細菌生物膜技術(shù)

1、“生物膜技術(shù)”：關(guān)于微生物膜研究的一項多學(xué)科的綜述Esther Karunakaran·Joy MukherjeeBharathi Ramalingam·Catherine A.Biggs摘要 人們對生物膜形成的研究不是一個新的現(xiàn)象。生物膜的普遍存在及其意義和各種形成過程鼓勵人在這個領(lǐng)域已經(jīng)長達四十年的廣泛研究。在這篇評論當中，我們強調(diào)來自不同學(xué)科的技術(shù)。我們用這些技術(shù)已經(jīng)成功地描述了細胞外、細胞膜以及細胞內(nèi)部的成分。這些成分對了解生物膜的形成起著很重要的作用。為了減少對研究生物膜的復(fù)雜性，以前的研究者通常采用帶有學(xué)科性質(zhì)的具體方法單獨地去研究生物膜的不同組成成分。最近有些

2、研究主張綜合不同的技術(shù)對生物膜得到更加全面的認識，但是這種方法一直處于初期階段。為了獲得對生物膜形成過程全面的認識以及確切地闡述有效的生物膜控制方法，在接下來的十年里研究人員應(yīng)該意識到對生物膜的研究（換就話說，生物膜技術(shù)逐漸形成一門獨立學(xué)科），以及多學(xué)科綜合研究在這一領(lǐng)域的重要性。關(guān)鍵詞 生物膜 生物膜技術(shù) 細胞外的 細胞內(nèi)的 多學(xué)科的 細胞膜引言 在自然界，細菌以本身彼此粘連形成的組織或者以細胞膜粘連而形成固著的組織而存在。這種組織對所處環(huán)境的變化能夠做出反應(yīng)以及能夠適應(yīng)環(huán)境的變化，或者像多細胞組織一樣執(zhí)行特殊任務(wù)(Costerton et al. 1999, OTooleet al. 20

3、00; Hall-Stoodley and Stoodley 2002)。細菌的生物膜是指細胞和細胞外界聚合物接界以及細胞彼此之間粘結(jié)成的膜結(jié)構(gòu)。細胞膜是細胞在生長過程中細胞與細胞表面、細胞與細胞之間的聯(lián)系的介質(zhì)(Davey and OToole2000, OToole et al. 2000)。細菌聚集是一種彼此之間相互聯(lián)系的微生物形成一種穩(wěn)定的多細胞簇現(xiàn)象(Marshall1976)。因此這中聚合物也能成為生物膜，其表面物質(zhì)很少被定義(Daveyand OToole 2000)。細菌能形成多細胞組織的能力使它們彼此之間相互依附在一起，或者使它們形成一層膜。而細菌的這種行為在多種學(xué)科以及生物

4、技術(shù)、環(huán)境和醫(yī)藥工程等方面的應(yīng)用起著重大的作用，這對現(xiàn)代社會既有積極的作用也有消極的作用。在污水處理過程中不同聚合物的生成是微生物組織的重要應(yīng)用，如活動的沉淀絮狀物(Biggs and Lant 2000)、好氧型或厭氧型小顆粒(Adavet al. 2008; Skiadas et al. 2003)。微生物組織能提高分開治理水污染的效果。在釀造工藝中，酵母菌組織對整個釀造過程也有著積極的影響(Bauer et al. 2010)。生物膜在生物治理技術(shù)(Cohen 2002)和微生物燃料電池技術(shù)(Erable et al. 2010)上得到積極的應(yīng)用。在這些例子中，聚合物在懸浮液中成功地的生

5、成，或者細菌附著成膜結(jié)構(gòu)使生物膜技術(shù)更加具有實用意義。然而，相反的地，細菌的聚集和生物膜對工業(yè)過程和人類的健康都起著決定性的作用。例如，每年全球與處理生物污染有關(guān)的過程工程的花費多達幾億英鎊(Riedewald and Sexton2006)以及大約65%的醫(yī)源性感染與表面附著的微生物有關(guān)(Resch et al. 2005)。人們對生物形成的研究不是一種新的現(xiàn)象。人們對生物膜最早的報告應(yīng)追溯到80年以前(Henrici 1933, Zobell 1943)。人們在40年以前就發(fā)現(xiàn)生物膜在環(huán)境中普遍存在(Costerton 2007)。因此，自從20世紀70年代開始，人們對生物膜和基于生物膜的

6、技術(shù)的興趣穩(wěn)定的增加。實際上，在對特別以生物膜為標題的文章進行搜索中，我們發(fā)現(xiàn)從2000年到2010年期間人們已經(jīng)發(fā)表了5100篇文章，并且逐年穩(wěn)定地上升（見圖1）(Web of Science（wok.mimas.ac.uk) Science Citation Index Expanded,accessed 15/03/11)。 有幾種方法已經(jīng)被應(yīng)用于研究細菌細胞與細胞之間、細胞與細胞膜之間的聯(lián)系。在這篇評論中，我們強調(diào)關(guān)鍵技術(shù)（如顯微鏡學(xué)、光譜學(xué)、遺傳學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)）的應(yīng)用和從不同的學(xué)科（如表面和高分子科學(xué)、微生物學(xué)、生物化學(xué)）中找到能夠描述生物膜的細胞外、細胞表面以及細胞內(nèi)的組成成份。這

