有機(jī)溶劑中酶催化活性研究進(jìn)展

1、有機(jī)溶劑中酶催化活性研究進(jìn)展摘 要：酶在有機(jī)溶劑中催化作用的研究日益受到重視，其應(yīng)用范圍也越來越廣。 本文就有機(jī)介質(zhì)中酶催化 的影響因素進(jìn)行了探討，并歸納出提高酶活性的一系列方法，最后簡(jiǎn)要介紹了有機(jī)溶劑中酶的應(yīng)用。關(guān)鍵詞： 有機(jī)溶劑；酶催化一直以來，人們認(rèn)為“生物催化必須在水溶液中進(jìn)行 、“有機(jī)溶劑是酶的變性劑、失活劑 ，而 1984年，Klibanov提岀：“只要條件適宜，酶在非生物體系的有機(jī)溶劑中同樣具有催化功能的理論 使酶學(xué)概念發(fā)生了革命性的改變，并由此開創(chuàng)了非水相生物催化非水酶學(xué)的新時(shí)代。1 有機(jī)溶劑中酶催化反響的優(yōu)勢(shì)研究說明，有機(jī)溶劑中的酶和水溶液中的酶一樣具有高度的底物選擇性。此外

2、，還有以下一些特 點(diǎn)2, 3： 1絕大多數(shù)有機(jī)化合物在非水系統(tǒng)內(nèi)溶解度很高； 2根據(jù)熱力學(xué)原理，一些在水中不可 能進(jìn)行的反響，有可能在非水系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行； 3有機(jī)溶劑可促使熱力學(xué)平衡向合成方向如酯合成、 肽合成等移動(dòng)， 如脂肪酶在水中催化脂肪水解， 而在有機(jī)溶劑中那么催化酯合成； 4在有機(jī)溶劑中， 所有有水參與的副反響如酸酐水解將受到抑制； 5在有機(jī)溶劑中酶的熱穩(wěn)定性顯著提高，可通 過提高溫度加速催化反響進(jìn)行； 6從非水系統(tǒng)內(nèi)回收反響產(chǎn)物比水中容易； 7在非水系統(tǒng)內(nèi)酶很 容易回收和反復(fù)使用，不需要進(jìn)行固定化； 8在有機(jī)溶劑中不易發(fā)生微生物污染； 9更為重要的 是，低水環(huán)境可用于穩(wěn)定具有未知催化性質(zhì)

3、的構(gòu)象異構(gòu)體，以及在水中壽命極短的酶反響中間體。目前，有機(jī)溶劑中酶催化的上述優(yōu)勢(shì)使得非水酶學(xué)研究成為生物化學(xué)、有機(jī)化學(xué)、生物工程等多 種學(xué)科交叉的研究熱點(diǎn)。 迄今發(fā)現(xiàn)能在有機(jī)溶劑中發(fā)揮催化功能的酶有十幾種， 主要集中于脂肪酶研 究，催化的反響類型包括氧化、復(fù)原、酯合成和酯交換、脫氧、酞胺化、甲基化、羥化、磷酸化、脫 氨、異構(gòu)化、環(huán)氧化、開環(huán)聚合、側(cè)鏈切除、縮合及鹵代等。2 影響酶催化活性的因素一直以來有機(jī)相酶催化的研究非常活潑， 但到目前為止仍處于實(shí)驗(yàn)研究階段， 離工業(yè)化應(yīng)用還有 一定的距離，最大的原因就是酶在有機(jī)溶劑中活性較低。一般而言，有機(jī)溶劑中的酶活性要比水溶液 中低 2-6個(gè)數(shù)量級(jí)。因

4、此，確定影響有機(jī)溶劑中酶活性的因素，設(shè)法提高有機(jī)溶劑中酶活性表達(dá)是當(dāng) 今酶學(xué)研究的重點(diǎn)。有機(jī)溶劑中酶的催化必需在其分子周圍有一單層水分子直接或間接地通過氫鍵、 疏水鍵、靜電作 用、范德華力等以維持酶的活性結(jié)構(gòu)，這局部水叫必需水 3，所需水量因酶而異，表示方法也經(jīng)歷了 多個(gè)階段。非水酶學(xué)開展初期，普遍采用百分水含量來表示含水量，后來 Halling 4提岀了熱力學(xué)水活 度aw這一表示方法，因?yàn)樗馄胶鈺r(shí)，各相的 aw值相等；體系的改變伴隨著水活度的變化，故通過 aw 值可以推斷酶的活性?？赏ㄟ^液上氣體與一枯燥柱循環(huán)來調(diào)節(jié)反響介質(zhì)液上水活度 5；還可采用水 活鹽對(duì)來控制水活度，這種被普遍采用并行之

