微生物學實驗講義

1、實驗四 顯微測微技術及細菌運動性觀察一、目的要求1了解測微尺的構造和使用，學會測量微生物細胞大小的方法。 2學習懸滴法觀察細菌運動性技術二、實驗原理一 顯微測微技術 微生物細胞的大小是微生物根本的形態(tài)特征，也是分類鑒定的依據(jù)之一。其大小的 測量需在顯微鏡下用目鏡測微尺來進行，但由于測量的是放大后的圖像，故目鏡測微尺 在不同放大倍率下每格實際代表的長度也隨之變化，因此，需用物鏡測微尺來校正在不 同放大倍率下目鏡測微尺每格所代表的實際長度。物鏡測微尺是中央刻有精確刻度的載玻片，一般是將 1 mm 等分為 100 格，每格 長0.01 mm，即10 pm,它不直接用于測量細胞大小，而是用于校正目鏡測

2、微尺的每格 的相對長度。目鏡測微尺是一個可放人接目鏡的直徑均為 1.75 mm的圓形玻片，其中央 有精確的等分刻度 有50格和100格兩種測量時，需將其放人接目鏡中的隔板上， 用以 測量經(jīng)顯微鏡放大后的細胞物象。二 細菌運動性 在顯微鏡下觀察細菌的運動性，也可以初步判斷細菌是否有鞭毛。通常使用壓滴法 或懸滴法觀察細菌的運動性。觀察時，要適當減弱光線，增加反差，如果光線很強，細 菌和周圍的液體就難以區(qū)分。三、實驗器材1 活材料：培養(yǎng) 12-16h 的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、啤酒酵母 2試劑：香柏油、二甲苯、凡士林等。3器材：目鏡測微尺，物鏡測微尺、凹載玻片、蓋玻片、鑷子、接種環(huán)、滴管、擦鏡 紙

3、、顯微鏡。四、操作步驟( ) 顯微測微技術1裝目鏡測微尺： 取出接目鏡，把目鏡上的透鏡旋下，將目鏡測微尺刻度朝下放在目 鏡鏡筒內(nèi)的隔板上，然后旋上目鏡透鏡，再將目鏡插人鏡筒內(nèi)。2校正目鏡測微尺(1) 將物鏡測微尺刻度面朝上放在顯微鏡載物臺上(2) 先用低倍鏡觀察，將鏡臺測微尺有刻度的局部移至視野中央，調(diào)節(jié)焦距，當清晰 地看到鏡臺測微尺的刻度后，轉(zhuǎn)動目鏡使目鏡測微尺刻度與物鏡測微尺的刻度平行。利 用移動器移動物鏡測微尺，使兩尺的第一條刻度線相重合，再向右尋找另外兩條重合的 刻度線，分別數(shù)出兩重合線之間物鏡測微尺和目鏡測微尺所占的格數(shù)，由以下公式算出 目鏡測微尺每格所代表的長度。目鏡測微尺每格長度

4、二(兩測微尺重合線間鏡臺測微尺格數(shù)10) /兩測微尺重合線間目鏡測微尺格數(shù)用同樣的方法換成高倍鏡進行校正， 記錄并計算在每種倍率下目鏡測微尺每一格所 代表的長度。(3) 酵母細胞大小的測定 目鏡測微尺校正完畢后，取下鏡臺測微尺，換上酵母水浸片，在不同倍率下測量菌體的長度和寬度，記錄測定值，并計算出酵母的長、寬值。 (5-1 0個取平均)(二) 懸滴法觀察細菌運動性1 在潔凈蓋玻片周圍涂少許凡士林。2在蓋玻片中央滴一小滴菌液，或用接種環(huán)取1-2 環(huán)菌液置于中央。3將凹玻片反轉(zhuǎn)，使凹窩中心對準蓋玻片上的菌液滴，液滴不得與凹玻片接觸，以接 種環(huán)柄輕壓使蓋玻片與凹玻片粘在一起，液滴處于封閉的小室中，防

