無(wú)菌檢查方法的驗(yàn)證

1、無(wú)菌檢查方法的驗(yàn)證無(wú)菌檢查方法是為了檢查藥典要求無(wú)菌的制劑及其他制品是否無(wú)菌而建立的試驗(yàn)方法， 是作為無(wú)菌產(chǎn)品批放行的重要依據(jù)及藥監(jiān)部門對(duì)無(wú)菌產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)管的一個(gè)重要工程。 因此如 何確保無(wú)菌檢查方法的準(zhǔn)確可靠至關(guān)重要， 而檢查方法的驗(yàn)證是保證檢查結(jié)果的公正、 科學(xué) 和準(zhǔn)確的根底，因此各個(gè)主要國(guó)家的GMP或藥典都對(duì)無(wú)菌檢查方法的驗(yàn)證提出了嚴(yán)格的要求，2022版中國(guó)藥典對(duì)分析方法驗(yàn)證和檢查的要求也有大幅度的提高，同時(shí)也是GMP僉查中檢查的重點(diǎn)和容易發(fā)現(xiàn)問(wèn)題的區(qū)域。驗(yàn)證要求與方法無(wú)菌檢查方法驗(yàn)證一般分為前驗(yàn)證和再驗(yàn)證兩種。前驗(yàn)證，也稱預(yù)驗(yàn)證，指在無(wú)菌分析方法正式使用前，按照預(yù)定驗(yàn)證方案進(jìn)行的驗(yàn)證。

2、如果沒有充分的理由，任何檢查方法必須進(jìn)行前驗(yàn)證。再驗(yàn)證， 指某一檢查方法經(jīng)過(guò)驗(yàn)證并在使用一段時(shí)間后進(jìn)行的，旨在證實(shí)已驗(yàn)證狀態(tài)沒有發(fā)生飄移而進(jìn)行的重新驗(yàn)證及對(duì)檢查方法進(jìn)行修訂、改變時(shí)進(jìn)行的驗(yàn)證。通常一個(gè)無(wú)菌產(chǎn)品的檢查流程為： 首先基于產(chǎn)品的劑型、 溶解度等性質(zhì)， 按照藥典的要 求確定是否需要進(jìn)行前處理 ; 然后根據(jù)產(chǎn)品的特性是否有抑菌性，確定是否需要增加去除產(chǎn) 品抑菌性的方法 ; 最后驗(yàn)證整個(gè)檢查方法中用到的一切及試驗(yàn)過(guò)程中的每一個(gè)環(huán)節(jié)包括樣品 的預(yù)處理方式、檢查過(guò)程、培養(yǎng)條件等均不影響樣品中微生物的生長(zhǎng)。這里，驗(yàn)證的重點(diǎn)環(huán)節(jié)包括：前處理方法直接影響后續(xù)步驟的效果和重現(xiàn)性，應(yīng)是驗(yàn)證的重點(diǎn)。供試品

3、中抑菌活性的去除是當(dāng)前驗(yàn)證工作的重點(diǎn)， 尤其強(qiáng)調(diào)應(yīng)充分驗(yàn)證供試品本身對(duì)微 生物生長(zhǎng)的影響。具體的驗(yàn)證方法如下：菌種的選擇無(wú)菌檢查方法驗(yàn)證中通常選擇以下 6 種試驗(yàn)中常用的控制菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株， 它們分別代表 不同類型的菌種：枯草芽孢桿菌 CMCC(B)63 501 代表藥品中常見的污染菌芽孢桿菌、 金黃色葡萄球菌 CMCC(B)26 003 代表革蘭陽(yáng)性菌、 生孢梭菌 CMCC(B)64 941代表厭氧菌、 大腸埃希菌 CMCC(B)44 102 代表革蘭陰性菌、白色念珠菌 CMCC(F)98 001 代表酵母菌、 黑曲霉菌 CMCC(F)98 003 代表霉菌。菌液的制備接種金黃色葡萄球菌、 大

4、腸埃希菌、 枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中或營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，接種生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，3035 C培養(yǎng)1824h;接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中或改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基上，2328C培養(yǎng)2448h,上述培養(yǎng)物用 0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成每 1ml含菌數(shù)小于100cfu的 菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，2328 C培養(yǎng)57天，加入 35ml 含 0.05%ml/ml 聚山梨酯 80的 0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，采用適 宜的方法吸出孢子懸液至無(wú)菌試管內(nèi)， 用含 0.05%ml/ml 聚山梨酯 80的 0.

