李斯特菌檢驗(yàn)

1、李斯特氏菌李斯特菌是1926年英國南非裔科學(xué)家穆里在病死的兔子體內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)的，1940年被第三屆國際微生物學(xué)大會(huì)命名為李斯特菌。感染后主要表現(xiàn)為敗血癥、腦膜炎和單核細(xì)胞增多。李斯特氏菌-概況李斯特菌（也稱李氏桿菌）引起的急性傳染病，以敗血病為主要癥狀，伴有內(nèi)臟器官和中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變。李斯特菌是 1926年英國南非裔科學(xué)家 穆里在病死的兔子體內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)的， 為紀(jì)念近代消毒手術(shù)之父、英國生理學(xué)家約瑟夫李斯特 （1827 1912）, 1940年被第三屆國際微生物學(xué)大會(huì)命名為李斯特菌。單核細(xì)胞增生李斯特氏菌是一種人畜共患病的病原菌。它能引起人畜的李氏菌的病，感染后主要表現(xiàn)為 敗血癥、腦膜炎和單核細(xì)胞

2、增多。它廣泛存在于自然界中，食品中存在的單增李氏菌對(duì)人類的安全具有危險(xiǎn)，該菌在4c的環(huán)境中仍可生長繁殖，是 冷藏食品威脅人類健康的主要病原菌之一，因此，在食品衛(wèi)生微生物檢驗(yàn)中，必須加以重視。李斯特菌在環(huán)境中無處不在，在絕大多數(shù)食品中都能找到李斯特菌。肉類、蛋類、禽類、海產(chǎn)品、乳制品、蔬菜等都已被證實(shí)是李斯特菌的感染源。李斯特菌中毒嚴(yán)重的可引起血液和腦組織感染，很多國家都已經(jīng)采取措施來控制食品中的李斯特菌，并制定了相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)。其中單增李斯特菌是唯一能引起人類疾病的。單核細(xì)胞增生李斯特氏菌是一種人畜共患病的病原菌。它能引起人、畜的李氏特菌病，感染后主要表現(xiàn)為敗血癥、腦膜炎和單核細(xì)胞增多。李斯特氏菌

3、-特點(diǎn)李斯特菌快速檢測(cè)試劑盒1、分布廣：存在于土壤、水域（地表水、污水、廢水）、昆蟲、植物、蔬菜、魚、鳥、野生 動(dòng)物、家禽。2、生存環(huán)境可塑性大：能在2-42 C下生存（也有報(bào)道0c能緩慢生長）能在冰箱冷藏室內(nèi)較長時(shí)間生長繁殖。3、適應(yīng)范圍大：酸性、堿性條件下都適應(yīng)。4、帶菌較高的 食品有：牛奶和乳制品；肉類（特別是牛肉）；蔬菜；沙拉；海產(chǎn)品；冰淇凌李斯特氏菌-生存環(huán)境圖7 10產(chǎn)單柱細(xì)胞李斯特苗在隼固體 培養(yǎng)率中的生長情況3-2#：?jiǎn)魏思?xì)胞李斯特菌在半固體培養(yǎng)基上生長情況李斯特菌具有較強(qiáng)的反抗力，秋冬時(shí)期在 土壤中能存活5個(gè)月以上，在冰塊內(nèi)也可存活 3 5個(gè)月，許多冷凍肉類都是它的“溫床”。

4、這種細(xì)菌對(duì)高溫的反抗力也比較強(qiáng)，能在100c下挺1530分鐘，在70 c下可存活30分鐘以上。單增李斯特氏菌廣泛存在于自然界中，不易被凍融，能耐受較高的滲透壓，在土壤、地表水、污水、廢水、植物、青儲(chǔ)飼料、爛菜中均有該菌存在，所以動(dòng)物很容易食入該菌，并通過口腔-糞便的途徑進(jìn)行傳播。據(jù)報(bào)道，健康人糞便中單增李氏菌的攜帶率為0.6-16%,有70%勺人可短期帶菌，4-8%的水產(chǎn)品、5-10%的奶及其產(chǎn)品、30%以上的肉制品及15%A上的家禽均 被該菌污染。人主要通過食入軟奶酪、未充分加熱的雞肉、未再次加熱的熱狗、鮮牛奶、巴 氏消毒奶、冰激凌、生牛排、羊排、卷心菜色拉、芹菜、西紅柿、法式餡餅、凍豬舌等