5、止液滴枯燥和氣流 的影響。4小心將凹玻片翻轉(zhuǎn)過來，使菌滴仍懸浮在蓋玻片下和凹窩中心。5先用低倍鏡找到懸滴邊緣，再用高倍鏡觀察。觀察時光線要調(diào)得暗一些。用懸滴法分別觀察大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的運動性。 細菌的運動有一定的前進 方向，并可轉(zhuǎn)彎，極生單鞭毛菌類多為直線運動，周生鞭毛菌類多作波浪式運動。五、考前須知1檢查細菌運動的載玻片和蓋玻片都要潔凈無油，否那么將影響細菌的運動 2制水封片時菌液不可加得太多，過多的菌液會在蓋玻片下流動，因而在視野內(nèi)只見 大量的細菌朝一個方向運動，從而影響了對細菌正常運動的觀察。六、實驗結果1報告測微計算過程與結果。2 描述各菌運動方式。丨七、思考題1為什么更換不同

6、放大倍數(shù)的目鏡或物鏡時，必須用鏡臺測微尺重新對目鏡測微尺進 行校正？2在不改變目鏡和目鏡測微尺，而改用不同放大倍數(shù)的物鏡來測定同一細菌的大小， 測定結果是否相同？為什么？實驗五 酵母菌個體、群體形態(tài)觀察，血球板顯微鏡計數(shù)技術一、目的要求1學會使用顯微鏡觀察酵母菌形態(tài)的方法。 2觀察并掌握酵母菌的菌落特征、個體形態(tài)、生長及繁殖方式。 3學會區(qū)別死活菌的方法。4了解血球計數(shù)板計數(shù)的原理，學會測定酵母細胞總數(shù)方法。二、實驗原理用血球計數(shù)板在顯微鏡下直接計數(shù)是一種常用的微生物計數(shù)方法。血球計數(shù)板是一 塊特制的厚載玻片，其上由四條槽構成三個平臺，中間較寬的平臺又被一短橫槽隔成兩 半，每一邊的平臺上各刻有

7、一個方格網(wǎng)，每個方格網(wǎng)共分為 9 個大方格，中間的大方格 即為計數(shù)室。計數(shù)室的刻度一般有兩種規(guī)格，一種是一個大方格分成 16 個中方格，每 個中方格又分成25個小格即16&5，另一種是一個大方格分成 25個中方格，每個中 方格又分為16個小方格即25X16，但無論是哪一種規(guī)格的計數(shù)板，每一個大方格中的 小方格都是400個，每一個大方格邊長為1 mm，那么每一個大方格的面積為1 mm2，蓋 上蓋玻片后，蓋玻片與載玻片之間的高度為 0.1m m，所以計數(shù)室的容積為0.1 mm3。計數(shù)時，如果使用16X25的計數(shù)板，要按對角線方位取左上、左下、右上、右下上 述 4個中格進行計數(shù) 即計數(shù) 10

8、0個小格中的酵母細胞數(shù) ，如果使用 25X16 規(guī)格的計數(shù) 板，那么除了計數(shù)上述 4 個中格外，還要計數(shù)中央的 1 個中格，即計數(shù) 80 個小格中的酵 母細胞數(shù)，分別按下述公式計算出酵母細胞數(shù)。116 2X格的血球計數(shù)板計算公式：1 mL酵母細胞數(shù)=A/4 X6X04X稀釋倍數(shù)225 1X格的血球計數(shù)板計算公式：1mL酵母細胞數(shù)=A/5 X5 X04 X稀釋倍數(shù)三、實驗器材啤酒酵母菌懸液，顯微鏡，血球計數(shù)板，載玻片，蓋玻片，接種環(huán)，呂氏美藍染液。四、操作步驟一 血球板計數(shù)1 菌懸液的制備：為便于計數(shù)，對樣品進行適當稀釋，稀釋程度以每小格內(nèi)含510 個酵母為宜，可采用 10 倍系列稀釋法。2加菌

9、懸液樣品：將清潔枯燥的血球計數(shù)板蓋上蓋玻片，再用無菌的毛細滴管將搖勻 的菌懸液由蓋玻片邊緣滴一小滴，讓菌液沿縫隙靠毛細滲透作用自動進入計數(shù)室，用吸 水紙吸去多余水液。3 顯微鏡計數(shù)：加樣后靜止5min，然后將血球計數(shù)板置于顯微鏡載物臺上，先用低倍 鏡找到計數(shù)室所在位置，然后換成高倍鏡進行計數(shù)，計數(shù)時，對位于線上酵母菌，可采 取只記數(shù)兩條邊的方法， 當酵母菌芽體到達母細胞大小的二分之一時， 可記作兩個細胞。4計數(shù)完畢，將計數(shù)板在水龍頭下沖洗干凈，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用 電吹風吹干。二 死活菌鑒別 1在干凈載玻片中央加一滴呂氏美藍染色液，以無菌操作用接種環(huán)挑取少量酵母菌體 放于美藍液中

