常用的單克隆抗體檢測(cè)方法

1、通過雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體，在雜交瘤制備完成后，需要對(duì)抗體進(jìn)行一個(gè)檢測(cè)，本文介紹了幾種常用的抗體檢測(cè)的方法（1）免疫酶技術(shù)免疫酶技術(shù)是將抗原抗體反應(yīng)的特異性和酶對(duì)底物顯色反應(yīng)的高效催化作用有機(jī)結(jié)合而 成的免疫學(xué)技術(shù)。由于它特異性強(qiáng)，靈敏度高，現(xiàn)已廣泛用 于篩選和鑒定單抗。器材和試劑a、包被緩沖液：碳酸鹽緩沖液：取 L Na2CO3 8ml, L NaHCO3 17ml混合，再力口 75ml 蒸播水，調(diào) PH至。Tris-HCl 緩沖液（，L）:取 L Tris 100ml, L HCl混合，加蒸儲(chǔ)水至1000ml o b、洗滌緩沖液（的 PB9： KH2PO4 , KCl , Na2HPO4

2、 12H2O , NaCl , Tween-20 ,力口 蒸餾水至1000ml。 c、 稀釋液和封閉液：牛血清白蛋白（ BSA） ，加洗滌液至100ml;或用洗滌液將小牛血清配成 5-10%使用。 d、酶反應(yīng)終止液（2mol/L H2SO4）:取蒸儲(chǔ)水，滴加濃硫酸（98%）。e、底物緩沖液（，磷酸鹽-檸檬酸緩沖液）：取L Na2HPO4， L 檸檬酸，再加50ml 蒸餾水。檸檬酸溶液及配成的底物緩沖液不穩(wěn)定，易形成沉淀，因此一次不宜配制過多。f、底物使用液：OP陳物使用液（測(cè)490nm的OD值）：OPD5mg, 底物緩沖液10ml, 3% H2O2。TMBSg TMB底物使用液（測(cè) 450nm

3、的 OD值）：TMB減 TMB（1mg/ml）,底物緩沖液 10ml, 1%H2O225ul o ABTS底物使用液（測(cè) 410nm的 OD值）：ABTS , 底物緩沖液1ml, 3% H2O2 2ul。g、抗體對(duì)照：以骨髓瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清作為陰性對(duì)照，以免疫鼠血清作為陽性血清。h、抗原： 可溶性抗原：盡量純化，以獲得高特異性。病毒感染的傳代細(xì)胞或全菌抗原。淋巴細(xì)胞等懸液。i 、酶標(biāo)抗鼠抗體或酶標(biāo)SPA或其他類似試劑。j、細(xì)胞固定液：-20 C丙酮；或丙酮-甲醛固定液：Na2HPO4100mg， KH2PO4500mg，蒸播水150ml,丙酮225ml,甲醛125ml;或丙酮-甲醛溶液(1; 1

4、);或-20 C甲醇。k、聚苯乙烯微孔板：40孔、96孔、或條孔；硬板或軟板均可使用。l 、酶聯(lián)免疫閱讀儀；或光鏡。m吸管、加樣器及水浴箱、離心機(jī)等。可溶性抗原 的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA) a、純化抗原用包被液稀釋至 1-20ug/ml o b、以50-100ul/孔量加入酶標(biāo)板孔中，置4c過夜或37c吸附2小時(shí)。c、棄去孔內(nèi)的液體，同時(shí)用洗滌 液洗 3 次， 每次 3-5 分鐘， 拍干。 d、 每孔加 200ul 封閉液 4 過夜或 37封閉 2 小時(shí)；該步驟對(duì)于一些抗原，可省略。e、洗滌液洗3 次；此時(shí)包被板可-20 或4保存?zhèn)溆?。f 、每孔加50-100ul 待檢雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清

5、，同時(shí)設(shè)立陽性、陰性對(duì)照和空白對(duì)照；37孵育1-2 小時(shí)；洗滌，拍干。g、加酶標(biāo)第二抗體，每孔 50-100ul ， 37孵育1-2 小時(shí)， 洗滌，拍干。 h、 加底物液，每孔加新鮮配制的底物使用液50-100ul ，37 10-30 分鐘。i 、以 2mol/L H2SO4 終止反應(yīng)，在酶聯(lián)免疫閱讀儀上讀取 OD直o j、結(jié)果判定：以P/,或PN+3防陽 性。若陰性對(duì)照孔無色或接近無色，陽性對(duì)照孔明確顯色，則可直接用肉眼觀察結(jié)果。全菌抗原的ELISASa、新鮮培養(yǎng)的細(xì)菌用蒸儲(chǔ)水或 PBS懸浮，并調(diào)整細(xì)菌濃度至 1 X 108 個(gè) /ml 。必須指出，對(duì)于人畜共患病病原體需注意安全操作，最好是