5、而感 染，約占85-90%的病例是由被污染的食品引起的。該菌可通過 眼及破損皮膚、粘膜進(jìn)入體內(nèi)而造成感染， 孕婦感染后通過胎盤或產(chǎn)道感染胎兒 或新生兒，棲居于陰道、子宮頸的該菌也引起感染，性接觸也是本病傳播的可能途徑，且有 上升趨勢(shì)。李斯特氏菌-生物學(xué)特性1、形態(tài)與染色單核細(xì)胞增多性李斯特菌鞭毛染色該菌為革蘭氏陽性短桿菌，大小約為0.5 mx 1.0-2.0 m,直或稍彎，兩端鈍圓，常呈 V字 型排列，偶有球狀、雙球狀，兼性厭氧、無芽胞，一般不形成莢膜，但在營養(yǎng)豐富的環(huán)境中 可形成莢膜，在陳舊培養(yǎng)中的菌體可呈絲狀及革蘭氏陰性，該菌有4根周毛和1根端毛，但周毛易脫落。2、培養(yǎng)特性該菌營養(yǎng)要求不高

6、，在20-25 C培養(yǎng)有動(dòng)力，穿刺培養(yǎng) 2�5天可見倒立傘狀生長，肉湯 培養(yǎng)物在顯微鏡下可見翻跟斗運(yùn)動(dòng)。該菌的生長范圍為2-42 C （也有報(bào)道在0c能緩慢生長），最適培養(yǎng)溫度為 35-37 C ,在pH中性至弱堿性（pH9.6 ）、氧分壓略低、二氧化碳 張力略高的條件下該菌生長良好，在pH3.8�4.4能緩慢生長，在 6.5% NaCl肉湯中生長良好。在固體培養(yǎng)基上，菌落初始很小，透明，邊緣整齊，呈露滴狀，但隨著菌落的增大， 變得不透明。在 5-7%的血平板上，菌落通常也不大，灰白色，刺種血平板培養(yǎng)后可產(chǎn)生窄 小的3 -溶血環(huán)。在0.6%酵母浸膏胰酪大豆瓊脂（TS

7、AYE）和改良Mc Bride（MMA）瓊脂上，用 450角入射光照射菌落，通過解剖鏡垂直觀察，菌落呈蘭色、灰色或蘭灰色。3、生化反應(yīng)電子顯微鏡下的單核細(xì)胞增多性李斯特菌該菌觸酶陽性，氧化酶陰性，能發(fā)酵多種糖類，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，如發(fā)酵葡萄糖、乳糖、水楊素、 麥芽糖、鼠李糖、七葉昔、蔗糖（遲發(fā)酵）、山梨醇、海藻糖、果糖，不發(fā)酵木糖、甘露醇、 肌醇、阿拉伯糖、側(cè)金盞花醇、棉子糖、衛(wèi)矛醇和纖維二糖，不利用枸檬酸鹽，40%旦汁不溶解，口引喋、硫化氫、尿素、明膠液化、硝酸鹽還原、賴氨酸、鳥氨酸均陰性，VP、甲基紅試驗(yàn)和精氨酸水解陽性。4、血清型根據(jù)菌體（O）抗原和鞭毛（H）抗原，將單增李氏菌分成 13個(gè)血清

8、型，分別是1/2a、1/2b、 1/2c、3a、3b、3c、4a、4b、4ab、4c、4d、4e和“7” 13個(gè)血清型。致病菌株的血清型一 般為 1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、1/2a 和 4b,后兩型尤多。5、抵抗力該菌對(duì)理化因素 抵抗力較強(qiáng)，在土壤、糞便、青儲(chǔ)飼料和干草內(nèi)能長期存活，對(duì)堿和鹽抵抗力強(qiáng)，60-70 C經(jīng)5-20min可殺死，70%酉精5min、2.5%石炭酸、2.5%氫氧化鈉、2.5%福爾 馬林20min可殺死此菌。該菌對(duì)青霉素、氨芳青霉素、四環(huán)素、磺胺均敏感。李斯特氏菌-致病性澳洲食物中毒引發(fā)高度關(guān)注單增李斯特菌進(jìn)入人體是否得病與菌量和宿主的年齡免疫狀態(tài)有關(guān)，