7、樣在提高生物膜的研究方面，多學(xué)科扮演著重要的角色，提倡把“生物膜技術(shù)”本身發(fā)展成為一門學(xué)科。盡管在對生物膜的研究中存在著潛在的限制，但是這篇評論還是強調(diào)這領(lǐng)域?qū)碛兄赜诙鄬W(xué)科共同研究的潛力。細胞外的環(huán)境是關(guān)鍵：細胞外面在發(fā)生什么事？形成生物膜的細胞的當前環(huán)境中存在稠密的蛋白質(zhì)，大部分研究都是把了解這些生物膜中的蛋白質(zhì)之間的聯(lián)系作為研究的對象。細胞外聚合物形成占生物膜容量的90%以上的基質(zhì)并且是是微生物的主要來源(Flemming and Wingender 2010)。雖然EPS的各種成份，如蛋白質(zhì)、糖類，DNA和膜囊已經(jīng)被證實(Flemming et al.2007)，由于一組未知的大分子

8、存在于細菌細胞外，EPS被稱為細胞的保護傘1992)。細胞外蛋白質(zhì)的形成需要消耗大量新陳代謝的產(chǎn)物；因此，EPS的存在對生物膜的形成和維持是至關(guān)重要的。通過細菌附著而產(chǎn)生的EPS確實已經(jīng)被譽為生物性的標記(Stoodley et al.2002)；在穩(wěn)定的基質(zhì)中生成的EPS成分之間的相互作用機制至今仍是一個豐富的研究領(lǐng)域。在過去的幾十年里，人們承擔的研究集中對這些生物聚合物的粘附和粘性特征的了解。在研究EPS的成分方面，人們使用的分析技術(shù)大體上分為兩種：無損技術(shù)和從以損壞的生物膜中提取EPS成分技術(shù)。激光共聚焦掃描顯微鏡（CLSM）技術(shù)是目前應(yīng)用最普遍、無損傷技術(shù)，它是被用來顯示生物膜中各種E

9、PS成分的時間分辨堆積。在應(yīng)用這項技術(shù)中，通過增加熒光探針EPS中的不同成分都能被肉眼識別。例如使用貼有異硫氰酸鹽標簽的熒光素對蛋白質(zhì)的定位，使用熒光增白劑或刀豆凝集素對糖類的定位。使用藍色核酸熒光染料標記的核酸通過激光共聚焦掃描顯微鏡能被顯現(xiàn)（for more details ofthe specific probes for eachcom- ponent, please refer to Adavet al. 2010)。激光共聚焦掃描顯微鏡對人們了解微觀領(lǐng)域中生物膜的空間組織和形成過程扮演著重要的角色(Lawrence et al. 2007)。傅里葉變化紅外光譜學(xué)是另外一種顯示生物膜

10、中EPS成分的時間分辨堆積的無損技術(shù)。在這項技術(shù)中，各種與EPS相關(guān)的官能團的堆積以及EPS聚合物構(gòu)象的轉(zhuǎn)變由在總反射系數(shù)衰減的晶體上直接生長的生物膜顯現(xiàn)出來(Delille et al. 2007; Quilèset al. 2010)。，也可以由喜歡在像不銹鋼或塑料方面表面生長的生物膜顯現(xiàn)出來(Pink et al. 2005; Bosch et al.2006; Cheung et al. 2007; Ojeda et al. 2008)。傅里葉變化紅外光譜學(xué)顯微鏡有助于對生物膜的微觀分析，包括EPS模型。盡管通過CLMS比通過傅里葉變化紅外光譜學(xué)反射顯微鏡更能詳細的觀測EPS

11、的空間分布，但是FTIR一直能夠提供有關(guān)EPS中官能團的有用信息，這些官能團在維持生物膜生長起到依附和黏著的作用(Geoghegan et al. 2008)。從斷裂的生物膜中提取的EPS的傅里葉變化紅外光學(xué)圖譜已經(jīng)繪制完成(Eboigbodin and Biggs 2008; Tapia et al. 2009; Liang et al.2010; Karunakaran and Biggs 2011)。將在一節(jié)進一步討論的拉曼光譜和表面增強拉曼光譜的使用已經(jīng)應(yīng)用于對EPS模型的分析(Ivleva et al. 2009)。盡管無損技術(shù)在原位顯現(xiàn)技術(shù)中被使用，更多共同采用的策略是去分析從不可

