藥物毒理學(xué)實驗指導(dǎo)

1、藥物毒理學(xué)實驗指導(dǎo)南方醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院實驗中心二0一0年八月目 錄實驗一、藥物急性毒性實驗（LD50測定）實驗二、急性肺損傷實驗實驗三、藥物免疫毒性試驗實驗四、小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗實驗五、小鼠精子畸形實驗實驗六、藥物生殖毒性實驗實驗一 急性毒性試驗鹽酸二甲弗林（回蘇靈）LD50測定一、實驗?zāi)康?化學(xué)物急性毒性試驗是研究化學(xué)物毒性效應(yīng)的基本試驗。本實驗的目的是學(xué)習(xí)急性毒性試驗的實驗設(shè)計、實驗原理和實驗操作方法。二、基本原理選擇健康的實驗動物，根據(jù)體重按隨機分組的方法，依據(jù)LD50計算的設(shè)計原料則將動物分成數(shù)個染毒組。一次或24h內(nèi)多次給予受試物后，觀察動物所產(chǎn)生的急性毒性反應(yīng)及其嚴(yán)重程度，中毒死亡

2、的情況等，根據(jù)各組動物死亡數(shù)計算半數(shù)致死量（LD50）。據(jù)此分析受試物毒性反應(yīng)與劑量的關(guān)系，并根據(jù)LD50值對化學(xué)物進(jìn)行毒性分級。三、實驗材料1、器材 1ml注射器、燒杯、電子天平、苦味酸、鑷子、剪刀、酒精棉球等。2、藥品 0.4回蘇靈注射液（經(jīng)預(yù)試驗后按比例稀釋）。3、動物 健康成年小白鼠若干只，體重18-22g，雌雄各半。四、實驗方法1、預(yù)試驗 （1）探索劑量范圍：先找出100%與0%的致死量為實驗的上下限劑量，即Dmax和Dmin。取動物若干，每4只一組，按估計量給藥，如出現(xiàn)4/4死亡時，下一組劑量降低，當(dāng)出現(xiàn)3/4死亡時，則上一劑量為Dmax；如降低一劑量出現(xiàn)的死亡率2/4或1/4時，

3、應(yīng)考慮到4/4死亡劑量組在正式實驗時可能出現(xiàn)死亡率低于70%，為慎重起見可將4/4死亡劑量乘以1.4倍，作為Dmax。同法找出Dmin。（2）確定合適的劑量分組方案：組數(shù)（n）以5-8組為宜，根據(jù)下面公式計算組間劑量公比r。r=1/各組劑量分別Dmax、(Dmax) r、(Dmax)r2、(Dmax)r3。2、正式試驗 （1）動物的稱重、編號和分組： 每組10只動物（雌雄各半），隨機分組和用苦味酸編號。（2）受試物的配制： 根據(jù)預(yù)試驗得出Dmin為4.0mg/kg，Dmax為8.0mg/kg，分為5個劑量組，根據(jù)公式計算r»0.85。配制時取第一個劑量組17ml加生理鹽水3.0ml（

4、按1：0.85稀釋）作為第二個劑量組，依此類推配制其它劑量組。（3）給藥： 本次試驗是用腹腔注射方法給藥，0.2ml/10g體重。（4）觀察：給完受試物后即刻觀察和記錄30min內(nèi)動物反應(yīng)，包括一般活動情況、中毒體征、死亡前的特征、死亡動物數(shù)、死亡時間。五、結(jié)果記錄1. 描述動物中毒和死亡反應(yīng)的特征。2. 參照下表和改良寇氏法的計算方法，計算回蘇靈的LD50。 表1. 急性毒性實驗結(jié)果列表劑量（mg/kg）對數(shù)劑量（X）動物數(shù) （只）死亡數(shù)（只）死亡率（p）存活率（q）p´q4.184.915.786.808.000.6210.6910.7620.8320.9031010101010