9、因?yàn)樵摼且环N細(xì)胞內(nèi)寄生菌，宿主對(duì)它的清除主要靠細(xì)胞免疫功能，因此，易感者為新生兒、孕婦、40歲以上的成人，免疫功能缺陷者。 潛伏期在感染后3-70天出現(xiàn)癥狀，健康成人可出現(xiàn)輕微類似流感癥狀，易感者突然發(fā)熱，劇烈頭痛、惡心、嘔吐、腹瀉、敗血癥、腦膜炎、孕婦出現(xiàn)流產(chǎn)。病性機(jī)理單增李氏菌的抗原結(jié)構(gòu)與毒力無關(guān)，它的致病性與毒力機(jī)理如下：1、寄生物介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)增生，使它附著及進(jìn)入腸細(xì)胞與巨噬細(xì)胞；2、抗活化的巨噬細(xì)胞，單增李氏菌有細(xì)菌性過氧化物歧化酶，使它能抗活化巨噬細(xì)胞內(nèi)的過氧物（為殺菌的毒性游離基團(tuán)）分解；3、溶血素，即李斯特桿菌溶血素O,可以從培養(yǎng)物上清液中獲得，為 SH活化的細(xì)胞溶素，有a和3

10、兩種，為毒力因子。臨床表現(xiàn)單核細(xì)胞增多性李斯特菌健康成人個(gè)體出現(xiàn)輕微類似流感癥狀，新生兒、孕婦、免疫缺陷患者表現(xiàn)為呼吸急促、嘔吐、出血性皮疹、化膿性結(jié)膜炎、發(fā)熱、抽搐、昏迷、自然流產(chǎn)、腦膜炎、敗血癥直至死亡?？刂茊卧隼钏固厥暇谝话銦峒庸ぬ幚碇心艽婊睿瑹崽幚硪褮缌烁?jìng)爭(zhēng)性細(xì)菌群，使單增李斯特氏菌在沒有競(jìng)爭(zhēng)的環(huán)境條件下易于存活，所以在食品加工中，中心溫度必須達(dá)到 70c持續(xù)2分鐘以上。單增李斯特氏菌在自然界中廣泛存在，所以即使產(chǎn)品已經(jīng)過熱 加工處理充分滅活了單增李斯特氏菌，但有可能造成產(chǎn)品的二次污染，因此蒸煮后防止二次污染是極為重要的。由于單增李斯特氏菌在 4c下仍然能生長繁殖，所以未加熱的冰箱

11、食品增加了食物中毒的危 險(xiǎn)。冰箱食品需加熱后再食用。李斯特氏菌-檢驗(yàn)1、增菌培養(yǎng)1.將未開封的測(cè)試片貯藏在 <=8 oC (46 oF)的環(huán)境下，并在包裝上標(biāo)示的有效期內(nèi)使用。 在高濕度的地方，最好在使用前將測(cè)試片回復(fù)到室溫。取回的樣品應(yīng)在 4c下處理、存放和 運(yùn)送，如果是冷凍樣品，則在檢驗(yàn)前要保持冷凍狀態(tài)。取25mL液體或25g半固體或固體樣品放入含有225mL無選擇性試劑增菌肉湯(EB)的均質(zhì)杯中進(jìn)行均質(zhì)，然后轉(zhuǎn)入三角瓶中，30c培養(yǎng)4h,加入選擇性試劑口丫咤黃素、蔡咤酮酸和放線菌酮，繼續(xù)培養(yǎng) 20h和44h.。2、分離共培養(yǎng)24h和48h后，取EB培養(yǎng)物分別在OX用口 LPM或加七