12、避免蛻變的生物膜中獲得的EPS。從對蛋白質(zhì)和糖類總量的比色測定以及蛋白質(zhì)與多糖的數(shù)量比計算的結(jié)果得出，通常起著支配作用的蛋白質(zhì)成分導(dǎo)致絮狀物和生物膜的穩(wěn)定而不是糖類(Sheng et al. 2010)。詳細的生物化學(xué)分析顯示多糖成分既能包括同聚多糖，例如沙門氏鼠傷寒菌內(nèi)的細胞質(zhì)膜(Zogaj et al. 2001)，也能包括充滿的雜聚多糖，例如銅綠假單胞菌內(nèi)的聚陰離子狀的藻酸(Evans and Linker1973; Wozniak et al. 2003)，大腸桿菌內(nèi)的結(jié)腸酸(Danese et al. 2000)，黃色葡萄球菌細胞內(nèi)附著的多糖(Götz 2002)。目前的了

13、解證實含有像二價陽離子(例如Ca2+ 、 Mg2+)的無機物的細胞外多聚物與金屬元素之間的作用集中在一個面上，這個面影響絮狀物和生物膜的物理性質(zhì)以及加強了它們的化學(xué)穩(wěn)定性(Biggs et al. 2001;Geoghegan et al. 2008; Körstgens et al. 2001)。生物膜外的蛋白質(zhì)扮演大量新陳代謝的角色。人們就生物膜內(nèi)的蛋白質(zhì)成分的重要性產(chǎn)生了一個觀點，這個觀點是EPS基質(zhì)可能起著有效的外消化系統(tǒng)的作用(Flemming and Wingender 2010)。多糖基質(zhì)內(nèi)的胞外酶非流動性的生物化學(xué)意義在銅綠假單胞生物膜內(nèi)的殘余硅酸鹽中的脂肪酶的保留的

14、案例被證實(Mayer et al. 1999)。生物膜中像肽酶、多糖酶和磷酸酯酶等酶的活性已經(jīng)被證實。這些酶提高了周圍環(huán)境中的營養(yǎng)物質(zhì)的生物利用率(Romani et al. 2008; Neu and Lawrence 2009)。蛋白質(zhì)成分與EPS中的多聚糖之間的相互作用也能具有結(jié)構(gòu)意義，例如，枯草芽孢桿菌生物膜中塔莎的分泌蛋白和胞外多聚糖(Branda et al. 2006)。通常，人們認為糖結(jié)合肽、外援凝集素的產(chǎn)生對生物膜結(jié)構(gòu)的完整性起著重要的作用(Neuand Lawrence 2009)。近來致力于對EPS的蛋白成分的詳細的生物化學(xué)分析的工作也能對研究維持枯草芽孢桿菌生物膜穩(wěn)定

15、結(jié)構(gòu)的糖結(jié)合肽作出一點小貢獻(Karunakaran and Biggs 2011)?；|(zhì)中聚合物之間通過靜電引力作用、范德華力相互作用、極性相互作用以及影響生物膜穩(wěn)定的氫鍵作的物理作用的概念也已經(jīng)被旋轉(zhuǎn)粘度計表明(Mayer et al. 1999)。通過稱作為聚合物架橋絮凝過程，人們也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)EPS分子在克服細菌與其表面之間的靜電排斥中扮演著重要的角色。因此，保證了細菌與其表面堅定的、不可逆的附著(Neu and Marshall 1990;Karunakaran and Biggs 2011)。這樣研究的結(jié)果已經(jīng)激勵人們?nèi)パ芯啃碌哪軠p少生物黏著的新表面涂層(Yuan et al. 200

16、9; Khoo et al. 2009)。除了物理化學(xué)特性之外，人們已經(jīng)詳細地研究了幾種微生物的EPS在基因水平上的生長過程的微控。例如，枯草芽孢桿菌中構(gòu)成胞外多聚糖的基質(zhì)是通過在一個單獨的操縱子上編碼的基因（eps 操縱子）以及一個胞外蛋白塔莎產(chǎn)生的(Kearns et al. 2005)。參與生產(chǎn)和加工塔莎的胞外聚合物操縱子和基因已經(jīng)被證實是在幾種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑控制下發(fā)揮作用的(Kearns et al.2005)。在適當?shù)貏h除突變體過程中，生物膜形成和成熟的減少可以通過肉眼觀察被證實(Kearns et al. 2005)。最近，EPS產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄控制也已經(jīng)被證實發(fā)生在枯草芽孢桿菌中(Irno

17、v and Winkler 2010)。同樣，人們一直在研究通過細胞內(nèi)循環(huán)診斷一磷酸鹽水平對EPS產(chǎn)生進行控制(Jenal and Malone2006)。一項對枯草芽孢桿菌組成的生物體的胞外蛋白的廣泛研究表明多效性調(diào)節(jié)劑PlcR在調(diào)節(jié)胞外蛋白的生長過程起著重要作用(Gohar et al. 2002; Gohar et al. 2008;Oosthuizen et al. 2002)。最終，人們對生物膜期望的作用，例如對環(huán)境消毒(Flemming and Wingender2010)、不期望的作用，例如表面生物依附和對熱交換器壁的隔離，直接與基質(zhì)成分吸附性有關(guān)。生物膜胞外酶的穩(wěn)定和集中有助生

