實時熒光定量PCR(qPCR,RT-PCR)的原理及應(yīng)用

1、2013-11-26實時熒光定量實時熒光定量PCR技術(shù)技術(shù)的原理及應(yīng)用的原理及應(yīng)用（Real Time Quantitative PCR） Contents一、實時一、實時熒光定量熒光定量PCRPCR的定義的定義二、二、RT-PCRRT-PCR技術(shù)的技術(shù)的原理及試驗流程原理及試驗流程三、三、RT-PCRRT-PCR技術(shù)的數(shù)據(jù)分析技術(shù)的數(shù)據(jù)分析四、四、RT-PCRRT-PCR技術(shù)的應(yīng)用技術(shù)的應(yīng)用實時熒光定量實時熒光定量PCR目錄目錄PCR電泳實時熒光定量實時熒光定量PCR的定義的定義普通PCR在在PCRPCR結(jié)束后對結(jié)束后對 進(jìn)行定量分析進(jìn)行定量分析終點產(chǎn)物終點產(chǎn)物 PCRPCR技術(shù)技術(shù)和和熒光

2、檢測技術(shù)熒光檢測技術(shù)的結(jié)合的結(jié)合通過通過熒光染料熒光染料或或熒光標(biāo)記的特異性探針熒光標(biāo)記的特異性探針，對，對PCRPCR產(chǎn)物進(jìn)行產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，標(biāo)記跟蹤，實時在線監(jiān)控實時在線監(jiān)控反應(yīng)過程反應(yīng)過程，通過儀器和相應(yīng)的，通過儀器和相應(yīng)的軟軟件件分析結(jié)果分析結(jié)果，對待，對待測樣品的測樣品的初始模板進(jìn)行定量初始模板進(jìn)行定量或定性分析或定性分析。 克服了普通克服了普通PCRPCR：1 1、終點定量重復(fù)性不好、終點定量重復(fù)性不好 2 2、EBEB有毒，熒光太貴等缺點有毒，熒光太貴等缺點實時熒光定量實時熒光定量PCR的定義的定義PCRPCR技術(shù)技術(shù)和和熒光檢測技術(shù)熒光檢測技術(shù)的結(jié)合的結(jié)合通過通過熒光染料熒光

3、染料或或熒光標(biāo)記的特異性探針熒光標(biāo)記的特異性探針，對，對PCRPCR產(chǎn)物進(jìn)行產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，標(biāo)記跟蹤，實時在線監(jiān)控實時在線監(jiān)控反應(yīng)過程反應(yīng)過程，通過儀器和相應(yīng)的，通過儀器和相應(yīng)的軟軟件件分析結(jié)果分析結(jié)果，對待，對待測樣品的測樣品的初始模板進(jìn)行定量初始模板進(jìn)行定量或定性分析或定性分析。實時熒光定量實時熒光定量PCR的定義的定義RT-PCR技術(shù)的原理及試驗流程技術(shù)的原理及試驗流程RT-PCR技術(shù)的原理及試驗流程技術(shù)的原理及試驗流程RT-PCR反應(yīng)體系模板4.5lTag mixture5.0lF(F)0.25lR(R)0.25l熒光染料 SYBR Green I熒光標(biāo)記的探針TaqMan探針法RT

4、-PCR技術(shù)的原理及試驗流程技術(shù)的原理及試驗流程Monitoring PCR with the SYBR Green I Dye（SYBR Green 法）法）變性變性退火退火延伸延伸RT-PCR技術(shù)的原理及試驗流程技術(shù)的原理及試驗流程SYBR Green法優(yōu)缺點法優(yōu)缺點RT-PCR技術(shù)的原理及試驗流程技術(shù)的原理及試驗流程RT-PCR技術(shù)的原理及試驗流程技術(shù)的原理及試驗流程Monitoring PCR with TaqMan（ TaqMan法）法）RT-PCR技術(shù)的原理及試驗流程技術(shù)的原理及試驗流程TaqMan法法TaqMan探針法優(yōu)缺點探針法優(yōu)缺點RT-PCR技術(shù)的原理及試驗流程技術(shù)的原理及