10、，混合均勻。2取一塊蓋玻片，先將一邊與菌液接觸，然后慢慢將蓋玻片放下 以免產(chǎn)生氣泡 ，使其 蓋在菌液上，將多余菌液用吸水紙吸干。3將載片置于載物臺上，先用低倍鏡然后用高倍鏡觀察酵母的形態(tài)和出芽情況，并根 據(jù)顏色來區(qū)別死活細胞。4染色約 0.5 h 后再進行觀察，注意死細胞數(shù)量是否增加。五、實驗結果1結果繪圖說明你所觀察到的酵母形態(tài)特征。2報告計數(shù)結果。六、思考題根據(jù)你的體會， 說明用血球計數(shù)板計數(shù)的誤差主要來自哪些方面？應如何盡量減少 誤差？力求準確？實驗六 放線菌個體、群體形態(tài)觀察一、目的要求1學習并掌握放線菌形態(tài)的顯微鏡觀察方法。2觀察放線菌的菌落特征、個體形態(tài)及其孢子的形態(tài)。二、實驗原理

11、放線菌一般由分枝狀菌絲組成，它的菌絲可分為基內(nèi)菌絲營養(yǎng)菌絲 、氣生菌絲或孢子絲三種。放線菌生長到一定階段，大局部氣生菌絲分化成孢子絲，通過橫割分列的 方式產(chǎn)生成串的分生孢子。孢子絲形態(tài)多樣，有直、波曲、鉤狀、螺旋狀、輪生等多種 形態(tài)。孢子也有球形、橢圓形、桿狀和瓜子狀等等。它們的形態(tài)構造都是放線菌分類鑒 定的重要依據(jù)。放線菌的菌落早期絨狀同細菌菌落月牙狀相似，后期形成孢子菌落呈粉狀、枯燥， 有各種顏色呈同心圓放射狀。三、實驗材料1菌種。o 嚴去甘2培養(yǎng)基 。3器皿：培養(yǎng)皿，載玻片、蓋玻片、無菌滴管、鑷子、接種環(huán)、小刀或刀片 水浴鍋，顯微鏡，超凈工作臺，恒溫培養(yǎng)箱。四、操作步驟一 插片培養(yǎng)法1.

12、 取融化并保溫在50C的高氏1號培養(yǎng)基15-20ml，倒入9厘米的無菌皿中，冷凝成 平板。2. 用接種環(huán)取放線菌孢子于無菌水中，制成孢子懸液。3. 用無菌吸管吸孢子懸液 1 滴于平板上，用無菌刮鏟涂抹均勻。4. 取無菌蓋玻片，傾斜的插入培養(yǎng)基中，每皿插入5-8 片。5. 將平板倒置在28-30 C溫箱中，培養(yǎng)3-4 d。6. 取插片一張，用擦片紙擦去玻片一面的放線菌，微熱固定。7 在蓋玻片上，滴加石炭酸復紅染色 1 min，水洗風干。 8鏡檢。取干凈載玻片一張，將染色的蓋玻片面向下放在載玻片上。在油鏡下觀察放 線菌的菌絲 包括基內(nèi)菌絲和氣生菌絲 、孢子絲 有直形、波狀菜、螺旋狀等 和孢子形 態(tài)

13、。二 印片法1 制備菌懸液和平板培養(yǎng)基同 一 。2取菌懸液一環(huán)，在平板培養(yǎng)基上劃線 6-7次，置于28-30 C的溫箱中培養(yǎng)3 d。 3取生長好的放線菌的培養(yǎng)皿，用接種針將菌苔和培養(yǎng)基切割成小方塊，并用針穿過 培養(yǎng)基挑起。4取一張干凈載玻片，通過燈焰稍微加熱，然后用針將菌苔外表輕輕地在玻片的不同 部位壓幾次，在壓菌苔時應防止和玻片摩擦攪亂印痕，影響觀察。5將印片在燈焰上加熱固定，用石炭酸復紅染色1min，水洗，風干。6鏡檢。先用低倍鏡觀察，找到印痕，更換高倍鏡觀察，再用油鏡觀察放線菌的菌絲 體、孢子絲及孢子的形態(tài)，并繪圖。五、實驗結果繪圖描述放線菌形態(tài)六、思考題鏡檢時，你如何區(qū)分放線菌的基內(nèi)菌