5、有效。一些對(duì)水比擬敏感的有機(jī)相酶促反響如：肽的合成，可用水模擬物代替水，目前常用的水模擬物有甲醇、二甲基甲酰胺、四氫呋喃等，它們對(duì)水 敏性酶促反響意義特別大。2.2 有機(jī)溶劑一般認(rèn)為，有機(jī)溶劑主要從三個(gè)方面來影響酶催化活性： 1有機(jī)溶劑影響酶反響過程中底物和產(chǎn)物擴(kuò)散，從而間接地影響酶活性； 2 有機(jī)溶劑“剝奪酶分子外表必需水導(dǎo)致酶活力下降；3有機(jī)溶劑直接與酶接觸作用，通過破壞維持酶蛋白活性構(gòu)型的氫鍵、疏水鍵等作用，抑制酶活性或使 酶失活。由于溶劑的極性能直接導(dǎo)致酶脫水失活，因此 Colja Laane6 采用溶劑疏水性參數(shù) LogP 值來 評(píng)價(jià)有機(jī)溶劑對(duì)酶的影響程度，這一參數(shù)廣泛使用。何平7等

6、探尋疏水性參數(shù)logP不同的有機(jī)溶劑對(duì)木瓜蛋白酶及其固定化酶活性的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)低logP(logP< -0.24)有機(jī)溶劑在低體積分?jǐn)?shù)(10%)時(shí)可激活或穩(wěn)定木瓜蛋白酶及其固定化酶活性，而在高體積分?jǐn)?shù)(x logP< 1.31)有機(jī)溶劑對(duì)木瓜蛋白酶及其固定化酶活性具有顯著抑制作用；高logP(logP> 1.80)有機(jī)溶劑在低體積分?jǐn)?shù)(< 10%)時(shí)抑制木瓜蛋白酶及其固定化酶活性，但在高體積分?jǐn)?shù)(30%)時(shí)酶活性升高。然而酶的相對(duì)反響速率與溶劑 LogP 之間并不呈現(xiàn)線性關(guān)系 8。據(jù)此， Zhen Yang 等提出分配系數(shù) (Partitioncoefficients ，

7、 P) 作為溶劑選擇標(biāo)準(zhǔn)，并發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物分配系數(shù)Pp與底物分配系數(shù)Ps比率Pp/Ps與酶相對(duì)反響速率之間有良好的線性關(guān)系。 分配系數(shù)直接反映底物和產(chǎn)物在有機(jī)溶劑中的溶劑化， 故作為描述酶在 有機(jī)介質(zhì)中活性是十分有效的。此外，作為有機(jī)溶劑變性強(qiáng)度參數(shù)變性量(Dena-ture capacity，DC)等也被用于評(píng)價(jià)有機(jī)溶劑對(duì)酶活性影響，可見，單一參數(shù)無法全面表征酶活性的變化，因此，選擇有機(jī) 相酶催化的有機(jī)溶劑時(shí)必須從不同方面來考慮。2.3 酶有機(jī)溶劑中，酶的利用形式一般有三種：酶粉、化學(xué)修飾酶和固定化酶。Giacomo Carrel等人比較了脂蛋白脂酶以不同形式酶粉、聚乙二醇PEG與酶粉、PEG冷凍

8、枯燥酶粉、PEG共價(jià)修飾酶、硅藻土吸附酶 參加甲苯后其酶活性的變化； 結(jié)果說明， 酶的形式對(duì)酶活性有極大的影響。 其中， PEG 共價(jià)修飾酶活性最高，在以乙烯基月桂酸為?；瘎r(shí)，其相對(duì)酶活性到達(dá)100%；硅藻土吸附酶活性為70% ;而酶粉、PEG與酶粉酶活性均小于1%。化學(xué)修飾酶由于改變了理化性質(zhì)，提高了酶的最大 反響速率和酶分子對(duì)底物的親和力從而影響酶的活性 10。用糖脂修飾的 SOD 在有機(jī)溶劑中的酶活性 甚至比水中還高。在酶外表涂漬保護(hù)膜，降低有機(jī)溶劑與酶的直接作用也可起到提高酶活性的作用， 如外表活性劑 11、脂質(zhì)等。 固定化酶在有機(jī)介質(zhì)中酶活性提高， 為了解釋該現(xiàn)象， Kyeong