5、試驗流程n絕對定量絕對定量(Absolute Quantification(Absolute Quantification，AQ)AQ) 病原體檢測 轉(zhuǎn)基因食品檢測 基因表達(dá)研究n相對定量相對定量(Relative Quantification(Relative Quantification，RQ)RQ) 基因在不同組織中的表達(dá)差異 藥物療效考核 耐藥性研究RT-PCR技術(shù)的技術(shù)的數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析相對定量通過內(nèi)標(biāo)定量相對定量通過內(nèi)標(biāo)定量內(nèi)標(biāo)定量結(jié)果代表了樣本中所含細(xì)胞或基因組數(shù)量RT-PCR技術(shù)的技術(shù)的數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析內(nèi)標(biāo)內(nèi)標(biāo)（Endogenous ControlEndogenous Cont

6、rol）通常是18S、28S、-actin、GAPDH基因等看家基因在細(xì)胞中的表達(dá)量或在基因組中的拷貝數(shù)恒定，受環(huán)境因素影響小PCRPCR分四個階段分四個階段RT-PCR技術(shù)的技術(shù)的數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析RT-PCR技術(shù)的技術(shù)的數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析-CtPCR擴(kuò)增循環(huán)數(shù)扣除背景熒光后的相對熒光量1. 1. 熒光熒光域值（域值（thresholdthreshold）的）的設(shè)定設(shè)定在定量在定量PCRPCR中，需要經(jīng)過數(shù)個循環(huán)后熒光信號才能夠中，需要經(jīng)過數(shù)個循環(huán)后熒光信號才能夠被檢測到，一般以被檢測到，一般以1515個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號。信號。RT-PCR技術(shù)的技術(shù)的數(shù)

7、據(jù)分析數(shù)據(jù)分析-CtPCR擴(kuò)增循環(huán)數(shù)扣除背景熒光后的相對熒光量2. 2. Ct Ct 值的定義值的定義 在在熒光定量熒光定量PCRPCR技術(shù)中，有一個很重要的概念技術(shù)中，有一個很重要的概念 Ct Ct值。值。C C代表代表CycleCycle，t t代表代表thresholdthreshold，CtCt值的含義是：值的含義是：每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)（如循環(huán)數(shù)（如圖所圖所示）。示）。RT-PCR技術(shù)的技術(shù)的數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析-Ct3. Ct3. Ct值與起始模板的關(guān)系值與起始模板的關(guān)系研究表明，每個模板的研究表明，每個模板

8、的CtCt值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，CtCt值越小。利用已知起始拷貝值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標(biāo)代數(shù)，縱坐標(biāo)代CtCt值。因此，只要獲得未知樣品的值。因此，只要獲得未知樣品的CtCt值，即可從值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。 PCR擴(kuò)增循環(huán)數(shù)扣除背景熒光后的相對熒光量RT-PCR技術(shù)的技術(shù)的數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析3. Ct3. Ct值與起始模板的關(guān)系

9、值與起始模板的關(guān)系研究表明，每個模板的研究表明，每個模板的CtCt值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，CtCt值越小。利用已知起始拷貝值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標(biāo)代數(shù)，縱坐標(biāo)代CtCt值。因此，只要獲得未知樣品的值。因此，只要獲得未知樣品的CtCt值，即可從值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。 RT-PCR技術(shù)的技術(shù)的數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析相對定量分析方法相對定量

10、分析方法 -Ct前提:目標(biāo)序列和內(nèi)參序列的擴(kuò)增效率接近100且偏差在 5以內(nèi) 1、用目標(biāo)基因的CT值減內(nèi)參基因的CT值： CT（test)= CT （target, test) - CT （ref, test) CT（control)= CT （target, control) - CT （ref, control) 2、用試驗樣本的CT值減校準(zhǔn)樣本的CT值： CT= CT（test/control) - CT（calibrator) 3、計算表達(dá)水平比率： 相對表達(dá)量RQ= 2 CTRT-PCR技術(shù)的技術(shù)的數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析SYBR Green 熔解曲線分析熔解曲線分析RT-PCR技術(shù)的技術(shù)的數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析 臨床疾病診斷臨床疾病診斷：各型肝炎、艾滋病、禽流感等傳染病診斷和療效評價；腫瘤標(biāo)志物及瘤基因檢測實現(xiàn)腫瘤病診斷；遺傳基因檢測實現(xiàn)遺傳病診斷。 動物疾病檢測動物疾病檢測：禽