14、絲和氣生菌絲？實驗七 霉菌個體、群體形態(tài)觀察一、目的要求掌握觀察霉菌形態(tài)的根本方法，并觀察其形態(tài)特征。二、實驗原理 霉菌可產(chǎn)生復雜分枝的菌絲體，分基內(nèi)菌絲和氣生菌絲，氣生菌絲生長到一定階段分化產(chǎn)生繁殖菌絲，由繁殖菌絲產(chǎn)生孢子。霉菌菌絲體 尤其是繁殖菌絲 及孢子的形態(tài) 特征是識別不同種類霉菌的重要依據(jù)。 霉菌菌絲和孢子的寬度通常比細菌和放線菌粗得 多約為3-10叩，常是細菌菌體寬度的幾倍至幾十倍，因此，用低倍顯微鏡即可觀察。 觀察霉菌的形態(tài)有多種方法，常用的有以下三種：直接制片觀察法： 是將培養(yǎng)物置于乳酸石炭酸棉藍染色液中， 制成霉菌制片鏡檢。此染色液制成的霉菌標本片其特點是：a細胞不變形；b具

15、有殺菌防腐作用，且不易干 燥，能保持較長時間；c溶液本身呈藍色，有一定染色效果。載玻片培養(yǎng)觀察法：此法是接種霉菌孢子于載玻片上的適宜培養(yǎng)基上，培養(yǎng)后用顯 微鏡觀察。這種方法可觀察霉菌自然生長狀態(tài)下的形態(tài)。玻璃紙培養(yǎng)觀察法：為了得到清晰、完整、保持自然狀態(tài)的霉菌形態(tài)還可利用玻璃 紙透析培養(yǎng)法進行觀察。此法是利用玻璃紙的半透膜特性及透光性，將霉菌生長在覆蓋 于瓊脂培養(yǎng)基外表的玻璃紙上，然后將長菌的玻璃紙剪取一小片，貼放在載玻片上用顯 微鏡觀察。三、實驗器材曲霉Aspergillus sp.，青霉Penicillium sp.，根霉Rhizopus sp.，乳酸石炭 酸棉藍染色液，查氏培養(yǎng)基平板，無

16、菌吸管，載玻片，蓋玻片，解剖針，鑷子，濾紙等。四、操作步驟一一般觀察法于潔凈載玻片上，滴一滴乳酸石炭酸棉藍染色液，用解剖針從霉菌菌落的邊緣處取 小量帶有孢子的菌絲置染色液中，再細心地將菌絲挑散開，然后小心地蓋上蓋玻片，注 意不要產(chǎn)生氣泡。置顯微鏡下先用低倍鏡觀察，必要時再換高倍鏡。二載玻片觀察法1.°C滅菌20min或干熱滅菌，備用。2將 6-7 -1 cm2 的瓊脂塊，用刀尖鏟起瓊脂塊放在已滅菌的培養(yǎng)皿內(nèi)的載玻片上，每片 上放置 2 塊。3.用滅菌的尖細接種針或裝有柄的縫衣針，取肉眼方能看見的一點霉菌孢子，輕 輕點在瓊脂塊的邊緣上，用無菌鑷子夾著立在載玻片旁的蓋玻片蓋在瓊脂塊上，再

