二甲雙胍對(duì)糖尿病大鼠心肌病變的抗氧化保護(hù)作用

1、二甲雙胍對(duì)糖尿病大鼠心肌病變的抗氧化保護(hù)作用    【摘要】  目的 探討二甲雙胍(MT)對(duì)2型糖尿病大鼠心肌病變的抗氧化保護(hù)作用。方法 雄性SD大鼠45只，高脂高糖喂養(yǎng)6周后，予以鏈脲佐菌素(STZ)35mg/kg腹腔注射制備2型糖尿病動(dòng)物模型，隨機(jī)分為對(duì)照組(CG)、單純糖尿病組(DG)、小劑量MT干預(yù)組(SM，100mg/kg·d灌胃)及大劑量MT干預(yù)組(LM，300mg/kg.d灌胃)，灌胃12周后，血清檢測(cè)胰島素(INS)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(T-CH)及游離脂肪酸(FFA)，心肌勻漿檢測(cè)超氧化物歧化酶(SOD)及丙

2、二醛(MDA)水平，應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法測(cè)定核因子(NF-B p65)及環(huán)氧化酶-2(COX-2)在心肌中的表達(dá)，并觀察各組心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果 1)與對(duì)照組比較，DG組體重明顯減輕，血糖、心臟質(zhì)量指數(shù)、INS、TG、T-CH及FFA明顯升高(P0.01)；應(yīng)用MT治療后體重?zé)o明顯增加，INS有所下降，心臟質(zhì)量指數(shù)、血糖、TG及FFA明顯降低(P0.01)；DG組心肌組織MDA明顯升高，SOD明顯降低(P0.01)，MT治療后上述指標(biāo)明顯改善；2)超微結(jié)構(gòu)觀察單純糖尿病組肌絲結(jié)構(gòu)明顯紊亂，典型肌小節(jié)結(jié)構(gòu)消失，線粒體腫脹、間質(zhì)纖維增生，微血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹等表現(xiàn)，而SM及LM組可見組織結(jié)構(gòu)有

3、所改善；3)對(duì)照組心肌NF-B p65及COX-2只有少量表達(dá)，單純糖尿病組表達(dá)量明顯增多(P0.01)，MT治療后表達(dá)量明顯減少(P0.01)。結(jié)論 MT對(duì)糖尿病心肌病變具有保護(hù)作用，可能與其減弱脂質(zhì)的過(guò)氧化反應(yīng)，減少NF-B及COX-2的表達(dá)有關(guān)。 【關(guān)鍵詞】  二甲雙胍；糖尿病大鼠；心肌；抗氧化Obstract： Objective  To explore the protective effect and investigate anti-oxidative stress mechanism of metformin on diabetic myocardial d

4、amage in rats. Methods  The model of diabetes in 45 male SD rats was establised through intraperitoneal injection streptozotoch(STZ) 35mg/kg after six weeks by feeding high fat and high glucose food. 45 rats were randomly divided into control group group(CG)、Diabetic group(DG)、small dose metfor

5、min group(SM,intragastric administration with metformin 100mg/kg·d）and large dose metformin group(LM, intragastric administration with metformin 300mg/kg.d ).All groups was taken blood sample to detecte insulin 、blood fat and free fatty acids and prepared myocardium homogenate to detecte activi

6、ty of superoxide dismutate (SOD) and malondialdehyde(MDA) and analyze the express of NF-B p65 and COX-2 in myocardium by immunohistochemical analysis,observe myocardial ultrastructure at the end of 12 weeks. Results  1)compared with the control group,body weight decreased significantly and bloo

7、d glucose 、heart index 、insulin、cholesterol、triglyeride and free fatty acids in DG group increased significantly（P0.01）. Compared with DG group, the level of insulin , heart index 、blood glucose、triglyeride and free fatty acids were cut down significantly after treatment with large or small dose met

8、formin（P0.01）.MDA increased and SOD deceased in myocardium tissues of diabetic group and the difference had significant difference compared with the control group（P0.01）. 2)Myocardial ultrastructure was normal in the control group,myoneme arranged disordered,the structure of typical sarcomere disapp

9、eared, mitochondrium intumesced,interstitial substance fiber hyperplasy,capillary vessel endothelial cell swelled in DG group.Myocardial ultrastructure improved slightly in rats of SM and LM groups. 3)NF-B p65 and COX-2 had a small quantity to present in the myocardium tissue of control group,while

10、the quantity increased obviously in the diabetic group.The level of it in the group of treatment was significant lower than that in the diabetic group.There was significant difference between the two groups. Conclusion  Metformin can protect against the heart injury in diabetic.The mechanisms m

11、ay be associated with inhibition of lipid peroxidation which can decreased the secretion of NF-B and COX-2 evoked by oxidative stress.Key words： metformin；diabetes mellitus；myocardium；anti-oxidative stress    在糖尿病(DM)的諸多慢性并發(fā)癥中，糖尿病性心肌病的危害最大，但由于其病因復(fù)雜，臨床診斷及治療困難，目前尚無(wú)治療該病的特效藥物。二甲雙胍(Metform