6、滅活處理。b、 每孔中加100ul 5%戊二醛溶液（ L NaHCO395ml+25%戊二醛溶液5ml）, 37c作用2小時(shí)，蒸儲(chǔ)水洗滌 3 次；加上述細(xì)菌懸液50ul/ 孔； 37-56 烘干；每孔加 200ul封閉液4c過夜或37 C 2小時(shí)封閉。c、步驟b也可采用先 每孔加 50ul 細(xì)菌懸液，37-56烘干，然后用-20 預(yù)冷的無水甲醇室溫作用15 分鐘， 蒸餾水洗滌3 次； 每孔加 200ul封閉液4c過夜或37 C 2小時(shí)封閉。d、洗滌液洗3次；止匕 時(shí)包被板可在-20 C或4c保存?zhèn)溆?。e、以下步驟同上法。用全細(xì)胞抗原的ELISAa、 按常規(guī)方法培養(yǎng)細(xì)胞，接種病毒，收獲感染細(xì)胞和

7、未感染細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，用 PBS制成適 當(dāng)濃度懸液。b、淋巴細(xì)胞懸液的制備采用新鮮外周血加肝 素抗凝后，滴加于淋巴細(xì)胞分離液之上，1500rpm 離心 30 分鐘，吸取界面細(xì)胞洗滌二次，即為新鮮淋巴細(xì)胞懸液。該細(xì)胞懸液中若仍混有紅細(xì)胞，離心后加%的氯化銨溶液，室溫10 分鐘，洗滌一次即可。將該細(xì)胞懸液稀釋至適當(dāng)濃度。c、每孔加100ul上述a或b的細(xì)胞懸液，使每孔含細(xì)胞5X104個(gè)； 1500r/min 15 分鐘，甩去上清；室溫干燥或吹干后用丙酮 - 甲醇（ 1： 1） 4固定 10 分鐘；可4或-20 保存?zhèn)溆谩、以下步驟同上法?？贵w捕捉ELISA試驗(yàn)本法用抗 BALB/c小鼠Ig的

8、多克隆抗體捕捉待檢樣品中的McAb再依次加抗原、酶標(biāo)多克隆抗體及底物顯色。該法是常用的ELISA中較理想的一種；具操作步驟如下：a、以適當(dāng)濃度的純化抗鼠Ig 抗體包被酶標(biāo)板，每孔加 100ul ， 37 2 小時(shí)或4過夜。b、洗滌、拍干后加待測(cè)的 McAb樣品，37c 1-2小時(shí)。c、 洗滌后加適量的抗原，37 C 1-2小時(shí)。d、洗滌后加入酶標(biāo) 多克隆抗體，37 1-2 小時(shí)。 洗滌后加底物顯色，判定結(jié)果。ABC-ELISA試驗(yàn)ABC-ELISA是在常規(guī) ELISA原理的基礎(chǔ)上， 增加了生物素（ Biotin ） 與親和素（ Avidin ） 間的放大作用。親和素有4 個(gè)亞單位組成，對(duì)生物素

9、有高度的親合力。生物素很易與蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合。因此，結(jié)合了酶的親和素與結(jié)合有抗體的生物素發(fā)生反應(yīng)即起到了多極放大作用。其操作步驟如下：a、已知抗原的包被及加待檢 McAb羊品，同間接ELISA 試驗(yàn)。b、加生物素化抗鼠Ig抗體，每孔100ul , 37 c 1小 時(shí)；洗滌。c、加酶標(biāo)親和素，每孔 100ul , 37 C 30分鐘洗 滌；加底物顯色，判定結(jié)果。 Dot-ELISA試驗(yàn)免疫斑點(diǎn)試 驗(yàn)（Dot-ELISA ）是以硝酸纖維素膜或醋酸纖維素膜為固相 載體，進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)的免疫檢測(cè)手段。該法采用不溶性底物（如DAB或4-氯蔡酚或AgNOWlO ,其與相應(yīng)標(biāo)記物 （HRP AP、膠體金）作

10、用形成不溶性產(chǎn)物，呈現(xiàn)斑點(diǎn)狀著色， 從而易于判定結(jié)果。根據(jù)所用的標(biāo)記物不同，可分為 HRP免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)、AP 免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)和免疫金銀斑點(diǎn)法等。其操作步驟大致如下：a、將抗原液2-5ul點(diǎn)加于纖維素膜上， 室溫37c干燥。b、將纖維膜浸入封閉液中，37c 30分鐘。c、用洗滌液洗2次，吸干后加待檢 McAb樣品，37 C 1小時(shí)； 用洗滌液振蕩洗滌三次，每次5分鐘，加HR破AP或膠體金標(biāo)記的抗鼠Ig抗體，37c作用30分鐘。d、同法洗滌， 吸干，用新配的相應(yīng)底物溶液顯色，然后水洗終止反應(yīng)，觀察結(jié)果。免疫組化染色法該法主要用于檢測(cè)針對(duì)細(xì)胞抗原成分的McAb， 常用的方法是間接免疫過氧化物酶試驗(yàn)（