17、蓋上 皿蓋。 4.在培養(yǎng) 皿的濾紙上，加無菌的20%甘油數(shù)毫升，至濾紙濕潤即可停加。將培養(yǎng)皿置 28 C培養(yǎng) 一定時間后，取出載玻片置顯微鏡下觀察。五、實驗結果 繪圖說明你所觀察到的霉菌形態(tài)特征。六、思考題比擬四種霉菌形態(tài)上的異同。實驗八 培養(yǎng)基的配制及濕熱滅菌；玻璃器皿的干熱滅菌、目的要求 1明確培養(yǎng)基配制的原理，掌握制備培養(yǎng)的根本技術。 2學習并掌握微生物實驗室常用的兩種滅菌方法 濕熱滅菌法和干熱滅菌法。二、實驗原理人工配制的適合微生物生長繁殖或積累代謝產(chǎn)物的混合營養(yǎng)基質(zhì)稱為培養(yǎng)基。 培養(yǎng) 基含有微生物所需的 6大營養(yǎng)要素 水分、碳源、氮源、能源、礦質(zhì)元素和生長素 和適 宜的pH、滲透壓及

18、氧化復原電位等。設計和制作培養(yǎng)基是研究微生物生命活動規(guī)律和 利用微生物進行工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)必須的重要根底工作。培養(yǎng)基成分與配比適宜與否，對微 生物生長發(fā)育、物質(zhì)代謝、發(fā)酵產(chǎn)物積累和生產(chǎn)工藝都有很大影響。良好的培養(yǎng)基能充 分發(fā)揮菌種的生物合成能力，以到達最正確的生產(chǎn)效果；相反，假設培養(yǎng)基成分、配比 或原料不適宜，菌種的生長繁殖及發(fā)酵效果就差。不同微生物的營養(yǎng)要求雖具有一定共 性，但也存在許多差異。只有根據(jù)微生物的營養(yǎng)理論，結合研究對象的特殊營養(yǎng)要求、 代謝特點及培養(yǎng)目的，才能設計或選擇出適宜的培養(yǎng)基。在實驗室中配制的適合微生物生長繁殖或累積代謝產(chǎn)物的任何營養(yǎng)基質(zhì)， 都叫做培 養(yǎng)基Media。由于各類

19、微生物對營養(yǎng)的要求不同， 培養(yǎng)目的和檢測需要不同，因而培養(yǎng) 基的種類很多。我們可根據(jù)某種標準，將種類繁多的培養(yǎng)基劃分為假設干類型。在微生物實驗室中常用滅菌消毒方法有： 1干熱滅菌法：火焰滅菌 灼燒滅菌 、干熱滅菌 2濕熱滅菌：巴氏消毒、煮沸消毒、高壓蒸汽滅菌、間歇加熱滅菌、實罐滅菌。 3過濾除菌 4放射線滅菌其中，干熱天菌、高壓蒸汽滅菌方法主要是通過升溫使蛋白質(zhì)變性從而到達殺死微 生物的效果三、實驗器材 1器材：試管、三角瓶、燒杯、量筒、玻璃棒、天平、牛角匙、高壓蒸汽滅菌鍋、pH試紙、牛皮紙、記號筆、麻繩、吸管、培養(yǎng)皿、電烘箱、鑷子等。2試劑：牛肉膏、蛋白胨、NaCI、瓊脂等。四、操作步驟一培

20、養(yǎng)及的配制 稱量f溶化f調(diào)pH過濾f分裝f加塞f包扎f火菌f無菌檢查。1按照培養(yǎng)基的配方，稱取各種原料，依次參加使其溶解，最后補足所需水分。對蛋 白胨、肉膏等物質(zhì)，需加熱溶解，加熱過程所蒸發(fā)的水分，應在全部原料溶解后加水補 足。配制固體培養(yǎng)基時，先將上述已配好的液體培養(yǎng)基煮沸，再將稱好的瓊脂參加，繼 續(xù)加熱至完全融化。并不斷攪拌，以免瓊脂糊底燒焦。2 調(diào)節(jié)pH值。用pH試紙或pH電位計、氫離子濃度比色計測試培養(yǎng)基的pH值，如 不符合需要，可用10%HCI或10%NaOH進行調(diào)節(jié)，直到調(diào)節(jié)到配方要求的pH值為止。 3過濾。用濾紙、紗布或棉花趁熱將已配好的培養(yǎng)基過濾。用紗布過濾時，最好折疊 成六層