12、in，MT)是較傳統(tǒng)的降糖藥，近年由于其在心血管方面的突出作用，對(duì)此藥的研究日趨深入，特別是對(duì)其潛在非降糖機(jī)制的研究頗多1-2。本研究以高脂高糖喂養(yǎng)加小劑量鏈脲佐菌素(STZ)腹腔注射建立的2型糖尿病動(dòng)物模型為研究對(duì)象，觀察MT對(duì)心肌在抗氧化方面的作用。1  材料與方法1.1  材料清潔級(jí)近交系Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠45只(由寧夏醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，8周齡，體重為(220±20)g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(寧)2005-0001。鏈脲佐菌素(STZ)購(gòu)自Sigma公司；二甲雙胍為天津中新藥業(yè)股份公司生產(chǎn)；兔抗鼠NF-B p65及CO

13、X-2多克隆抗體購(gòu)自武漢博士德公司；MDA、SOD、FFA試劑盒為南京建成生物工程研究所的產(chǎn)品；血漿胰島素ElASA試劑盒購(gòu)自大連泛邦試劑公司；微量血糖儀由羅氏公司提供；透射電鏡型號(hào)為HITACHI H-600。1.2  方法對(duì)照組10只大鼠飼以常規(guī)飼料，實(shí)驗(yàn)組35只飼以高脂高糖飼料(10%豬油、20%蔗糖、2%蛋黃粉、1%膽鹽、67%常規(guī)飼料)。喂養(yǎng)6周后，實(shí)驗(yàn)組大鼠隔夜空腹腹腔注射鏈脲佐菌素35mg/kg(以pH4.5、0.1mmol/L枸櫞酸緩沖液配制成20g/L溶液)；對(duì)照組僅注射等容積的枸櫞酸緩沖液，注射1周后，監(jiān)測(cè)大鼠尾尖血糖，以血糖11.1mmol/L作為糖尿病成模標(biāo)準(zhǔn)

14、，按以上標(biāo)準(zhǔn)剔除未成模鼠4只，成模率為88.6%，將成模糖尿病大鼠隨機(jī)分為三組：?jiǎn)渭兲悄虿〗M10只、小劑量MT干預(yù)組11只(SM組)及大劑量MT干預(yù)組10只(LM組)。SM及LM組分別予二甲雙胍100mg/(kg·d)及300mg/(kg·d)溶于1mL生理鹽水灌胃治療，對(duì)照組及單純糖尿病組予以等容積生理鹽水灌胃，每日1次；所有大鼠分籠喂養(yǎng)，充分供給食水，每周測(cè)1次尿糖和體重，每月測(cè)1次血糖，成模后共觀察12周。于灌胃后12周時(shí)進(jìn)行標(biāo)本收集，先測(cè)尾尖空腹微量血糖，然后用20%烏拉坦溶液按5mL/kg腹腔注射麻醉，剖開胸腹，心內(nèi)采血，迅速取出心臟，冰鹽水沖洗，濾紙吸干，稱量心

15、臟重量，計(jì)算心臟質(zhì)量指數(shù)(心重mg/體重g)。(1)分離血清按試劑盒說(shuō)明分別檢測(cè)INS、TG、T-CH及FFA；(2)制備心肌勻漿檢測(cè)：心肌組織SOD、 MDA(按說(shuō)明書嚴(yán)格操作)，計(jì)算抗氧化比值A(chǔ)OR=SOD/MDA；(3)心肌電鏡觀察：于左心室前壁取1mm3心肌組織經(jīng)戊二醛及鋨酸雙固定，梯度乙醇系列脫水，環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片觀察超微結(jié)構(gòu)變化；(4)NF-B p65及COX-2的免疫組化染色(SABC法)：嚴(yán)格按說(shuō)明書操作，NF-B p65為胞漿或胞核呈棕黃色或棕褐色片狀或顆粒狀染色為陽(yáng)性結(jié)果，COX-2為細(xì)胞胞漿或間質(zhì)著色為陽(yáng)性，在image pro-plus 6.0病理圖像分析系統(tǒng)下，

16、測(cè)定陽(yáng)性區(qū)域的面積及平均光密度，計(jì)算累積光密度(IOD)=陽(yáng)性面積×平均光密度。1.3  統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，多組間均數(shù)比較采用方差分析，所有數(shù)據(jù)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件處理。2  結(jié)果2.1  各組大鼠一般情況比較    對(duì)照組組大鼠精神狀態(tài)良好，毛色白有光澤，無(wú)死亡；單純糖尿病組大鼠均出現(xiàn)多飲、多食和消瘦等癥狀，且精神萎靡，毛色干枯；實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，單純糖尿病組死亡2只，血糖恢復(fù)正常1只；SM組死亡2只，LM組死亡1只。2.2  各組大鼠檢測(cè)指標(biāo)的比較(表1)表1  各組大鼠檢測(cè)指標(biāo)的比較(略)    與對(duì)照組比較，單純糖尿病組及SM、LM組體