9、Kyu Kim 12 研究了 B. cepacia產(chǎn)的脂酶的晶體結(jié)構(gòu)，他發(fā)現(xiàn)脂酶的活性中心存在一個(gè)“蓋子覆蓋了脂酶的活性 位點(diǎn)，自由酶的活性位點(diǎn)呈現(xiàn)“關(guān)閉狀態(tài)，而被固定化的酶在載體外表呈現(xiàn)“開放的形式，即酶 活中心的“蓋子沒有覆蓋酶的活性位點(diǎn)，酶活就獲得了提高。2.4 緩沖液酶冷凍枯燥時(shí)的緩沖液對(duì)有機(jī)相酶催化活性有極重要的影響，緩沖液有四個(gè)重要因子：1 pH；2緩沖液類型； 3緩沖液的量； 4水的濃度。通過研究不同pH 條件下冷凍枯燥酶在同一有機(jī)溶劑中的酶活性說明，酶在有機(jī)溶劑溶液的催化最適 pH 與在水溶液中極為相近。酶在有機(jī)溶劑中 的活性取決于其冷凍枯燥前最后存在過的水溶液的pH值pH記憶

10、效應(yīng)，一般說來，如果冷凍枯燥前溶解酶的緩沖溶液具有酶在水溶液的最適 pH 值, 那么酶的最適離子化狀態(tài)將會(huì)在冷凍枯燥后保 持，在有機(jī)介質(zhì)中表現(xiàn)出來的活性也最大 13。由于不同緩沖液對(duì)酶外表微弱的物理效應(yīng)、在結(jié)晶和冷 凍枯燥過程中冰凍水溶液的相行為、 與剩余水之間相互作用、 與酶或底物間相互作用等的不同使得酶 活性在冷凍枯燥后相差上千倍。2.5 鹽效應(yīng)Yuri L. Khmelnitsky 14等研究枯草桿菌蛋白酶在正已烷中的轉(zhuǎn)酯化反響時(shí)發(fā)現(xiàn)：酶活性隨著KCI濃度升高而急劇上升。這種現(xiàn)象在其它酶中也有出現(xiàn)，如A- 胰蛋白酶與 95%KCI 冷凍枯燥， Kcat/Km值可增加 50 倍。學(xué)者認(rèn)為鹽

11、誘導(dǎo)酶活性的機(jī)理有兩個(gè) :鹽保護(hù)酶免受有機(jī)溶劑毒害； 冷凍枯燥過程中， 鹽可以保持酶的天然構(gòu)型。后一種解釋被廣為接受。 Yuri L. Khmelnitsky 發(fā)現(xiàn)，當(dāng)鹽濃度較低時(shí)，冷 凍枯燥蛋白酶構(gòu)成的固體催化顆粒具有疏松結(jié)構(gòu)；當(dāng)鹽濃度較高時(shí)，催化顆粒象鹽晶體一樣，具有剛 性結(jié)構(gòu)，對(duì)酶起保護(hù)作用。所以，他認(rèn)為酶在鹽基質(zhì)中之所以保持較高的酶活性，是由于鹽基質(zhì)對(duì)有 機(jī)溶劑致使酶失活提供一種保護(hù)效應(yīng)。 也有學(xué)者認(rèn)為鹽誘導(dǎo)催化活性是由冷凍枯燥時(shí)間與酶水含量決 定的。酶活性隨冷凍枯燥時(shí)間增加而增加，水含量低于最適含量，那么迅速降低。顯然不同的催化效率 是基于鹽的結(jié)合與冷凍枯燥過程雙重結(jié)果?？梢?，鹽效應(yīng)

12、機(jī)制有待進(jìn)一步研究。2.6 配體、冷凍枯燥劑、賦形劑 酶在凍干前可用配體、 冷凍枯燥劑為酶作印跡， 使酶以一種高活性構(gòu)象形式被凍干并在有機(jī)介質(zhì) 中得以保持，這種現(xiàn)象稱之為分子印跡。 Alexander M. Klibanov 15 研究了四種蛋白酶和三種脂肪酶與 配體共存的水溶液經(jīng)冷凍枯燥的酶活性， 發(fā)現(xiàn)比沒有配體的活力大大地提高。 配體增加酶活性原因在 于:1配體對(duì)酶的印跡效應(yīng)，使得酶的活性構(gòu)象在固態(tài)形式或有機(jī)溶劑中得以保持，而由于水的柔 性，印跡構(gòu)象在水溶液中易失去； 2配體保護(hù)酶在冷凍枯燥過程中免受失活。非配體的冷凍枯燥劑 如:山梨醇、木糖醇、海藻糖、甘露醇以及 PEG 等在酶冷凍枯燥之