21、，用濾紙過濾時，可將濾紙折疊成瓦棱形，鋪在漏斗上過濾。 4分裝。已過濾的培養(yǎng)基應進行分裝。如果要制作斜面培養(yǎng)基，須將培養(yǎng)基分裝于試 管中。如果要制作平板培養(yǎng)基或液體、半固體培養(yǎng)基，那么須將培養(yǎng)基分裝于錐形瓶內(nèi)。 分裝時，一手捏松彈簧夾，使培養(yǎng)基流出，另一只手握住幾支試管或錐形瓶，依次接取 培養(yǎng)基。分裝時，注意不要使培養(yǎng)基粘附管口或瓶口，以免浸濕棉塞引起雜菌污染。裝 入試管的培養(yǎng)基量，視試管和錐形瓶的大小及需要而定。一般制作斜面培養(yǎng)基時，每只15X150毫米的試管，約裝34ml1/41/3試管高度，如制作深層培養(yǎng)基，每只20>220 毫米的試管約裝1215ml。每只錐形瓶裝入的培養(yǎng)基，一般

22、以其容積的一半為宜。 5加棉塞。分裝完畢后，需要用棉塞堵住管口或瓶口。堵棉塞的主要目的是過濾空氣，防止污 染。棉塞應采用普通新鮮、枯燥的棉花制作，不要用脫脂棉，以免因脫脂棉吸水使棉塞 無法使用。制作棉塞時， 要根據(jù)棉塞大小將棉花鋪展成適當厚度， 揪取手掌心大小一塊， 鋪在左手拇指與食指圈成的圓孔中，用右手食指插入棉花中部，同時左手食指與姆指稍 稍緊握，就會形成 1 個長棒形的棉塞。棉塞作成后，應迅速塞入管口或瓶口中，棉塞應 緊貼內(nèi)壁不留縫隙，以防空氣中微生物沿皺折侵入。棉塞不要過緊過松，塞好后，以手 提棉塞、管、瓶不下落為適宜。棉塞的 2/3 應在管內(nèi)或瓶內(nèi)，上端露出少許棉花便于拔 取。塞好棉

23、塞的試管和錐形瓶應蓋上厚紙用繩捆札，準備火菌。 6制作斜面培養(yǎng)基和平板培養(yǎng)基培養(yǎng)基火菌后， 如制作斜面培養(yǎng)基和平板培養(yǎng)基， 須趁培養(yǎng)基未凝固時進行。 1 制作斜面培養(yǎng)基。 在實驗臺上放 1 支長 0.5 1 米左右的木條， 厚度為 1 厘米左右。 將試 管頭部枕在木條上，使管內(nèi)培養(yǎng)基自然傾斜，凝固后即成斜面培養(yǎng)基。2 制作平板培養(yǎng)基。將剛剛滅過菌的盛有培養(yǎng)基的錐形瓶和培養(yǎng)皿放在實驗臺上，點 燃酒精燈，右手托起錐形瓶瓶底，左手拔下棉塞，將瓶口在酒精燈上稍加灼燒，左手打 開培養(yǎng)皿蓋，右手迅速將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，每皿約倒入10ml，以鋪滿皿底為度。鋪放培養(yǎng)基后放置 15min 左右，待培養(yǎng)基凝固后

24、，再 5 個培養(yǎng)皿一疊，倒置過來，平放 在恒溫箱里， 24h 后檢查，如培養(yǎng)基末長雜菌，即可用來培養(yǎng)微生物。二干熱滅菌裝入待滅菌物品一升溫一恒溫一降溫一開箱取物。用干熱空氣滅菌的方法。常用的 設備是電熱枯燥箱。其法是先將洗凈并晾干的玻璃器皿用包裝紙包裝好，置于枯燥箱中 注意需滅菌的物品不要靠箱壁附近，不要過擠 。翻開電源開關，調(diào)節(jié)升溫旋鈕，使其 緩慢升溫至60-70E時，開動鼓風開關，鼓風5-10min,以促使器皿上及枯燥箱空間的水 氣排除。繼續(xù)轉(zhuǎn)動升溫旋鈕，使溫度升至 160-170C,維持2h?？刂茰囟鹊姆椒ㄊ钱斚?內(nèi)溫度升至160C時，應將溫度調(diào)節(jié)旋鈕緩慢地反方向轉(zhuǎn)動，當枯燥箱上的指示燈