5、9%無(wú)菌氯化鈉溶 液制成每1ml含孢子數(shù)小于100cfu的孢子懸液。樣品的前處理無(wú)菌產(chǎn)品中每個(gè)成分應(yīng)該是均勻的， 因此只要確定在驗(yàn)證的方法中， 按所需的總接種量 即可，而不必像樣品日常檢測(cè)中按規(guī)定的容器數(shù)取樣。如果制備樣品時(shí)需要使用溶解劑、稀釋劑、助溶劑、 破乳劑等溶劑，需要確保這些溶劑 是有效的，并且其使用對(duì)微生物生長(zhǎng)無(wú)影響 ; 或者制備過(guò)程中需要對(duì)樣品進(jìn)行加熱助溶、離 心等操作時(shí)，需要確保加熱的溫度、離心速度和離心時(shí)間等對(duì)微生物生長(zhǎng)或分布無(wú)影響。不需前處理的樣品免做。消除樣品抑菌性的方法無(wú)抑菌性樣品的驗(yàn)證方法： 依據(jù)產(chǎn)品溶解性和微生物限度選擇適宜的中性稀釋劑溶解和 稀釋，用直接接種法驗(yàn)證，

6、常用中性稀釋液或淋洗液。對(duì)于具有抑菌性樣品的驗(yàn)證方法，首先確定樣品的抑菌作用 抑細(xì)菌、真菌試驗(yàn)驗(yàn)證 ， 選擇敏感標(biāo)準(zhǔn)菌株對(duì)供試品抑菌活性去除效果檢查 陽(yáng)性菌回收試驗(yàn) 。常用的消除樣品抑 菌活性的方法如下：稀釋法：利用降低供試品的相對(duì)濃度，將樣品稀釋至最低抑菌濃度下進(jìn)行。如：取規(guī)定 量的樣品溶液至較大量的培養(yǎng)基中，使單位體積內(nèi)的樣品含量減少，至不含抑菌作用。薄膜過(guò)濾法：利用體積差異別離，通過(guò)薄膜過(guò)濾，微生物被截于濾膜，培養(yǎng)薄膜觀察有無(wú)微生物生長(zhǎng)。通常薄膜孔徑應(yīng)不大于0.45卩m直徑一般為 50?mm假設(shè)采用其他直徑的濾膜，沖洗量應(yīng)進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整。 濾器和濾膜在使用前采用適宜的方法進(jìn)行滅菌。 使用

7、時(shí)應(yīng) 保證濾膜在過(guò)濾前后的完整性。 水溶性供試液過(guò)濾前先將少量的沖洗液過(guò)濾以潤(rùn)濕濾膜。油類供試液其濾膜和濾器在使用前應(yīng)充分枯燥。供試液經(jīng)過(guò)濾膜過(guò)濾后，假設(shè)需要用沖洗液沖洗濾膜，每張濾膜每次沖洗量為100?ml?？倹_洗量不得超過(guò) 1000ml?；瘜W(xué)中和法：利用化學(xué) 生物專屬性滅活，常用中和劑或滅活方法有：對(duì)氨基苯甲酸、卵磷脂、聚山梨酯-80等。對(duì)化學(xué)中和劑不敏感的樣品，用酶中和，如3 -內(nèi)酰胺酶。聯(lián)合使用：將以上兩種或幾種方法組合運(yùn)用， 以消除樣品的抑菌性。 適用于抑菌作用較 強(qiáng)的中西藥制劑。其次按照以下要求制備 3 組樣品：樣品組：選擇以上適當(dāng)?shù)姆椒ㄖ泻蜆悠罚瑓⒓由倭框?yàn)證微生物接種量少于 10

8、0?cfu 。對(duì)照組： 0.1%蛋白胨或 pH7.0 無(wú)菌氯化鈉 - 蛋白胨緩沖液 ,加少量微生物 接種量少于 100?cfu 。陽(yáng)性對(duì)照組：將試驗(yàn)菌株直接接種于培養(yǎng)基中 接種量少于 100cfu 。最后結(jié)果分析如下：樣品組與對(duì)照組微生物生長(zhǎng)數(shù)量相似， 說(shuō)明中和劑的中和方式有效消除了樣品的抑菌性 即有效性 ，如果對(duì)照組與陽(yáng)性對(duì)照組的微生物數(shù)量相似， 說(shuō)明樣品預(yù)處理、 消除樣品抑菌 性的方法、 檢測(cè)程序和培養(yǎng)條件等均不影響微生物生長(zhǎng) 即無(wú)毒性 。樣品如無(wú)抑菌性， 省去 對(duì)照組試驗(yàn)， 樣品組與陽(yáng)性對(duì)照組直接比擬。 樣品組微生物生長(zhǎng)數(shù)量不及陽(yáng)性對(duì)照組微生物 生長(zhǎng)數(shù)量， 說(shuō)明樣品的預(yù)處理、 試驗(yàn)用器具