18、物膜作為對生物異源物和組織蛋白降解的強大集團的功能(Flemmingand Wingender 2010)。另一方面，由生物膜金屬蛋白結(jié)合而成的不斷增加的金屬離子對表面的微生物腐蝕起著很大的作用(Neu and Lawrence 2009)。EPS聚合物的依數(shù)性(Keiding et al.2001)能降解阻礙熱量傳遞的熱交換器壁并且能降低工業(yè)生產(chǎn)效率(Flemming and Wingender 2001)。盡管對生物膜的外部環(huán)境（例如EPS）的研究有來自像顯微鏡學(xué)、光譜學(xué)、生物化學(xué)、表面科學(xué)和遺傳學(xué)的納米技術(shù)（見圖2）并且成功地為研究團體提供了豐富的信息，很少產(chǎn)生限制。沒有意識到提取技術(shù)的

19、限制和生物膜中EPS成分的完整恢復(fù)存在著挑戰(zhàn)?；|(zhì)聚合物容易受到細胞新陳代謝的影響，從而能夠改變穩(wěn)固生物膜的物理力。因此，當用于補充對細菌細胞表面和胞外多聚物的物理作用的了解的時候，對與細胞新陳代謝的增殖相結(jié)合的胞外多聚物的研究能夠?qū)ι锬ぶ蠩PS的相互作用、調(diào)節(jié)和控制有更好集中的了解。是關(guān)于表面嗎？膠質(zhì)物和生物膜的聯(lián)合依附在培養(yǎng)基中的共同體是生物膜的最簡單的形式。因此，對用于生物膜形成的培養(yǎng)基的要求吸引了不少從事多聚物和表面科學(xué)研究的人們?nèi)パ芯靠赡艽龠M或者阻礙生物膜形成的培養(yǎng)基的特性。類似于膠體粒子的細菌細胞的大表面積與體積之比形成了Derjaguin, Landau, Verwey and

20、 Overbeek (DLVO) 理論，這個理論支配著膠體粒子粘附成表面并且適用于新型細菌粘附在底層(Bos etal. 1999)。DLVO理論把膠體對表面的依著力解釋為長程力作用的的結(jié)果，例如靜電力的作用和粒子和表面之間的里夫施茨范德華力(Poortinga et al. 2002)。細菌和膠體的類似突出了描述細菌細胞表面以及在培養(yǎng)基的特征的重要性。因此，大量使用來自膠體或表面科學(xué)的豐富的技術(shù)，一些研究組已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了與膠體的穩(wěn)定和依著力有關(guān)的細菌細胞的特性。根據(jù)DLVO理論，膠體粒子的穩(wěn)定性受兩個因素的影響：（1）疏水性，（2）表面電荷。用膠體科學(xué)的方法去研究細菌依著和生物膜的形成，因此，在

21、這個領(lǐng)域，研究集中在描述細菌細胞表面的這兩個特性是不罕見的。Busscher 和Weerkamp（1987）認為在細菌依著方面疏水性能從接觸區(qū)脫水，能夠使脫水的部分直接通過短程作用相互影響(Busscher and Weerkamp 1987)。對干細菌接觸角的測量(Van Loosdrecht etal. 1987a)是一種決定細菌表面疏水性的常用的方法。這種方法比用微生物粘附的碳氫化合物的含量測量法(Rosenberg et al.1980)、疏水作用色譜法(Roettger and Ladisch 198 9)、兩相分配試驗和使用硫酸銨的鹽聚集試驗(Rozgonyi et al. 198

22、5)之類的方法更為常用。Van Loosdrecht et al. (1987a)報道細胞表面疏水性和細胞對疏水基粘附性之間線性正相關(guān)。Van der Meiet al. (1998)也曾用過接觸角測量法去研究許多不同種類的細菌的細胞表面脫水性，并且斷定表面疏水性對每個菌株是唯一的和依賴于菌株的生長期和生長率。這個結(jié)論表明控制細菌細胞之間的粘附的潛在相互作用力不是常量并且能夠改變對生物活性的依賴。Allison et al. (1990a, b)也曾發(fā)現(xiàn)細胞表面疏水性和生物膜之間的聯(lián)系，即疏水性的下降導(dǎo)致銅綠假單胞生物膜菌和大腸桿菌生物膜的釋放。Van Loosdrecht et al. (1

23、987b)認識到當細菌的表面電荷也能被包括在粘附模型中，對細菌粘附力的精確預(yù)測詩可以做到的。細菌細胞表面的電荷通常由測量電脈遷移率和推斷電位所決定(Wilson et al. 2001; Hong andBrown 2008)，它們是水溶液和接到細菌細胞上流體靜電層之間界面的電勢(Klodzinska et al. 2010)。人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)像細胞表面疏水性一樣，細胞表面的電荷因不同生長階段(Eboigbodin et al.2005; Walker et al. 2005)、細胞代謝(Hong andBrown 2010)以及基因的差異(Eboigbodin et al.2006)的生物活性不