25、紅燈 熄滅，綠燈亮時，再緩慢地來回轉(zhuǎn)動溫度調(diào)節(jié)旋鈕，使紅燈剛亮，綠燈剛滅處為止。這 樣，可繼續(xù)升溫約5-10 C,即可將溫度控制在165-170C。紅燈是加熱升溫的信號，綠 燈是切斷加熱電源的信號。 滅菌時間到了以后， 將溫度調(diào)節(jié)旋鈕按反時針方向轉(zhuǎn)動至 “0 點。關閉電源開關，待其冷卻至50E以下，方可取出滅菌器皿。絕對不可在高溫時翻開 箱門。另外，干熱滅菌時，定要專人看管，切勿同時干其他它事情，以免發(fā)生事故。三高壓蒸汽滅菌加水裝物品加蓋加熱排冷空氣加壓恒壓降壓回零排汽取物 無菌檢查。在一個大氣壓下，蒸汽的溫度只能到達 100C，當加壓時，隨壓力的增高溫度也上 升到100C以上，根據(jù)這一原理設

26、計了高壓滅菌罐。這是一個密閉的耐高壓高溫的金屬 容器，具有嚴密的蓋，容器內(nèi)的蒸汽不能漏出。由于連續(xù)加熱，蒸汽不斷增加，因而滅 菌器內(nèi)的壓力逐漸增大，同時也使容器內(nèi)的溫度隨壓力而升高。使用高壓滅菌器進行滅菌時，當壓力上升到 2 或 3 磅/英寸 2不得超過 5 磅/英寸 2 時，須緩緩翻開氣門，排除器內(nèi)的冷空氣，然后再關上氣門，使器內(nèi)的壓力再度升高。 按規(guī)定要求進行滅菌。假設冷空氣排不干凈時，那么壓力雖達規(guī)定數(shù)字，而其內(nèi)溫度卻實 際缺乏，會影響滅菌的效果。各種培養(yǎng)基、溶液、玻璃器皿、金屬器械、工作服、橡膠用品等均可用高壓滅菌器滅菌。通常用15磅/英寸22的壓力，在1213C溫度下經(jīng)15-20mi

27、n,即可殺死所有微生 物及其芽孢，到達滅菌目的。被滅菌物品的容量過大時，可相應的延長滅菌時間。五、實驗結果寫出你所用過的 3-5 種消毒滅菌方法。六、思考題1高壓蒸汽滅菌之前，為什么要將鍋內(nèi)冷空氣排盡？滅菌完畢后，為什么待壓力降至“0才能翻開排氣閥，開蓋取物？2在使用高壓蒸汽滅菌鍋時，如何杜絕一切不平安的因素？實驗九 微生物的別離和純化、目的要求1學習但平板的方法。2了解微生物別離和純化的原理。 3掌握常用的別離純化微生物的方法。二、實驗原理從混雜微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過程稱為微生物別離與 純化。本實驗采用平板別離法：該方法操作簡便，普遍用于微生物的別離與純化，其包 括兩

28、個方面： 1選擇適合于待別離微生物的生長條件，如營養(yǎng)成分、酸堿度、溫度和氧等要求，或 參加某種抑制劑造成只利于該微生物生長，而抑制其他微生物生長的環(huán)境，從而淘汰一 些不需要的微生物。2微生物在固體培養(yǎng)基生長形成的單個菌落可以是一個細胞繁殖而成的集合體，因此 可通過挑取單菌落而獲得一種純培養(yǎng)。 獲得單個菌落的方法可通過稀釋涂布平板或平板 劃線等計數(shù)來完成的。值得指出的是，從微生物群體中經(jīng)別離生長在平板上的單個菌落 并不一定保證是純培養(yǎng)。因此，純培養(yǎng)確實定除觀察其菌落特征外，還要結合顯微鏡檢 測個體形態(tài)特征后才能確定， 有些微生物的純培養(yǎng)要經(jīng)過一系列別離與純化過程和多種 特征鑒定才能得到。純培養(yǎng)確