9、材料、 培養(yǎng)條件等方面存在對(duì)微生物生長(zhǎng)不利的 因素。為考查驗(yàn)證方法的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性，驗(yàn)證至少需 3 個(gè)不同批次的同類樣品，分別進(jìn)行 3 次驗(yàn)證試驗(yàn)。無(wú)菌檢查方法驗(yàn)證試驗(yàn)設(shè)計(jì)薄膜過(guò)濾法： 按照藥典的要求取每種培養(yǎng)基規(guī)定接種的樣品總量按薄膜過(guò)濾法過(guò)濾、 沖 洗，在最后一次的沖洗液中參加小于 100cfu 的試驗(yàn)菌，過(guò)濾。取出濾膜接種至硫乙醇酸鹽 流體培養(yǎng)或改良馬丁培養(yǎng)基中，或?qū)⑴囵B(yǎng)基加至濾桶內(nèi)。另取一裝有同體積培養(yǎng)基的容器， 參加等量試驗(yàn)菌，作為對(duì)照。按照藥典的要求的溫度和時(shí)間進(jìn)行培養(yǎng)。直接接種法： 取符合直接接種法培養(yǎng)基用量要求的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基 8 管，分別接 入小于 100cfu 的金黃

10、色葡萄球菌、 大腸埃希菌、 枯草芽孢桿菌、 生孢梭菌各 2 管 ;取符合直 接接種法培養(yǎng)基用量要求的改良馬丁培養(yǎng)基 4 管，分別接入小于 100?cfu 的白色念珠菌、 黑 曲霉各 2管。其中1管接入每支培養(yǎng)基規(guī)定的供試品接種量， 另1管作為對(duì)照， 按照藥典的 要求的溫度和時(shí)間進(jìn)行培養(yǎng)。結(jié)果判斷同對(duì)照管比擬，如含供試品各容器中的試驗(yàn)菌均生長(zhǎng)良好，那么說(shuō)明驗(yàn)證通過(guò); 如含供試品的任一容器中的試驗(yàn)菌生長(zhǎng)微弱、 緩慢或不生長(zhǎng)，驗(yàn)證失敗，應(yīng)采用增加沖洗量、增加培 養(yǎng)基的用量、使用中和劑和滅活劑、 更換濾膜等方法，消除供試品的抑菌作用，重新進(jìn)行驗(yàn) 證。新GMF檢查重點(diǎn)首先要檢查方法驗(yàn)證方案設(shè)計(jì)的科學(xué)性和

11、完整性， 是否有與藥典方法相悖的地方， 尤其 是產(chǎn)品本身的抑菌性，檢查方法的選擇，是直接接種法還是薄膜過(guò)濾法等。無(wú)菌檢查方法驗(yàn)證的硬件是否具備及是否已經(jīng)進(jìn)行了相關(guān)確實(shí)認(rèn)。 如使用黑曲霉菌是否 具有生物平安柜并進(jìn)行確認(rèn)， 無(wú)菌室確實(shí)認(rèn)及日常監(jiān)測(cè)， 培養(yǎng)箱的型號(hào)及數(shù)量和進(jìn)行確認(rèn)的 情況等，智能集菌器、全封閉無(wú)菌試驗(yàn)過(guò)濾培養(yǎng)器的型號(hào)、性能，濾膜是否符合規(guī)定等。驗(yàn)證中各個(gè)環(huán)節(jié)有關(guān)數(shù)據(jù)的真實(shí)性， 如產(chǎn)品本身抑菌性試驗(yàn)數(shù)據(jù)， 菌種回收率和培養(yǎng)基 適用性和靈敏度檢查數(shù)據(jù)， 菌種的傳代、 銷毀和使用記錄， 無(wú)菌檢查操作記錄、 培養(yǎng)記錄等。無(wú)菌檢查中偏差的處理是否真的找到了根本原因， 是否在沒有確切的原因前就對(duì)

