huán)挑取菌落接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，于25培養(yǎng)24h。3.純培養(yǎng)菌落獲得：取經(jīng)過24h發(fā)酵后的生長(zhǎng)狀態(tài)良好的菌株，接種到高氏一號(hào)改良培養(yǎng)基中保存。 青霉素定性檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)樣品制備：吸取青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液1ml于試管中，加入0.2mol/L的Na(OH)溶液0.5ml，1.0mol/LH2SO4溶液1.0ml，5鉬酸銨2.0ml，8Na2HPO41.0ml，加入發(fā)酵培養(yǎng)基至20ml，搖勻，于沸水中加熱20min。取出冷卻，搖勻。試驗(yàn)品制備：取出0.2mol/L的Na(OH)溶液0.5ml，1.0mol/LH2SO4溶液1.0ml，5鉬酸銨2.0ml，8Na2HPO41

10、.0ml于試管中，標(biāo)號(hào)。加入經(jīng)過發(fā)酵后的發(fā)酵培養(yǎng)基至20ml，搖勻，于沸水中加熱20min。取出冷卻，搖勻?？瞻讟悠分苽洌喝〕黾尤?.2mol/L的Na(OH)溶液0.5ml，1.0mol/LH2SO4溶液1.0ml，5鉬酸銨2.0ml，8Na2HPO41.0ml，加入發(fā)酵培養(yǎng)基至20ml，搖勻，于沸水中加熱20min。取出冷卻，搖勻。分光檢測(cè)：分別以空白樣品和標(biāo)準(zhǔn)樣品作為對(duì)照，在720nm處測(cè)定吸光度。 青霉素抗菌譜檢測(cè)1. 培養(yǎng)基配制：高氏一號(hào)篩選培養(yǎng)基：可溶性淀粉20g，硝酸鉀1g,氯化鈉0.5g，K2HPO4 3H2O 0.5g，MgSO47H2O 0.5g，F(xiàn)eSO47H2O 0.0

11、1g，瓊脂20g，水1000ml，pH7.27.4。配制時(shí)，先用冷水，將淀粉調(diào)成糊狀，倒入煮沸的水中，在火上加熱，邊攪拌邊加入其他成分，溶化后，補(bǔ)足水分至1000ml。112滅菌20分鐘。冷卻后，向其中加入經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后的培養(yǎng)液10ml，搖勻，倒制平板數(shù)個(gè)。2. 敏感菌種接種：在無(wú)菌條件下.用接種針（環(huán)）將大腸桿菌，葡萄球菌，乳酸菌，酵母菌，短小芽孢桿菌（根據(jù)實(shí)驗(yàn)室條件）分別用劃線法接種在高氏一號(hào)篩選培養(yǎng)基中，記號(hào)。于2830培養(yǎng)3-4d。3. 結(jié)果觀察:觀察在實(shí)驗(yàn)條件下培養(yǎng)下，敏感菌生長(zhǎng)狀態(tài)。 抗生素產(chǎn)生菌鑒定一：實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 掌握放線菌鑒定的方法。2. 學(xué)會(huì)使用伯杰細(xì)菌手冊(cè)二：實(shí)驗(yàn)原理根據(jù)放

12、線菌在特定培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)生長(zhǎng)的形態(tài)，菌落特征。以及通過對(duì)放線菌進(jìn)行革蘭氏染色、芽孢染色、莢膜染色、鞭毛染色并觀察其運(yùn)動(dòng)性，測(cè)試其生理生化反應(yīng)，然后根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)照伯杰細(xì)菌手冊(cè)判斷試驗(yàn)中所能夠產(chǎn)生抗生素的放線菌的屬（類）三：實(shí)驗(yàn)材料四：實(shí)驗(yàn)內(nèi)容菌體特征的觀察培養(yǎng)基配制：LB固態(tài)培養(yǎng)基：950 ml去離子水中加入:蛋白胨 10g，酵母提取物 5g，NaCl 10g待溶質(zhì)溶解. 瓊脂20g，用5mol/LNaOH調(diào)pH至7.0.用去離子水定容至1L.120蒸汽滅菌20min冷卻后倒制平板。PDA固態(tài)培養(yǎng)基：馬鈴薯 200克，葡萄糖 20克，瓊脂 1520克，自來(lái)水 1000毫升，自然PH，.120蒸

13、汽滅菌20min冷卻后倒制平板。LB液體培養(yǎng)基和PDA液體培養(yǎng)基除瓊脂外，成分同上接種培養(yǎng)：分別在LB、PDA 平板上劃線接種, 28 培養(yǎng)2448h。分別在LB、PDA 液體培養(yǎng)基上接種, 28 搖床振蕩(180r/ min) 培養(yǎng)2448h。2.菌體形態(tài)觀察2.1革蘭氏染色1） 涂片固定。2）草酸銨結(jié)晶紫染1分鐘。3）自來(lái)水沖洗。4）加碘液覆蓋涂面染約1分鐘。5）水洗，用吸水紙吸去水分。6）加95%酒精數(shù)滴，并輕輕搖動(dòng)進(jìn)行脫色，20秒后水洗，吸去水分。7）蕃紅染色液（?。┤?分鐘后，自來(lái)水沖洗。干燥，鏡檢。2.2芽孢染色1）將培養(yǎng)的復(fù)篩放線菌作涂片、干燥、固定。（2）滴加35滴孔雀綠染液于