12、葉音/Fe3 LPM瓊脂平板上劃線。PALCAMO旨可替代LPM脂。將OXAD PALCAMP板置于35c培養(yǎng)24-48h , LPM平板在30 C培養(yǎng)24-48h。然后，把LPM平板放于解剖鏡載物臺(tái)上，以450角入射光從平板下面照射平板，通過目鏡垂直向下觀察尋找可疑菌落。李斯特氏菌在LPM平板上呈有光澤的蘭色或灰色。用已知陽性菌和陰性菌劃線的平板作對(duì)照。已開封的測(cè)試片，將開口反折，用膠帶封好。加入七葉音和Fe3的LPM平板不用斜射光系統(tǒng)，選擇可疑菌落的方法與在。*±選擇可疑菌落的方法相同。在OXA平板上李斯特氏菌菌落周圍有一個(gè)黑色環(huán)， 其它菌也可形成黑色環(huán)， 但形成時(shí)間要在兩天以上

13、。李斯特氏菌在 PALCA防口 OXA平板上的菌落特征相似。在PALCAM口 OXA或LPM平板上挑取5個(gè)或更多的典型菌落，分別劃線于 TSAYE¥板上以得 到更純、更典型的單個(gè)菌落。 食品檢驗(yàn)中在TSAY評(píng)板上純化是必須的，因?yàn)樵?PALCAM口OXA或LPM平板上分離菌落時(shí)可能沾有不可見的受抑微生物。挑取5個(gè)典型菌落的原因是一個(gè)樣品中可能分離到一種以上的李斯特氏菌。30CTSAY呼板培養(yǎng)24-48h ,如果不用于動(dòng)力觀察，也可在35 c培養(yǎng)。 3、鑒定步驟3.為防止暴露于潮濕的環(huán)境中，請(qǐng)不要冷藏已開封的測(cè)試片。將膠帶封好的測(cè)試片貯藏在 低溫干燥的地方，保持時(shí)間不超過1個(gè)月。請(qǐng)勿將

14、測(cè)試片放在溫度 > 25 oC (77 oF)和(或)相對(duì)濕度> 50%的環(huán)境中。TSAYE±ffi已知菌作對(duì)(1)觀察TSAY拜板通過斜射光觀察，尋找呈蘭灰至蘭色菌落。在照。(2)、從30c或更低溫度下培養(yǎng)的TSAYEFF板上挑取典型菌落做成濕玻片在油鏡下觀察。濕玻片用0.85%生理鹽水菌懸液制成。如果菌量太少，菌體黏附于載玻片上而呈現(xiàn)非運(yùn)動(dòng)性。李斯特氏菌是細(xì)短桿菌，可見輕微的旋轉(zhuǎn)及翻滾。與已知的李斯特氏菌的對(duì)照相比，球形、大的桿狀且快速泳動(dòng)的都不是李斯特氏菌。( 3)挑取典型菌落進(jìn)行過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)，李斯特氏菌呈過氧化氫酶陽性反應(yīng)。( 4) 取 16-24h 的培養(yǎng)物進(jìn)

15、行革蘭氏染色，李斯特氏菌呈革蘭氏陽性桿菌。但是陳舊培養(yǎng)物革蘭氏染色會(huì)發(fā)生變化，而且菌體可成球形。在染色過重的玻片上菌體有呈柵狀排列的趨勢(shì)，易誤認(rèn)為白喉菌而錯(cuò)判。4.用涂抹棒、海棉或其它采樣設(shè)備收集環(huán)境樣本。濕潤采樣設(shè)備的液體應(yīng)<=10 mL。濕潤劑可以是無菌水、緩沖蛋白胨水(Buffered Peptone Water, BPW，) 或中和緩沖液，如 Letheen肉湯或 Dey/Engley (DE) 中和肉湯。(5)挑取典型菌落接種于 TSBYEJ湯管中，35c培養(yǎng)24h用做糖類發(fā)酵和其它生化項(xiàng)目實(shí)驗(yàn)。TSBYEJ湯管在4c下可存放幾天，也可反復(fù)接種。(6)在TSAYE平板上挑取典型