29、實定： 1確定其菌落觀察特征； 2結合顯微鏡檢測個體形態(tài)特征確實定。三、實驗材料1培養(yǎng)基：高氏 I 號培養(yǎng)基，無氮培養(yǎng)基，豆芽汁培養(yǎng)基，查氏瓊脂培養(yǎng)基。 2試劑： 10%酚液，盛 9ml 無菌水的試管，鏈霉素和土樣 3儀器或其它用具：無菌玻璃涂棒、無菌吸管、接種環(huán)、無菌培養(yǎng)皿、顯微鏡、涂布 器等。四、方法步驟流程：倒平板f制備梯度稀釋液f涂布或劃線法f培養(yǎng)f挑單菌落f保存。一平板涂布法1 倒平板。將培養(yǎng)基加熱溶化待冷至 5560C時，分別倒平板，每種培養(yǎng)基倒 3-5皿。 倒平板的方法：右手持盛培養(yǎng)基的試管或三角瓶置火焰旁邊，用左手將試管塞或瓶塞輕 輕地撥出，試管或瓶口保持對著火焰； 然后左手拿

30、培養(yǎng)皿并將皿蓋在火焰附近翻開一縫， 迅速倒人培養(yǎng)基約15ml，加蓋后輕輕搖動培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基均勻分布在培養(yǎng)皿底部， 然后平置于桌面上，待凝后即為平板。2. 制備土壤稀釋液。稱取土樣lg，放入盛10ml無菌水并帶有玻璃珠的三角燒瓶中， 振搖約20min，使土樣與水充分混合，將細胞分散。用一支lml無菌吸管從中吸取1ml 土壤懸液參加盛有 9ml 無菌水的大試管中充分混勻， 然后用無菌吸管從此試管中吸取 lml 參加另一盛有 9ml 無菌水的試管中，混合均勻，以此類推制成 10-1、10-2、10-3、10-4、 10-5、10-6 不同稀釋度的土壤溶液，注意：操作時管尖不能接觸液面，每一個稀釋度

31、換 一支試管。3. 涂布。將上述每種培養(yǎng)基的平板底面分別用記號筆寫上10-4、10-5和 10-6三種稀度，然后用無菌吸管分別由10-4、10-5和10-6三管土壤稀釋液中各吸取0.1或0.2ml,小心 地滴在對應平板培養(yǎng)基外表中央位置，右手拿無菌涂棒平放在平板培養(yǎng)基外表上，將菌 懸液先沿同心圓方向輕輕地向外擴展，使之分布均勻。室溫下靜置5I0min，使菌液浸入培養(yǎng)基。4. 培養(yǎng)。將培養(yǎng)基平板倒置于28C溫室中培養(yǎng)35d，肉膏蛋白胨平板倒置于37C溫 室中培養(yǎng) 23d。5 .挑菌落。將培養(yǎng)后長出的單個菌落分別挑取少許細胞接種到上述三種培養(yǎng)基斜面上， 分別置28r和37r溫室培養(yǎng)。假設發(fā)現(xiàn)有雜菌

32、，需再一次進行別離、純化，直到獲得 純培養(yǎng)。二平板劃線別離法1 . 倒平板。按稀釋涂布平板法倒平板，并用記號筆標明培養(yǎng)基名稱、樣品編號和實驗日期。2. 劃線。在近火焰處，左手拿皿底，右手拿接種環(huán)，挑取上述 10-l 的土壤懸液一環(huán)在 平板上劃線。劃線的方法很多，但無論采用哪種方法，其目的都是通過劃線將樣品在平 板上進行稀釋，使之形成單個菌落。3培養(yǎng)4挑菌落五、實驗結果分別記錄并描繪四大類微生物生長情況和培養(yǎng)特征六、思考題為什么要將培養(yǎng)皿倒置培養(yǎng)？實驗十 理化因素對微生物的影響；生長譜法測定微生物營養(yǎng)要求、目的要求1了解常用化學藥品對微生物的作用2了解紫外線對微生物的作用。3學習生長譜法測定微生物營養(yǎng)要求的根本原理和方法。二、實驗原理1、很多化學試劑有抑制或殺死微生物的作用 抑菌劑、消毒劑 ，不同的微生物對不同的 化學消毒劑或抑菌劑的反響不同。此外，濃度、作用時間、環(huán)境條件不同，效果也不相 同。有些消毒劑在濃度極低的條件下，反而有刺激微生物的作用。故殺菌劑的濃度及作 用時間確實定是重要的，應試驗確定。2、日光是一種復色光，有殺菌作用，許多微生物在日光的直接照射下易于死亡。紫外 線對微生物也有明顯的致死作用。紫外線對細胞的有害