5、02571000.20.50.71.01.00.80.50.3000.160.250.210i=0.07p=2.4計算公式如下：Lg(LD50)= Xmi（p0.5）Xm=最大劑量對數(shù)值P=動物死亡率p=各組死亡率的總和i=相鄰兩組劑量比值的對數(shù)（高劑量做分子）將數(shù)據(jù)代入公式，經(jīng)計算得回蘇靈注射液LD50=5.87mg/kg實驗二 急性肺損傷實驗一、實驗?zāi)康耐ㄟ^比較染毒動物與正常動物肺臟重量和形態(tài)的變化，學(xué)習(xí)評價外源性化學(xué)物急性肺損傷的基本方法。二、基本原理肺臟組織結(jié)構(gòu)疏松，血流豐富，化合物引起的急性肺損傷以滲出、水腫和出血為主，通過比較肺形態(tài)、肺重量和肺灌洗液的變化，可以反應(yīng)急性肺損傷的嚴(yán)重

6、程度。三、實驗材料1、器材 1ml注射器、5ml試管，電子天平、苦味酸、鑷子、剪刀、止血鉗、硫酸紙等。2、藥品 生理鹽水、含4油酸和16%二甲基亞砜(DMSO)的生理鹽水混懸液。3、動物 健康小白鼠，體重18-22g，雌雄各半。四、實驗方法1給藥方法動物稱重，樣品用注射器反復(fù)抽吸混勻后，以0.1ml/10g體重尾靜脈注射。對照組尾靜脈注射等劑量生理鹽水。2.觀察（1）小鼠尾靜脈注射油酸后，觀察一般狀況、呼吸頻率、呼吸深度等變化。（2）肺形態(tài)和肺重量變化：注射后30分鐘，小鼠處死，剖開胸腔,剪開頸部皮膚,分離皮下組織,于甲狀軟骨下緣夾住氣管后分離出肺臟，觀察油酸組和對照組的小鼠肺臟外觀形態(tài)變化，

7、如腫脹、充血、滲出等，并稱取肺重量。（3）肺灌洗：從氣管注入1ml生理鹽水，回抽的灌洗液注入刻度試管內(nèi)，重復(fù)2次，觀察灌洗液的外觀和體積。五、結(jié)果記錄1. 統(tǒng)計各組計算肺灌洗液容積的。2. 根據(jù)以下公式計算肺系數(shù)：肺系數(shù)=肺重/體重×100%，并計算其。3. 將肺系數(shù)和肺灌洗液容積的計算結(jié)果，以及肺臟和灌洗液的外觀變化填入下表。肺系數(shù)和灌洗液容積進(jìn)行組間t檢驗。組別肺臟肺灌洗液（BALF）外觀肺系數(shù)外觀容積 (ml)對照組油酸組t值P實驗三 藥物免疫毒性試驗（環(huán)磷酰胺對小鼠免疫器官重量的影響）一、實驗?zāi)康?通過比較染毒動物與正常對照動物胸腺和脾臟的大小和重量差異，學(xué)習(xí)評價外源性化學(xué)物

8、對動物免疫器官毒性的基本方法。二、基本原理 環(huán)磷酰胺是影響DNA結(jié)構(gòu)與功能的周期非特異性抗腫瘤藥，可阻礙DNA的復(fù)制，破壞細(xì)胞的有絲分裂，對快速增殖的細(xì)胞殺滅作用尤為突出。因此，環(huán)磷酰胺可顯著抑制動物免疫器官的細(xì)胞增殖，引起免疫器官重量減輕。三、實驗材料1、器材 1ml注射器、手術(shù)剪、眼科剪、眼科鑷、電子天平、苦味酸、止血鉗、硫酸紙等。2、藥品 環(huán)磷酰胺注射液、生理鹽水。3、動物 昆明種小白鼠，體重18-22克，雌雄各半。四、實驗方法1、染毒 取昆明種小白鼠20只，雌雄各10只，隨機分成實驗組和對照組，每組雌雄各半。實驗組腹腔注射1環(huán)磷酰胺注射液0.1ml/10g（100mg/kg）體重，對照