24、同而不同。細胞表面的電荷的變化決定了細胞聚集的能力(Marshall 1976;Rijnaarts et al. 1995; Eboigbodin et al. 2007)。采用譬如接觸角和電泳遷移遷移的技術(shù)能測定細菌群體的平均膠體性質(zhì)。然而細菌細胞表面的獨特生物成分導(dǎo)致這些膠體性質(zhì)的原因，這些獨特生物成分的反過來能控制導(dǎo)致粘附性的相互作用類型(Marshall 1976; Rijnaarts etal. 1995; Torimura et al. 1999; Eboigbodin et al. 2006; Hongand Brown 2008; Ojeda et al. 2008)。因此，人

25、們在生物膜研究領(lǐng)域已經(jīng)取得了使用分析化學(xué)技術(shù)方面的進展。例如，使用紅外和拉曼光譜學(xué)技術(shù)(Mukherjee et al. 2011)以及最先進的X射線光電子光譜學(xué)技術(shù)(Yala et al. 2010)描述相互黏著的生物細胞的表面化學(xué)性質(zhì)。紅外光譜學(xué)技術(shù)在微生物領(lǐng)域應(yīng)用了40多年(Heber et al. 1952;Norris 1959)。FTIR(傅里葉變換紅外光譜學(xué))被廣泛應(yīng)用微生物生態(tài)學(xué)研究和生物膜研究(如 Bosch et al. 2006; Ojeda et al. 2008;Mukherjee et al. 2011)。如前面提到的，使用FTIR為了生物膜的研究去描述化學(xué)官能團的

26、有點是生物膜可以被無損地、直接地、在線地和實時地觀察。由于生物膜代表著一個極其復(fù)雜的系統(tǒng)，許多不同的信號產(chǎn)生于胞外聚合物、細胞膜和細胞質(zhì)的分子振動，它們可以對整體的RTIR光譜也有影響。RTIR光譜能夠顯示生物大分子的特征函數(shù)以及生物膜樣品和它們的浮游生物配對物的比較。這些浮游生物配對物往往會顯示與多糖和蛋白質(zhì)相關(guān)的相關(guān)的官能團的變化(Schmitt and Flemming 1998; Bosch et al.2006; Ojeda et al. 2008; Mukherjee et al. 2011)。使用FTIR的主要缺點是樣品在分析之前是干燥的。拉曼光譜學(xué)技術(shù)也能為樣品的的化學(xué)成分提供

27、信息，但是必須在水和環(huán)境中。因此，它比FTIR有優(yōu)勢并且從而被廣泛地用于生物分析(study of tissues, biofluidsand bacterial cells) (Beier and Berger 2009; Wagneret al. 2009; Carmona et al. 1997; Choo-Smith et al. 2001)。拉曼光譜學(xué)技術(shù)和表面增強拉曼光譜技術(shù)的應(yīng)用已經(jīng)能夠分析水合生物膜樣品，包括EPS的成分(Hudson and Chumanov 2009, Ivleva et al. 2009)以及嵌入在EPS內(nèi)的微觀組織(Andrews et al. 2010

28、; Schwartz et al. 2009)。CLMS與拉曼光譜學(xué)的聯(lián)合使用已經(jīng)能夠?qū)Σ煌N類的自由生長的生物膜的形成進行原位比較(例如，野生型銅綠假單胞菌和它的突變體(Sandt et al. 2009)以及能夠區(qū)分不同種類的生長在生物膜上細菌（例如，血鏈球菌和突變鏈球菌之間(Beier et al. 2010)）CLMS與拉曼光譜學(xué)在水合環(huán)境下聯(lián)合使用對描述多種物種生物膜的表面有了很好的保證。關(guān)于細菌細胞表面的分子成分的化學(xué)信息能通過在原子級上使用X射線光電子光譜學(xué)技術(shù)(XPS)獲取(Rouxhet et al. 1994; van der Mei et al. 2000)。各種原子（例

29、如，碳原子、氧原子、氮原子和磷原子）的組成百分比以及它們在細胞表面的鍵合環(huán)境都通使用XPS分析出來。一些研究已經(jīng)集中在將細胞表面成分的原子比例與細菌和酵母菌的細胞表面的物理化學(xué)性能聯(lián)系在一起(Hamadiet al. 2008; Ahimou et al. 2007; van der Mei et al. 2000;Amory et al. 1988)。某些研究已經(jīng)使用XPS來分析環(huán)境樣(Pastuszka et al. 2005)本或者分析在改變培養(yǎng)條件的情況下細胞表面的改變(Dufrêne and Rouxhet 1996; Herben etal. 1990)。上面提及到的研究

30、目前僅僅在浮游細菌上完成，但是對建立理化特性的技術(shù)與XPS之間的相關(guān)性極為有用，這里用的用的細胞是在分析之需要凍干。幾乎非常少的研究試圖將XPS分析與附著成面的浮游細胞的細胞表面物理化學(xué)性質(zhì)聯(lián)系在一起(Cerca et al. 2005; Dufrene et al. 1996; Denyer et al. 1990;Mozes et al. 1989)。在這些研究中，XPS分析已經(jīng)可能對細胞表面分子進行識別，包括對初始粘附的表面進行識別。Cerca et al.(2005)意識到初始粘附與隨后生物膜的生長一直不存在相關(guān)聯(lián)系并且斷定細胞表面附著的高分子介質(zhì)可能與介導(dǎo)細胞細胞的相互作用不同。同時