11、IIP ，indirect immunoperoxidase ）及 APAA俄術(shù)。其結(jié)果用光 鏡或倒置顯微鏡檢查。（ 2）免疫熒光技術(shù)免疫熒光技術(shù)可用于多種抗原的雜交瘤抗體檢測(cè)，如細(xì)胞性抗原（包括細(xì)菌和 動(dòng)物細(xì)胞）、感染細(xì)胞中的病毒抗原和膜抗原等。其操作簡(jiǎn)單、敏感性高，可直接觀察抗原定位等優(yōu)點(diǎn)，在 McAb的篩 選與鑒定上具有重要的應(yīng)用價(jià)值。器材和試劑a、供檢測(cè)抗體用的抗原制備固定細(xì)胞片或板，活細(xì)胞懸液。b、 PBS（，L） c、待檢的McAb樣品。d、冷丙酮e、FITC （異硫匐酸熒 光素）或TRITC （四甲基異硫匐酸羅丹明熒光素）標(biāo)記的抗 鼠 Ig 抗體等 f 、熒光顯微鏡，磁力攪拌器，

12、離心機(jī)，水浴箱等。間接免疫熒光法 a、固定細(xì)胞片的制備：生長(zhǎng)在蓋片上的細(xì)胞（接種或未接種病毒），可直接收獲蓋片，在PBS中洗滌，用4丙酮固定10 分鐘，空氣干燥，置密封容器于-20 保存?zhèn)溆?；單?xì)胞懸液可在蓋片上制成涂片，固定方法同上。細(xì)胞涂片的制備：將10ul細(xì)菌懸液（1X108個(gè)/ml） 涂抹7X21mm片上，自然干燥后，用-20C丙酮固定10-15 分鐘，于-20 C保存?zhèn)溆?。b、蓋片在去離子水中濕潤(rùn)后置架 上滴加 10-20ul 雜交瘤上清或其他待檢樣品；設(shè)立陽性、陰性對(duì)照；置37c水浴孵育小時(shí)。c、取由蓋片置 PBS中用磁 力攪拌器洗滌15分鐘。d、蓋片置架上，滴加工作濃度的抗鼠Ig

13、的熒光抗體10-20ul , 37c孵育小時(shí)。e、同法洗滌15 分鐘；取出蓋片，用延緩熒光碎滅的封載劑（如緩沖甘油，9份甘油加1份PBS封于干凈載玻片上。f、光顯微鏡上觀察，陽性結(jié)果可見特異性熒光（FITC 為黃綠色熒光，TRITC為桔紅色熒光）。g、細(xì)胞固定片的制備，也可改在培養(yǎng)板孔 中進(jìn)行，其余步驟同上，在觀察結(jié)果時(shí)，將培養(yǎng)板翻轉(zhuǎn)置于熒光顯微鏡下，判斷標(biāo)準(zhǔn)不變。細(xì)胞的膜熒光染色完整的活細(xì)胞的細(xì)胞膜，抗體不能透過。如果細(xì)胞在4操作，則熒光染色僅限于細(xì)胞膜。必須注意死細(xì)胞常以非特異性方式吸附大量熒光抗體，因此試驗(yàn)過程中要保證細(xì)胞的高活力?；罴?xì)胞的膜熒光染色大致步驟如下：a、制備活性較好的細(xì)胞懸

14、液，調(diào)節(jié)濃度至 107個(gè)/ml。b、在小試管（5X50mrm 中加入100ul細(xì)胞懸液，再加入100ul待檢McAb的樣品， 混勻，4c作用30-90分鐘。c、用洗滌液（PBS 900ml,小 牛血清50ml, 4%NaN3 50m）洗二次，每次加洗滌液1-5ml ,1000r/min 離心 5 分鐘，棄上清。加入100ul 熒光抗體，4作用30-90分鐘。d、同法洗滌，將細(xì)胞重新懸于20-30U1含 10%甘油和10-100ug 苯二胺 /ml 的溶液中；滴加于載玻片上，加蓋片封載。e、立即在熒光顯微鏡上檢查。f、細(xì)胞也可在染色后用1%多聚甲醛生理鹽水固定，立即檢查，或至少在 4可保存一周。