9、組腹腔注射生理鹽水0.1ml/10g體重，每日一次，連續(xù)給藥四次。2、標(biāo)本的采集 最后一次注射24小時內(nèi)，頸椎脫臼處死動物，稱體重。將小鼠仰臥固定于解剖板上，沿腹中線剪開腹部，在左上腹部取出脾臟; 取胸腺時，應(yīng)在胸部正中偏開約0.5cm處剪開胸壁，以避免剪壞胸腺。分離胸腺和脾臟時，應(yīng)將其周圍脂肪等組織清理干凈，并立即稱重。五、結(jié)果記錄 根據(jù)公式：胸腺系數(shù)=小鼠胸腺質(zhì)量（mg）/小鼠體質(zhì)量（g）, 脾臟系數(shù)=小鼠脾臟質(zhì)量（mg）/小鼠體質(zhì)量（g），分別計算兩組動物的胸腺系數(shù)和脾臟系數(shù)()，填入下表，進(jìn)行組間t檢驗。分析實驗結(jié)果，寫出實驗報告。表一，環(huán)磷酰胺對小鼠胸腺和脾臟重量的影響（X±

10、;SD，n=10）胸腺系數(shù)脾臟系數(shù)對照組實驗組t值P實驗四 小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗一、實驗?zāi)康?通過本次實驗，學(xué)習(xí)和了解小鼠骨髓多染紅細(xì)胞（PCE）微核實驗基本方法。二、基本原理 微核是細(xì)胞內(nèi)染色體斷裂或紡錘絲受到各種理化因素的影響，在細(xì)胞有絲分裂后滯留在細(xì)胞核外的染色體物質(zhì)。微核大小相當(dāng)于細(xì)胞直徑的1/201/5，呈圓形或杏仁狀，其顏色與細(xì)胞核一致，在細(xì)胞中可以出現(xiàn)一個或多個。微核試驗是用于染色體損傷和干擾細(xì)胞有絲分裂的化學(xué)毒物的快速檢驗方法。各種類型的骨髓細(xì)胞都可形成微核，但有核細(xì)胞的胞質(zhì)少，微核與正常核葉及核的突起難以鑒別。嗜多染紅細(xì)胞是分裂后期的紅細(xì)胞由幼年發(fā)展為成熟紅細(xì)胞的一個階段，此

11、時紅細(xì)胞的主核已排出，姬姆薩染色呈灰藍(lán)色，成熟紅細(xì)胞呈淡桔紅色。骨髓中嗜多染紅細(xì)胞數(shù)量充足，微核容易辨認(rèn)，因此，骨髓中嗜多染紅細(xì)胞成為微核試驗的首選細(xì)胞群。三、實驗材料1. 器材 手術(shù)剪、鑷子、彎止血鉗、紗布、注射器、載玻片、計數(shù)器、電吹風(fēng)、帶油鏡頭顯微鏡、100ml燒杯、染色缸等。藥品與試劑 用生理鹽水配制成1環(huán)磷酰胺注射液（10mg/ml）、生理鹽水、小牛血清、Giemsa儲備液、pH6.8的磷酸鹽緩沖液、甲醇。3動物 小鼠體重1822g，每組10只，雌雄各半。四、實驗方法1. 染毒 給小鼠腹腔注射1環(huán)磷酰胺，每0.1ml/10g體重（100mg/kg），每日一次，連續(xù)給藥兩次。注射生理鹽

12、水為陰性對照組。2骨髓液的制備和涂片 在最后一次染毒24h內(nèi)用頸椎脫臼方法處死動物，將小鼠仰臥固定于解剖板上，沿腹中線剪開腹部，在胸部正中偏左或偏右約0.5cm處剪開胸壁，取下胸骨，擦凈血污，剔除肌肉，剪去骨骺，用小彎止血鉗將骨髓擠于有一滴小牛血清的載玻片上，混合均勻后推片。也可用雙腿股骨骨髓細(xì)胞進(jìn)行涂片，方法是取下股骨，剔去肌肉，用生理鹽水洗去血污和碎肉，剪去兩端的骨骺，用帶針頭的2ml注射器吸取小牛血清，插入骨髓腔內(nèi)，將骨髓沖入離心管，然后用吸管吹打骨髓團(tuán)塊使其均勻，以1000r/min離心10min，棄去多余的上清液，留下約0.5ml與沉淀物混勻后，用滴管吸取并滴一滴在載玻片上，推片。3