31、XPS在識別細胞表面高分子成分的變化方面存在著潛力，將來的研究應(yīng)該集中在將表面附著細胞和浮游細胞進行比較從而了解生物膜形成過程中的生理變化與細胞表面變化的相關(guān)性。聯(lián)合分析化學(xué)和用于描述細菌描述表面特性的膠體方法的應(yīng)用已經(jīng)鼓勵多學(xué)科的研究活動（見圖3）。然而影響細胞表面的特殊生物分子的細胞內(nèi)的活動（例如基因表達調(diào)節(jié)）與導(dǎo)致附著的化學(xué)功能團的觀察到的變化之間的聯(lián)系需要將來去調(diào)查研究。就表面蛋白（見下一節(jié)）而言，這是值得更多關(guān)注的，但是通過特定的化學(xué)分析將細胞表面的特殊指紋與導(dǎo)致高分子（它是形成指紋的原因）產(chǎn)生的生物機制連接在一起目前沒有看到。圖3此外，最近Mukherjee et al. (201

32、1)、Karunakaran 和 Biggs (2011)已經(jīng)表明附著細胞與自由浮動細胞的細胞表面特性存在差別。因此，當推斷或預(yù)測由生物膜的形成和維持引起的相互作用時，細菌的膠體特性應(yīng)該進一步把這些變化考慮進去。細胞內(nèi)的活動怎樣呢？畢竟它也是生物學(xué)過程在微生物學(xué)家的帶領(lǐng)下，人們對識別基因和蛋白質(zhì)生物學(xué)的基礎(chǔ)環(huán)境的適應(yīng)策略如生物膜形成的廣泛研究在近幾十年里已經(jīng)完成。現(xiàn)在被人們廣泛接受的是有生物膜的細胞生理學(xué)與自由浮動浮游增長方式的細胞生理學(xué)是截然不同的。基因組測序技術(shù)和如通過芯片對基因組進行分析技術(shù)的利用性能使得生物膜研究領(lǐng)域超越更多傳統(tǒng)的基于顯微鏡的微生物學(xué)并且能夠?qū)毎x進行詳細的分析。D

33、NA芯片技術(shù)已經(jīng)被用于識別大腸桿菌生物膜的一些現(xiàn)在比較適用的整個基因表達研究的整個基因表達譜(see areview by Wood 2009)。有關(guān)銅綠假單胞菌生物膜DNA芯片的研究已經(jīng)表明少量的基因被差異性表達(Stoodley et al. 2002;Whiteley et al. 2001)。對附著、自動聚集以及一些新的基因簇的基因編碼傾向于對對生物膜細胞的高度表達或者誘導(dǎo)后過渡到生物膜生長(Schembri et al. 2003)。與基因芯片檢測技術(shù)平行，轉(zhuǎn)錄分析技術(shù)已經(jīng)被用于研究生物膜的形成。這項技術(shù)被用于研究生物膜生成過程中的生理機能、表型、運動、代謝活性和細胞間的信息傳遞。這

34、項技術(shù)中使用的純培養(yǎng)菌有大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、十細菌、綠膿桿菌和霍亂弧菌(Beenken et al. 2004; Beloinet al. 2004; Ren et al. 2004; De Souza et al. 2004; Whiteleyet al. 2001; Moorthy and Watnick 2005)。然而，沒有出現(xiàn)具體的生物膜的形成全球模式。雖然如此，在全球基因表達譜中識別的特殊基因角色的確認有可能用于有針對性的遺傳變異研究。因此，基因操作對了解和識別與生物膜形成和附著有關(guān)的特性至關(guān)重要(Stoodley et al. 2002; Hall-Stoodley et a

35、l. 2004; Beloin andGhigo 2005)。例如，OToole et al(2000)用CRC突變銅綠假單胞菌研究生物膜的發(fā)展。csrA基因（這是一個用于碳源代謝多效調(diào)控蛋白）的中斷增加了生物膜的形成。同時，這篇評論的目的不是詳細描述所有的導(dǎo)致增強或減弱生物膜形成的基因突變，接下來的幾段將進一步給出一些例子。Prigent-Combaret et al. (2000)通過對影響大腸桿菌生物膜的curli轉(zhuǎn)錄的積極和消極調(diào)節(jié)發(fā)現(xiàn)了兩個自動調(diào)節(jié)系統(tǒng)，OmpR/EnvZ（EnvZ DNA結(jié)合反應(yīng)調(diào)節(jié)器）和CpxR/CpxA（CpxA DNA結(jié)合反應(yīng)調(diào)節(jié)器）(Stoodley et