15、（ 3）間接血凝試驗(yàn)間接血凝試驗(yàn)又稱被動(dòng)血凝試驗(yàn)（PHA） ，是目前應(yīng)用較廣的檢測(cè)方法之一。本試驗(yàn)是以包被可溶性抗原的紅細(xì)胞作為指示系統(tǒng)，當(dāng)被檢抗體與包被在紅細(xì)胞上的抗原產(chǎn)生特異性反應(yīng)時(shí)，導(dǎo)致紅細(xì)胞呈凝集現(xiàn)象。可見，該法具有靈敏、快速、容易操作和無需昂貴儀器等優(yōu)點(diǎn)，而且經(jīng)改用醛化紅細(xì)胞以后，克服原來重復(fù)性差的缺點(diǎn)。器材和試劑 a、綿羊抗凝血，或人" O'型抗 凝血。b、緩沖液：PBS（）;醋酸緩沖液。c、甲醛，丙酮醛， NaN3,抗凝劑等。d、血凝板，振蕩器等。多糖抗原的問 接血凝試驗(yàn)a、甲醛化綿羊紅細(xì)胞的制備：無菌采集綿羊頸靜脈血 50ml， 用枸櫞酸鈉作抗凝劑；用 5 倍

16、于紅細(xì)胞壓積的PBS （Na2HPO4 12H2O , KH2PO4 , NaCl ,蒸儲(chǔ)水 1000ml）充分洗滌5 次，每次1500r/min 5-10 分鐘，直至上清測(cè)定無蛋白質(zhì)（用飽和硫酸銨滴定上清，觀察有無白色沉淀），再以相同緩沖液配成25%紅細(xì)胞懸液；將25%紅細(xì)胞懸液與20%甲醛以：1 的比例混勻，37水浴作用2 小時(shí)，每15 分鐘振蕩一次，紅細(xì)胞顏色逐漸由鮮紅色轉(zhuǎn)變?yōu)樽厣灰訮BS洗滌4次，每次2000r/min 10 分鐘，再以同樣的 PBS制成25%紅細(xì)胞懸液；其后，重復(fù)醛化一次，方法同前；最后配成 20%醛化綿羊紅細(xì)胞懸液，加甲醛至%防腐，4保存?zhèn)溆谩、脂多糖抗原致敏甲

17、醛化綿羊紅細(xì)胞的制備：取脂多糖（ LPS） ， 以 L PB 液， 調(diào)整多糖濃度至120ug/ml ， 然后 100水浴處理1小時(shí)；將冷卻至 37c的熱處理LPS與6燔化紅 細(xì)胞等量混合，37攪拌作用45 分鐘； 取出離心2000r/min10 分鐘，以L PBS 洗滌 4次；配制成4%致敏血球，分裝，保存于4c備用，或凍干保存。c、McAb的篩選：取待測(cè)McAb 樣品25ul ,加入V型微量血凝板孔中，同時(shí)設(shè)立陰性、陽性 對(duì)照； 再加入%致敏紅血球懸液25ul ， 在振蕩器上混勻30 秒；置室溫或37 30-60 分鐘觀察結(jié)果。陰性對(duì)照孔應(yīng)呈緊縮的圓點(diǎn)。 可溶性蛋白抗原的間接血凝試驗(yàn)a、 紅

18、細(xì)胞醛化：采用雙醛法。采綿羊或人" O'型抗凝血，每次加 10倍于紅 細(xì)胞壓積的PBS洗滌4-6次，然后配成8府細(xì)胞懸液；向此 8%紅細(xì)胞懸液緩慢加入等量含有3%丙酮醛和3%甲醛的PBS，于室溫緩慢攪拌17 小時(shí)； 其后洗滌3 次， 配成 20%雙醛化紅細(xì)胞懸液，力口 % NaN3防腐，4c保存?zhèn)溆?。b、致敏紅細(xì)胞：取 20%雙醛化紅細(xì)胞，1500r/min 10 分鐘，棄上清，沉積紅細(xì)胞加L醋酸-醋酸鈉緩沖液1ml,并加最適濃度（應(yīng)預(yù)先 測(cè)定， 蛋白抗原為50ug/ml 左右） 的抗原 1ml， 混勻， 于 45致敏 30 分鐘，有時(shí)輕輕搖動(dòng)，使紅細(xì)胞不下沉。然后離心去上清，并用20倍于紅細(xì)胞壓積的 PBS洗3-4次，最后用PBS配成%a敏紅細(xì)胞，4c保存?zhèn)溆谩、McAb測(cè)定：同上法。 ( 4)放射免疫測(cè)定放射免疫測(cè)定是用放射性同位素標(biāo)記抗原或抗體，以檢測(cè)相應(yīng)抗原或抗體的定量方法。在篩選和鑒定單抗時(shí)常用抗原固相法，即用抗原包被聚乙烯微板，借以檢測(cè)樣品中的 McAb其操作步驟如下：a、用碳酸鹽緩沖液將抗原稀釋至適宜的濃度(1