12、樣品重 新檢查并依據(jù)新的檢查結(jié)果放行產(chǎn)品。驗(yàn)證的方法與無(wú)菌檢查操作規(guī)程和無(wú)菌檢查記錄是否完全一致，如操作步驟、 檢查方法、檢查環(huán)境、試驗(yàn)耗材均需與實(shí)際檢查操作規(guī)程及驗(yàn)證過(guò)程完全相符。為了考查驗(yàn)證方法的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性，驗(yàn)證時(shí)是否至少采用了3 個(gè)不同批次的同類樣品，分別進(jìn)行了 3 次驗(yàn)證試驗(yàn)。使用新的濾膜或過(guò)濾器 不同廠家或批號(hào)、 型號(hào) 是否重新進(jìn)行樣品試驗(yàn)組、 蛋白胨對(duì)照 組和陽(yáng)性對(duì)照組的驗(yàn)證確認(rèn)。除非樣品不能采用過(guò)濾的方法難溶解 ，企業(yè)是否采用全封閉的薄膜過(guò)濾法。菌液的保存條件和保存期限是否符合藥典的要求， 對(duì)于黑曲霉孢子懸液是否有驗(yàn)證的資 料。無(wú)菌檢查的考前須知 培養(yǎng)基的適用性檢查包括培養(yǎng)基

13、的無(wú)菌性檢查和培養(yǎng)基的靈敏度檢查。 中國(guó)藥典附錄中規(guī)定的檢驗(yàn)數(shù)量不包括陽(yáng)性對(duì)照用樣品量，雖然附錄另處有專門說(shuō)明，仍然容易忽略。無(wú)菌檢查時(shí)應(yīng)強(qiáng)調(diào)“檢驗(yàn)數(shù)量， 主要是保證試驗(yàn)結(jié)果的代表性， 而陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)和驗(yàn) 證時(shí)僅須滿足“檢驗(yàn)量總量要求即可， 以保證試驗(yàn)結(jié)果的可靠性， 驗(yàn)證試驗(yàn)可以由此減少 大量的樣品 ;工作菌株的傳代次數(shù)不得超過(guò) 5 代，以防止過(guò)度的傳代增加菌種變異的風(fēng)險(xiǎn)。這里“代的定義是指， 活的培養(yǎng)物接種到微生物生長(zhǎng)的新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)， 任何亞培養(yǎng)的形式 均被認(rèn)為是轉(zhuǎn)種或傳代一次。菌液參加，按規(guī)定應(yīng)在最后一次沖洗液中參加陽(yáng)性菌液，主要是考慮過(guò)濾器的有效性。 過(guò)濾器的有效性應(yīng)由提供企業(yè)控制，

14、用戶可采用適當(dāng)方法抽查 如檢查陽(yáng)性菌液通過(guò)濾筒的 流出液 。實(shí)驗(yàn)室菌種的處理和保存的程序應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)化，以盡可能減少菌種污染和變異。 試驗(yàn)時(shí)菌懸液并不是只要活的菌體就行， 而是要保持旺盛的生命力， 所以菌懸液存放時(shí)間不能太長(zhǎng)。菌液制備后假設(shè)在室溫下放置，應(yīng)在2?h內(nèi)使用，假設(shè)保存在 28C,可在24?h內(nèi)使用。黑曲霉孢子懸液可保存在28 C,在驗(yàn)證過(guò)的貯存期內(nèi)使用。薄膜過(guò)濾法采用大樣品量集菌的方法，具有代表性，不易漏檢，儀器操作相對(duì)簡(jiǎn)單。該系統(tǒng)是全封閉過(guò)濾系統(tǒng)，防止了操作過(guò)程中外源性微生物的污染，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的可信性影響較小。因此無(wú)菌試驗(yàn)采用薄膜過(guò)濾法還是直接接種法并不依賴于驗(yàn)證結(jié)果，而是取決于樣品的特性，如能采用過(guò)濾的方法均應(yīng)采用薄膜過(guò)濾法檢查。假設(shè)樣品含有抑菌成分，當(dāng)采用薄膜過(guò)濾法時(shí)，應(yīng)先將供試液稀釋后在過(guò)濾，這樣可以減少濾膜對(duì)樣品的吸附，減少?zèng)_洗量，進(jìn)而減少微生物的損失或傷害。無(wú)菌檢查應(yīng)作為穩(wěn)定性考察的工程進(jìn)行，以便對(duì)產(chǎn)品有效期的制定和合理確實(shí)定儲(chǔ)存條件提供重要的依據(jù)。陽(yáng)性結(jié)果的調(diào)查：在無(wú)菌檢查中必須小心防止任何可能污染樣品的行為。一旦發(fā)現(xiàn)微生物生長(zhǎng)，該批產(chǎn)品就被判斷非無(wú)菌，必須進(jìn)行調(diào)查。只有可以造成微