36、al. 2002)。Barrios et al. (2006)研究發(fā)現(xiàn)大腸桿菌中的Hha(滲透脅迫調(diào)節(jié)器)和YbaJ(假設(shè)蛋白)由于缺失的原因，通過減少生物膜的質(zhì)量來調(diào)節(jié)生物膜。Hha 和 YbaJ的缺失恢復(fù)了細胞的流動性并且減少了細胞的集成。Domka et al. (2006)完成的研究表明大腸桿菌中的yceP(假設(shè)蛋白)和yliH （通過吲哚運輸調(diào)節(jié)對生物膜形成的抑制）有助于生物膜的形成。Sheludko et al. (2008)研究了固氮螺菌生物膜上脂多糖(LPS)和卡爾科弗盧爾結(jié)合多糖(CBPS)合成中突變的影響。固氮螺菌Sp245生物膜的厚度和抗原性以及在LPS和CBPS合成缺失

37、的突變表明在酸性LpsI合成中缺失的突變在親水性表面生成比較厚的生物膜，并且這種在細菌的親水性表面生成的、不能合成CBPS生物膜是不太明顯的。這項研究斷定LPS結(jié)構(gòu)中一個根本性的改變是與親水性和疏水性表面上的相關(guān)突變體的生物膜形成活動相關(guān)的。它也能提供了表面高分子（如LPS）和附著物之間的聯(lián)系并且是與上一節(jié)提到的膠體研究的聯(lián)合起來去研究生物活性與表面性質(zhì)的聯(lián)系的選擇物。細菌密度感知信號系統(tǒng)中特定的基因突變已經(jīng)導(dǎo)致生物膜形成的改變。當描述空腸彎曲菌生物膜時，Reeser etal. (2007)發(fā)現(xiàn)最大生物膜的形成所需要空腸彎曲菌彎曲突變的群體感應(yīng)在它們形成生物膜能力方面與野生菌相比明顯在減少。

38、Huang et al. (2009)的研究也已經(jīng)報道突變鏈球菌生物膜形成包括細菌依賴彎曲密度感知信號系統(tǒng)。通過掃描電子顯微鏡、光顯微鏡和熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)在鏈球菌突變中，變形基因的淘汰被表明損害生物膜生長(Sztajer et al. 2008)。轉(zhuǎn)運蛋白YdgG的缺失減少了細胞外以及提高了細胞內(nèi)群體感應(yīng)分子自動誘導(dǎo)物2 (AI2).的濃度。由于YdgG加強了AI-2的轉(zhuǎn)運，YdgG的缺失導(dǎo)致生物膜厚度和流動的細胞的數(shù)量減少(Herzberg et al. 2006)。通常，細菌彼此之間是通過使用化學(xué)信號分子或自動誘導(dǎo)劑進行交流（AI）。原核微生物例如革蘭氏陰性菌產(chǎn)生?；呓z氨酸內(nèi)酯（AHL

39、）作為信號分子以及革蘭氏陽性細菌產(chǎn)生寡肽作為信號分子(Miller and Bassler 2001)。細菌能對由同種細菌以及其它種類的細菌產(chǎn)生的大量的AI作出反應(yīng)，AI為內(nèi)部和外部物種交流提供了基礎(chǔ)。有LuxS蛋白產(chǎn)生的自動誘導(dǎo)劑-2信號（AI-2）介導(dǎo)革蘭氏陰性菌與物革蘭氏陽性菌種間的交流。作為遺傳反應(yīng)，群體感應(yīng)細菌的信息交流通過AHL和AI-2系統(tǒng)與生物膜的生成產(chǎn)生聯(lián)系(Costerton et al. 1999; Bassler 2002; Simoes et al. 2007)。除了AI-2控制生物膜的生成之外，AHL介導(dǎo)基因的表達表明物種（如銅綠假單胞菌(De Kievit et

40、al. 2001)、鼻疽菌(Brackman et al.2009)）之間控制生物膜的生成以及在自然環(huán)境樣本（如埋石灰?guī)r和水回收系統(tǒng)）中控制生物膜的生成(McLeanet al. 1997; Hu et al. 2003)。遺傳分析為人們提供了關(guān)于細菌適應(yīng)環(huán)境改變的潛力、生物膜的形成以及能顯示哪些基因已經(jīng)在過程中轉(zhuǎn)錄的mRNA的測定（通過DNA微陣列）信息。另一方面，蛋白質(zhì)成分的分析為人們提供了關(guān)于樣本在精確的時候發(fā)生的新陳代謝活動的信息。蛋白質(zhì)組學(xué)能夠同時在蛋白質(zhì)水平上對全部基因的表達進行分析，并且為研究生物系統(tǒng)提供了關(guān)鍵的策略(Hatzimanikatisand Lee 1999)。因此，

