稀釋平板計數(shù)法

1、 稀釋平板計數(shù)操作方法實驗原理平板菌落計數(shù)法是將待測樣品經(jīng)適當(dāng)稀釋之后，其中的微生物充分分散成單個細(xì)胞，取一定量的稀釋樣液接種到平板上，經(jīng)過培養(yǎng)，由每個單細(xì)胞生長繁殖而形成肉眼可見的菌落，即一個單菌落應(yīng)代表原樣品中的一個單細(xì)胞。統(tǒng)計菌落數(shù)，根據(jù)其稀釋倍數(shù)和取樣接種量即可換算出樣品中的含菌數(shù)。但是，由于待測樣品往往不易完全分散成單個細(xì)胞，所以，長成的一個單菌落也可能來自樣品中的23或更多個細(xì)胞。因此平板菌落計數(shù)的結(jié)果往往偏低。為了清楚地闡述平板菌落計數(shù)的結(jié)果，現(xiàn)在已傾向使用菌落形成單位(cfu)而不以絕對菌落數(shù)來表示樣品的活菌含量。平板菌落計數(shù)法雖然操作較繁，結(jié)果需要培養(yǎng)一段時間才能取得，而且測

2、定結(jié)果易受多種因素的影響，但是，由于該計數(shù)方法的最大優(yōu)點是可以獲得活菌的信息，所以被廣泛用于生物制品檢驗（如活菌制劑），以及食品、飲料和水包括水源水等的含菌指數(shù)或污染程度的檢測。實驗器材LB液體、固體培養(yǎng)基1m1移液器，平皿，試管，試管架，恒溫培養(yǎng)箱等。實驗步驟1無菌器材的準(zhǔn)備(1) 無菌培養(yǎng)皿：取培養(yǎng)皿9套，包扎、滅菌。 (2) 無菌水：取6支試管，分別裝入4.5m1蒸餾水，加棉塞，滅菌。2樣品稀釋液的制備(1) 編號取無菌平皿9套，分別用記號筆標(biāo)明10-4、10-5、10-6(稀釋度)各3套。另取6支盛有4.5m1無菌水的試管，依次標(biāo)是10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10

3、-6。(2) 稀釋 用1m1移液器吸取0.5m1己充分混勻的菌懸液(待測樣品)，至10-1的試管中，此即為10倍稀釋。將10-1試管置試管振蕩器上振蕩，使菌液充分混勻。用1m1移液器在10-1試管中來回吹吸菌懸液三次，進(jìn)一步將菌體分散、混勻。吹吸菌液時不要太猛太快，吸時吸管伸入管底，吹時離開液面。混勻后吸取0.5ml至10-2試管中，此即為100倍稀釋。其余依次類推，整個過程如圖所示。3平板接種培養(yǎng)平板接種培養(yǎng)有澆注平板培養(yǎng)法和涂布平板培養(yǎng)法兩種方法。(1) 澆注平板培養(yǎng)法1) 取樣 用三支1ml無菌吸管分別吸取10-4、10-5、和10-6的稀釋菌懸液各1ml，對號放入編好號的無菌平皿中，每

4、個平皿放0.2ml。不要用1ml吸管每次只靠吸管尖部吸0.2ml稀釋菌液放入平皿中，這樣容易加大同一稀釋度幾個重復(fù)平板間的操作誤差。2) 倒平板盡快向上述盛有不同稀釋度菌液的平皿中倒人融化后冷卻至45左右的培養(yǎng)基約15毫升平皿，置水平位置迅速旋動平皿，使培養(yǎng)基與菌液混合均勻，而又不使培養(yǎng)基蕩出平皿或濺到平皿蓋上。待培養(yǎng)基凝固后，將平板倒置于37恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。由于細(xì)菌易吸附到玻璃器皿表面，所以菌液加入到培養(yǎng)皿后，應(yīng)盡快倒入融化并己冷卻至45左右的培養(yǎng)基，立即搖勻，否則細(xì)菌將不易分散或長成的菌落連在一起，影響計數(shù)。 (2) 涂布平板計數(shù)法：平板菌落計數(shù)法的操作除上述傾注倒平板的方式以外，還可以