13、前參加酶水溶液中，也能極大地提 高酶在有機(jī)相催化活性， 其作用機(jī)制與配體相同。 賦形劑與酶混合冷凍枯燥后也極大地提高了酶活性， 機(jī)理是基于賦形劑能緩解酶在冷凍枯燥時(shí)失活， 賦形劑所激發(fā)的酶活性通過用無水有機(jī)溶劑洗掉賦形 劑后消失，這與配體作用機(jī)理有所不同。2.7 超聲輻射、抑制劑 隨著對(duì)有機(jī)相酶催化的研究深入，所知影響有機(jī)相酶催化活性因素越來越多，如:超聲輻射、酶抑制劑等。超聲波作為一種機(jī)械能量形式，可以改變物質(zhì)組織結(jié)構(gòu)、狀態(tài)及功能。在適宜的條件下，低強(qiáng)度 的超聲輻射對(duì)酶有一定的激活作用， 這種激活作用隨著時(shí)間的增加而愈加明顯。 目前利用超聲技術(shù)對(duì) 酶進(jìn)行處理主要有兩種方式：一種是超聲預(yù)處理，

14、即首先在超聲介質(zhì)中對(duì)酶進(jìn)行超聲處理，酶回收處 理后再置于反響介質(zhì)中進(jìn)行酶促反響； 另一種是直接對(duì)反響介質(zhì)中的酶進(jìn)行超聲處理， 超聲處理與酶 促反響同時(shí)進(jìn)行 16，目前普遍采用的后一種處理方式。 吳虹 17等人在研究超聲作用下的酶促?gòu)U油脂轉(zhuǎn) 酯反響的過程中也報(bào)道了反響前對(duì)酶進(jìn)行超聲預(yù)處理能在一定程度上縮短酶被激活所需的時(shí)間， 并使 其充分激活 ,從而加速酶催化反響。具有兩親特性的外表活性劑、膽汁鹽、金屬離子對(duì)酶活性也有一 定的影響，外表活性劑在適宜的濃度下，能促進(jìn)酶活性及穩(wěn)定性的提高，而膽汁鹽和金屬離子在低濃 度時(shí)不僅不能提高酶活性，反而在濃度較高時(shí)，有顯著的抑制作用。這些工作有待進(jìn)一步深入研究

15、。3 提高酶在有機(jī)溶劑中活性的策略如何提高酶在有機(jī)溶劑中的活性，促進(jìn)其在工業(yè)界的廣泛應(yīng)用是近年來研究熱點(diǎn)。目前，在這方 面已有不少重大突破，根據(jù)上述影響酶活性的因素及其造成酶在有機(jī)溶劑中活性顯著下降主要原因， 并提出了使酶在有機(jī)介質(zhì)中的活性激活的一系列有效方法，其中不少方法本錢低，可按比例擴(kuò)大，能 使酶反響速度提高 102-105 倍，接近其在水溶液中的酶活性。/顆粒，這些酶粉懸目前，用于有機(jī)溶劑的酶制劑通常是從水溶液里經(jīng)冷凍枯燥制備出來的粉末浮在有機(jī)相里，造成底物向酶的擴(kuò)散受到限制；此外，酶分子互相疊合也容易造成一些酶分子的活性 中心被周圍的酶分子封閉， 使底物分子難以靠近。 需要指出的是這

16、種質(zhì)量傳遞引起的酶活性下降只能 解釋酶在有機(jī)介質(zhì)中活性大幅度下降的局部原因18，可以通過增加攪拌力度和減小酶粉顆粒來緩解質(zhì)量傳遞的限制。3.2 優(yōu)化 pH 狀況適當(dāng)?shù)膒H處理可以使酶活性提高100倍。如前所述，我們可以將冷凍枯燥前溶解酶的緩沖溶液 調(diào)至酶的最適 pH 值，使酶在有機(jī)介質(zhì)中表現(xiàn)出來的活性最大； 此外，不要使用揮發(fā)性的 如甲酸銨 或能溶于有機(jī)相的如三異辛胺及其鹽酸化物、三苯基乙酸及其鈉鹽弱酸/弱堿緩沖溶液 18，它們會(huì)洗去酶在有機(jī)溶劑中表現(xiàn)出來的 pH 記憶效應(yīng)，從而導(dǎo)致酶活性產(chǎn)生變化。有機(jī)溶劑取代水作為反響介質(zhì)， 使酶分子因缺少水的潤(rùn)滑作用而變得結(jié)構(gòu)更為剛性。 這是造成酶 活性下