16、菌落刺種到5%勺綿羊血或馬血瓊脂平板上，刺種時(shí)避免觸到平板底部和使瓊脂破裂，同時(shí)設(shè)陽性對(duì)照(單核細(xì)胞增生李斯特氏菌和綿羊李斯特氏菌)和陰性對(duì)照(英諾克李斯特氏菌)，35c培養(yǎng)48h。單核細(xì)胞增生李斯特氏菌呈窄小的3-溶血環(huán)。( 7)在明亮的光照下，觀察經(jīng)穿刺的血瓊脂平板，單核細(xì)胞增生李斯特氏菌和西爾李斯特氏菌圍繞穿刺點(diǎn)產(chǎn)生較清晰的3-溶血環(huán)，英諾克李斯特氏菌不產(chǎn)生溶血現(xiàn)象，而綿羊李斯特氏菌產(chǎn)生界限明顯的較大溶血環(huán)，在此不要試圖進(jìn)行種間的區(qū)分，但要記錄下溶血反應(yīng)的特征，CAM就驗(yàn)可區(qū)分它們間的溶血反應(yīng)。(8)硝酸鹽還原試驗(yàn)(選做)。用TSBYE肉湯培養(yǎng)物接種于硝酸鹽肉湯中，35c培養(yǎng)5天后，加入

17、0.2mL試劑A,再加入0.2mL試劑B,混合，出現(xiàn)紫紅色為陽性反應(yīng)，表明硝酸鹽 已被還原，如無顏色出現(xiàn)，在試管內(nèi)再加入少量鋅粉，放置 1h,如出現(xiàn)紫紅色，表明硝酸 鹽仍存在，未被細(xì)菌還原。只有默氏李斯特氏菌還原硝酸鹽，因此，從格氏李斯特氏菌中區(qū)分出默氏李斯特氏菌就必須進(jìn)行這唯一的試驗(yàn)。本試驗(yàn)還有一等效試驗(yàn)，即加入 0.2mL 試劑A后，再加入0.2mL試劑C,出現(xiàn)橙色表明硝酸鹽已被還原。如未出現(xiàn)顏色反應(yīng)，也加入少 量鋅粉，若出現(xiàn)橙色表明硝酸鹽未被還原。5.在無菌環(huán)境下在收集的樣品中添加5 mL, 20-30OC,滅過菌的緩沖蛋白月東水 (BPW)溶液。不要將PetrifilmEL測(cè)試片與 V

18、ermont培養(yǎng)基(UVM)、Fraser肉湯、李斯特菌增菌培養(yǎng)基(LEB)或緩沖李斯特菌增菌培養(yǎng)基 (BLEB)共用。(9)將TSBY嗡養(yǎng)物穿刺到SIM和MTMt管中，室溫培養(yǎng) 7天，每日觀察，李斯特氏菌呈 典型傘狀生長。在MTMfr傘狀生長更典型。同時(shí)，30 c的TSBYEg養(yǎng)物在油鏡下可見細(xì)菌作 翻轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)。（10）將TSAYE肉湯培養(yǎng)物分別接種于 0.5% （WN）葡萄糖、麥芽糖、七葉甘、甘露醇、鼠李糖、木糖發(fā)酵管內(nèi)（可選用倒立發(fā)酵管），35c培養(yǎng)7天，呈陽性反應(yīng)的李斯特氏菌產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，李斯特氏菌發(fā)酵鼠李糖和木糖的情況見下表。所有李斯特氏菌對(duì)葡萄糖、七葉昔、麥芽糖均能發(fā)酵，除格氏李斯特氏菌均不能發(fā)酵甘露醇。如果在OXAPALCAhM加七葉昔/Fe3的LPM分離平板上菌落色素很明顯，則七葉音試驗(yàn)可免做。4、血清學(xué)鑒定下表顯示了李斯特氏菌種間的血清學(xué)關(guān)系。種別血清型單增李斯特氏1/2A、1/2B、1/2C、3A、3B、3G4A、4AB4B、4C、4D、菌4E、“7”綿羊李斯特氏菌5