41、蛋白質(zhì)對于研究觀察發(fā)生在生物形成過程中的生理變化提供了有力的工具。 使用半定量二維凝膠電泳的蛋白質(zhì)組學(xué)研究已經(jīng)比較生物膜和自由浮游生物的胞外蛋白質(zhì)圖譜并且表明不同在包括代謝、運輸和調(diào)節(jié)過程中蛋白質(zhì)存在明顯的區(qū)別(Otto et al.2001; Sauer and Camper 2001; Steyn et al. 2001;Oosthuizen et al. 2002; Trémoulet et al. 2002; Vilain etal. 2004a, b; Welin et al. 2003; Resch et al. 2005; van Alenet al. 2010)。在蛋

42、白質(zhì)分析中進步也已經(jīng)產(chǎn)生了基于非凝膠的定量技術(shù)的問世，例如相對和絕對定量的同位素標記技術(shù)（iTRAQ）。Mukherjee et al. (2011) and Pham etal. (2010)都用iTRAQ技術(shù)去確定大腸桿菌的生物膜和浮游細胞和牙周病原菌Tannerella forsythia之間的蛋白質(zhì)數(shù)量。對定量蛋白質(zhì)組學(xué)的進一步分析有可能使用各種統(tǒng)計技術(shù)將蛋白質(zhì)表達與生物膜形成中潛在的代謝途徑聯(lián)系在一起(Mukherjee et al. 2011)。除了細胞質(zhì)可溶性蛋白質(zhì)，通過外膜蛋白質(zhì)的雙向凝膠電脈對蛋白質(zhì)的研究已經(jīng)完成，例如1型傘端大腸桿菌在粘附形成生物表面期間外膜蛋白的成分發(fā)生了

43、明顯的變化(Resch et al.2005; Otto et al. 2001)。Pham et al. (2010)使用定量的非凝膠為基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)組技術(shù)也發(fā)現(xiàn)生物膜細胞中的外膜蛋白質(zhì)的表達增強了。全球基因組和蛋白質(zhì)組學(xué)研究對于浮游和生物膜表型的基因或蛋白質(zhì)表達以及生物膜形成過程中基因突變菌株的調(diào)查極為有用（見圖4），然而，在這一領(lǐng)域的研究存在著價值，這些研究通常受到測序微生物的限制，尤其是銅綠假單胞菌和大腸桿菌，并且在生物膜形成過程中還沒有一個獨特的基因組能對表型變化負責。因此使得發(fā)展完全基于基因表達的策略比較困難。圖4觀察細菌從游離態(tài)到形成生物膜過程中發(fā)生的變化的研究已經(jīng)完成。然而，人們

44、因該更加努力的去發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)生物變化的影響以及細菌表面的物理化學(xué)特性的影響，這最終對生物膜的形成產(chǎn)生影響。生物膜各方面的全面的蛋白質(zhì)組分析能夠為生物學(xué)過程（胞內(nèi)蛋白質(zhì)），特殊的表面功能團（表面和/或膜蛋白）和周圍胞外多聚合物（EPS中的蛋白質(zhì)）的聯(lián)系提供洞察力，但是，直到現(xiàn)在蛋白質(zhì)的研究重點仍然聚集在浮游細胞上，而不是直接在生物膜細胞上或者僅僅部分生物圖片上。結(jié)語生物技術(shù)在工業(yè)上的巨大潛力、生物膜在傳染病以及其它疾病上普遍存在和研究生物膜的復(fù)雜性已經(jīng)在研究團隊中激發(fā)了廣大的興趣。為了減少研究生物膜的復(fù)雜性，目前的研究已經(jīng)采取了基于部分的研究并且在這樣做的過程中人們已經(jīng)獲得大量的關(guān)于生物膜形成的各

45、方面的知識，例如胞外聚合物的作用，環(huán)境條件的影響、基板性能和在生物膜形成過程中的分子控制。來自各種學(xué)科的技術(shù)創(chuàng)造性的應(yīng)用驗證了生物膜的形成現(xiàn)象，并且?guī)砹硕鄬W(xué)科共同研究巨大的潛力。盡管在基于部分研究生物膜形成的方法中，多學(xué)科的聯(lián)合已經(jīng)激勵人們?nèi)パ芯繚撛诘纳锬た刂撇呗裕瑢ｉT設(shè)計適合應(yīng)用需要的生物膜的目的是不會成功的。為了成功控制生物膜的形成，研究人員需要意識到生物膜的研究，例如，生物技術(shù)，已經(jīng)演變成了一門獨立的學(xué)科（見圖5）以及各種學(xué)科和研究的視野相互合作是至關(guān)重要的。謝鳴 這些作者希望對英國工程與物理科學(xué)研究委員會（EPSRC）為Karunakaran提供比格斯高級研究金(EP/E05355

46、6/01)以及進一步的計劃援助(EP/E053556/01和 EP/E036252/1)比并且設(shè)菲爾德大學(xué)為Karunakaran 和 Ramalingam提供獎學(xué)金表示感謝。這些作者聲明他們沒有利益沖突。參考文獻Adav SS, Lee DJ, Show KY, Tay JH (2008) Aerobic granular sludge:recent advances. Biotechnol Adv 26:411423Adav SS, Lin JCT, Yang Z, Whiteley CG, Lee DJ, Peng XF, ZhangZP (2010) Stereological ass

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