17、降的主要原因之一。 向反響體系參加一定量的水分或把體系的熱力學(xué)水活度aw調(diào)節(jié)到最正確值，可使酶的反響速度提高 100倍以上13。在某種程度上， 一些能形成氫鍵的溶劑 如甘油、甘醇 可以取代水提供這種潤(rùn)滑劑作用。 另外， 參加蛋白質(zhì)變性劑對(duì)酶進(jìn)行適當(dāng)?shù)那疤幚硪部赡苁姑傅牡鞍?質(zhì)結(jié)構(gòu)因局部展開而變得更加柔韌靈活，從而到達(dá)提高酶活力的效果19。長(zhǎng)期以來人們認(rèn)為導(dǎo)致酶在有機(jī)溶劑中活性下降的主要原因是酶的蛋白質(zhì)構(gòu)型發(fā)生變化。事實(shí) 上，這種蛋白質(zhì)變性作用并不是由于酶和溶劑的接觸所引起的，而是引入溶劑之前酶的脫水過程如 冷凍枯燥造成的，然而由此產(chǎn)生的變性作用是可逆性的20。為此我們可以將冷凍枯燥后的酶溶解在

18、少量水里，使已變性的蛋白質(zhì)構(gòu)型重新恢復(fù)，然后再引入有機(jī)溶劑中；還可以在冷凍枯燥時(shí)往酶的水 溶液中參加某些無機(jī)或有機(jī)物質(zhì)使其與酶一同凍干，如無機(jī)鹽 KCL 、冠醚、環(huán)糊精、底物類似物、 冷凍防護(hù)劑等 18，這些添加技術(shù)有時(shí)候可協(xié)同作用。4 有機(jī)溶劑中酶的應(yīng)用有機(jī)溶劑中的酶由于能催化各種各樣的反響， 特別是水溶液中不能進(jìn)行的反響， 因而極大地?cái)U(kuò)展 了酶的實(shí)用范圍。手性研究的熱點(diǎn)一般表現(xiàn)在手性藥物、綠色農(nóng)藥、高檔液晶及高級(jí)香料等方面的研究和應(yīng)用。叢 方地 21以脂肪酶 PSL 和 CSL 作為生物催化劑、辛酸乙烯酯作為酰化劑拆分 2-辛醇，回收率到達(dá) 80%。4.2 內(nèi)酯和聚酯的合成有些通常用化學(xué)法

19、難以完成的反響， 如不對(duì)稱聚酯合成及大環(huán)內(nèi)酯的合成等， 現(xiàn)在可以用有機(jī)溶 劑中的酶來完成。隨著非水酶學(xué)的開展 ,脂肪酶的應(yīng)用已從油脂水解擴(kuò)展到酯合成和酯交換，利用這些反響可把廉價(jià)的油醋改造成具有食用和醫(yī)用價(jià)值的特殊油脂。鄭麗妃 22研究了六種不同種溶劑對(duì)阿魏酸酯化反響的影響，篩選岀異辛烷為最正確溶劑，在其最正確的催化條件反響溫度為65C，酸醇分子比為1:8 ,酶加量為200mg,反響48小時(shí)后到達(dá)最高轉(zhuǎn)化率 99%。曾家豫等23脂肪酶為催化劑，正己烷為溶劑，通過酯化反響合成了乙酸薄荷酯，產(chǎn)率高達(dá)92.4%。劉虹蕾 24用褶皺假絲酵母脂肪酶在 logP 值為 3.5 的正己烷中高效合成植物甾醇酯

20、。4.4 其他 廣泛用于制漿造紙、紡織、食品、化裝品、環(huán)保、納米生物技術(shù)等領(lǐng)域的漆酶，在不同有機(jī) 溶劑體系中已經(jīng)可以應(yīng)用于酚、氯酚、蒽、羥基聯(lián)苯、雙酚A 、甾類激素等化學(xué)物質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化、木質(zhì)素的改性、生物合成等方面，這些研究拓展了其應(yīng)用領(lǐng)域25；同時(shí)，非水酶學(xué)也促進(jìn)了其他酶工程相互的開展，如在生物傳感器開展過程中，有機(jī)相酶電極因其是在有機(jī)介質(zhì)中對(duì)物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，而 受到關(guān)注 26。5 總結(jié)盡管目前對(duì)有機(jī)相酶研究還未完善，未到達(dá)統(tǒng)一認(rèn)識(shí)，但可以相信，隨著研究的不斷深入，解決有機(jī)酶催化應(yīng)用問題已為期不遠(yuǎn)。 有機(jī)相酶催化的工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用， 將使傳統(tǒng)化學(xué)工業(yè)及其相關(guān)工 業(yè)朝著節(jié)約資源和能源的方向開展，

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