5、用涂布平板的方式進(jìn)行。二者操作基本相同，所不同的是后者先將培養(yǎng)基融化后倒平板，待凝固后編號，并于37左右的溫箱中烘烤30min，或在超靜工作臺上適當(dāng)吹干，然后用無菌吸管吸取稀釋好的菌液對號接種于不同稀釋度編號的平板上，并盡快用無菌玻璃涂棒將菌液在平板上涂布均勻，平放于實驗臺上2030 min，使菌液滲入培養(yǎng)基表層內(nèi)，然后倒置于的恒溫箱中培養(yǎng)2448h。涂布平板用的菌懸液量一般以0.1ml較為適宜，如果過少，菌液不易涂布開；過多則在涂布完后或在培養(yǎng)時菌液仍會在平板表面流動，不易形成單菌落。實驗結(jié)果將培養(yǎng)后菌落計數(shù)結(jié)果填入下表：稀釋度10-410-510-6123平均123平均123平均cfu數(shù)/

6、平板每ml中的cfu數(shù)計數(shù)和報告1操作方法：培養(yǎng)到時間后，計數(shù)每個平板上的菌落數(shù)?？捎萌庋塾^察，必要時用放大鏡檢查，以防遺漏。在記下各平板的菌落總數(shù)后，求出同稀釋度的各平板平均菌落數(shù)，計算處原始樣品中每克（或每ml）中的菌落數(shù)，進(jìn)行報告。 2到達(dá)規(guī)定培養(yǎng)時間，應(yīng)立即計數(shù)。如果不能立即計數(shù)，應(yīng)將平板放置于04，但不得超過24h。 3計數(shù)時應(yīng)選取菌落數(shù)在30300之間的平板，若有二個稀釋度均在30300之間時，按國家標(biāo)準(zhǔn)方法要求應(yīng)以二者比值決定，比值小于或等于2取平均數(shù)，比值大于2則其較小數(shù)字（有的規(guī)定不考慮其比值大小，均以平均數(shù)報告）。 4若所有稀釋度均不在計數(shù)區(qū)間。如均大于300，則取最高稀釋

7、度的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之。如均小于30，則以最低稀釋度的平均菌落數(shù)乘稀釋倍數(shù)報告之。如菌落數(shù)有的大于300，有的又小于30，但均不在30300之間，則應(yīng)以最接近300或30的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之。如所有稀釋度均無菌落生長，則應(yīng)按小于1乘以最低稀釋倍數(shù)報告之。有的規(guī)定對上述幾種情況計算出的菌落數(shù)按估算值報告。 5不同稀釋度的菌落數(shù)應(yīng)與稀釋倍數(shù)成反比（同一稀釋度的二個平板的菌落數(shù)應(yīng)基本接近），即稀釋倍數(shù)愈高菌落數(shù)愈少，稀釋倍數(shù)愈低菌落數(shù)愈多。如出現(xiàn)逆反現(xiàn)象，則應(yīng)視為檢驗中的差錯，不應(yīng)作為檢樣計數(shù)報告的依據(jù)。 6當(dāng)平板上有鏈狀菌落生長時，如呈鏈狀生長的菌落之間無任何明顯界限，則應(yīng)作為一個菌落計，如存在有幾條不同來源的鏈，則每條鏈均應(yīng)按一個菌落計算，不要把鏈上生長的每一個菌落分開計數(shù)。如有片狀菌落生長，該平板一般不宜采用，如片狀菌落不到平板一半，而另一半又分布均勻，則可以半個平板的菌落數(shù)乘2代表全平板的菌落數(shù)。 7當(dāng)計數(shù)平板內(nèi)的菌落數(shù)過多（即所有稀釋度均大于300時），但分布很均勻，可取平板的一半或1/4計數(shù)。再乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)作為該平板的菌落數(shù)。 8菌落數(shù)的報告，按國家標(biāo)準(zhǔn)方法規(guī)定菌落數(shù)在1100時，按實有數(shù)字報告，如大于100