13、固定與染色 將推好晾干的骨髓片放入染色缸中，用甲醇溶液固定15min，取出晾干后放入新鮮配制的Giemsa應(yīng)用液中染色1015min，然后沖洗掉玻片上的染色液，晾干。4觀察計數(shù) 先在低倍鏡下進(jìn)行觀察，選擇分布均勻，染色較好的區(qū)域，再在油鏡一下觀察記數(shù)，PCE細(xì)胞呈灰藍(lán)色，正染紅細(xì)胞（NCE）呈橘黃色。細(xì)胞中含有的微核多數(shù)呈圓形，邊緣光滑整齊，嗜色性與核質(zhì)一致，呈紫紅色或藍(lán)紫色。若一個嗜多染紅細(xì)胞中出現(xiàn)兩個或兩個以上微核，仍按一個有微核細(xì)胞計數(shù)。計數(shù)1000個PCE細(xì)胞中含微核的PCE數(shù)，并計數(shù)200個細(xì)胞中PCE與NCE的比值。五、結(jié)果記錄1. 描述微核的形態(tài)特征。2. 計算各組微核細(xì)胞率。實

14、驗五 小鼠精子畸形實驗一、實驗?zāi)康恼莆沼^察和評價精子畸形的基本方法。二、基本原理精子畸形是生殖細(xì)胞基因發(fā)生突變的結(jié)果。小鼠精子畸形試驗?zāi)茉u價受試物對精子生成、發(fā)育的影響，可檢測受試物在體內(nèi)對生殖細(xì)胞的遺傳毒性作用。三、實驗材料1. 器材 生物顯微鏡、解剖剪、鑷子、表面皿、離心管、小漏斗、吸管、滴管、載玻片、擦鏡紙、紗布、注射器、計數(shù)器、電吹風(fēng)、染色缸等。藥品與試劑 用生理鹽水配制成0.4環(huán)磷酰胺注射液（4mg/ml）、生理鹽水、1%伊紅染色液、甲醇。3動物 性成熟成年雄性小鼠。四、實驗方法1環(huán)磷酰胺40mg/kg腹腔注射，連續(xù)5天，每日一次。對照組為注射等劑量生理鹽水。2制片：用頸椎脫臼法處死

15、小鼠，剖開腹腔，暴露睪丸，分離兩側(cè)附睪，用眼科剪剖開附睪組織，與適量生理鹽水混勻，涂片。3. 固定：待涂片干燥后，放入甲醇（A.R）液中固定5min。取出晾干。4. 染色：將涂片于1%伊紅染液中染色1h，然后用蒸餾水輕輕沖洗，晾干。5. 觀察與計數(shù)：首先，在低倍鏡下選擇背景清晰、精子分布均勻、重疊較少的區(qū)域，然后，在高倍鏡下觀察結(jié)構(gòu)完整的1000個精子，計數(shù)其中畸形的精子。精子畸形主要表現(xiàn)在頭部。主要類型有：無鉤、香蕉形、無定形、胖頭、尾折疊、雙頭及雙尾。無尾精子、頭部重疊的或整個與另一個重疊的精子均不計數(shù)。判斷雙頭、雙尾精子時，要注意與兩條精子的部分重疊相區(qū)別。五、結(jié)果記錄1. 描述精子畸形的形態(tài)特征。2. 計算各組精子畸形的發(fā)生率。實驗六 藥物生殖毒性實驗一、實驗?zāi)康恼莆沼^察胎鼠結(jié)構(gòu)異常的方法，了解藥物致畸作用評價的基本方法。二、基本原理藥物的對生殖細(xì)胞和胚胎發(fā)育的毒性作用可導(dǎo)致不育、流產(chǎn)和畸胎的發(fā)生。 觀察受精后母鼠的受孕率、死胎、畸胎等，可以評價藥物的生殖、發(fā)育毒性。三、實驗材料1. 器材 生物顯微鏡、解剖剪、鑷子、紗布、注射器等。2. 藥品與試劑 用生理鹽水配制成0.4環(huán)磷酰胺注射液（4mg/ml）、生理鹽水。3動物 性成熟成年小鼠，雌雄各半。四、實驗方法1性成熟小鼠按雌鼠和雄鼠1：1同籠3天，每日環(huán)磷酰胺40mg/kg腹腔注射。3日后，取