14、已固定的涂片上。（3）用木夾夾住載玻片在火焰上加熱，使染液冒蒸汽但勿沸騰，切忌使染液蒸干，必要時(shí)可添加少許染液。加熱時(shí)間從染液冒蒸汽時(shí)開始計(jì)算約45分鐘。這一步也可不加熱，改用飽和的孔雀綠水溶液（約76）染10分鐘。（4）傾去染液，待玻片冷卻后水洗至孔雀綠不再褪色為止。（5）用番紅水溶液復(fù)染1分鐘，水洗至水為無(wú)色。（6）待干燥后，置油鏡觀察，芽孢呈綠色，菌體呈紅色2.3莢膜染色（1）制片：取潔凈的載玻片一塊，加蒸餾水一滴，取少量菌體放入水滴中混勻并涂布。（2）干燥：將涂片放在空氣中晾干或用電吹風(fēng)冷風(fēng)吹干。（3）染色：在涂面上加復(fù)紅染色液染色35min。（4）水洗：用水洗去復(fù)紅染液。（5）干燥：

15、將染色片放空氣中晾干。（6）涂黑素：在染色涂面左邊加一小滴苯胺黑，用一邊緣光滑的載玻片輕輕接觸苯胺黑，使苯胺黑沿玻片后緣散開（夾角30度），然后推向另一側(cè)，使黑素在染色涂面上成為一薄層，并迅速風(fēng)干。（7）鏡檢：先低倍鏡，再高倍鏡觀察。2.4鞭毛染色A液：a.5% 石炭酸 10 ml b.鞣酸 2 g c. 飽和硫酸鉀鋁10 mlB液：結(jié)晶紫酒精飽和溶液。應(yīng)用液：A液10份，B液1份，混合過濾后室溫存放a. 使用新的載片,因含游離堿較多，所以要用2鹽酸浸泡幾小時(shí)，用自來(lái)水沖洗干凈，然后再用蒸餾水洗凈，瀝干后放于95乙醇中浸泡24后，取出后燒去酒精，即可使用。b.一張玻片滴蒸餾水2滴，（制兩個(gè)涂片

16、）；c.取幼齡菌菌落少許，將細(xì)菌點(diǎn)在玻片上蒸餾水頂部，不要攪動(dòng)，以免鞭毛脫落，使其自然擴(kuò)散；d.室溫自然干燥。e.把 10 份A液與 1 份B液混合過濾后，取染液覆蓋于菌膜上，染色15min以上，蒸餾水緩緩沖去染液；f.自然干燥后鏡檢。鏡檢時(shí)應(yīng)注意從邊緣開始，逐漸向中心移位。染色結(jié)果：菌體和鞭毛均呈紫色，鞭毛的著色較菌體淡。3. 菌體生理生化實(shí)驗(yàn)3.1糖(醇)類發(fā)酵試驗(yàn)葡萄糖培養(yǎng)基（O/F）成份：蛋白胨 27克 氯化鈉 50克02%溴麝香酚蘭 003克 瓊脂 3克，KH2PO4 03克 葡萄糖 100克，水 1000毫升，溶解調(diào)PH7110高壓滅菌20分鐘后，冷卻倒板待用。步驟：接種將待鑒定的

17、菌種接種到葡萄糖培養(yǎng)基，置37溫箱中培養(yǎng)24h。觀察結(jié)果：被檢細(xì)菌若能發(fā)酵培養(yǎng)基中的糖時(shí)，則使培養(yǎng)基的pH降低，這時(shí)培養(yǎng)基中的指示劑呈酸性反應(yīng)(為黃色)，若發(fā)酵培養(yǎng)基中的糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，則培養(yǎng)基顯酸色反應(yīng)，。若被檢細(xì)菌不分解培養(yǎng)基中的糖，則培養(yǎng)基不發(fā)生變化。3.2甲基紅(Methyl red)試驗(yàn)葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基成份:葡萄糖 0.5g蛋白胨 0.5gK2HPO4 0.2g水 100mlpH 7.2-7.4 110高壓滅菌20分鐘后，冷卻倒板待用。 將待鑒定放線菌接種到葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中，37培養(yǎng) 48h，加甲基紅指示劑數(shù)滴，觀察結(jié)果，呈現(xiàn)紅色者為陽(yáng)性，呈現(xiàn)黃色者為陰性。3.3伏-普二氏試驗(yàn)

18、(V.P 試驗(yàn)) 將被檢菌接種到葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中，37培養(yǎng)48h，取出，倒掉一半培養(yǎng)液，加入40KOH 510滴，然后再加入等量的5萘酚溶液，用力振蕩，再放入37溫箱中保溫1530min，以加快反應(yīng)速度。若培養(yǎng)物呈現(xiàn)紅色，為伏普反應(yīng)陽(yáng)性。表明其能夠利用葡萄糖產(chǎn)生非酸性或中性末端產(chǎn)物的能力3.3檸檬酸鹽利用試驗(yàn)檸檬酸鹽培養(yǎng)成份:檸檬酸鈉 2g K2HPO4 1gNH4H2PO4 1g NaCl 5g MgSO4 0.2g 瓊脂 1.5-2g 1%溴麝香草酚藍(lán)(酒精溶液)或0.04%苯酚紅 10ml 水 1000ml 將上述各成分加熱溶解后，調(diào)PH6,8，然后加入指示劑，搖勻，用脫脂棉過濾。制成后為黃綠色，分裝試管。121滅菌20min后制成斜面。取少量被檢菌接種到檸檬酸鹽培養(yǎng)基上，37培養(yǎng)24h后，觀察結(jié)果。培養(yǎng)基變深藍(lán)色者為陽(yáng)性。培養(yǎng)基不變色，則繼續(xù)培養(yǎng)7天，培養(yǎng)基仍不變色者為陰性。能利用檸檬酸鈉為碳源，因此能在檸檬酸鹽培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，并分解檸檬酸鹽后產(chǎn)生碳酸鹽，使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性。此