細(xì)胞及細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)

1、實(shí)驗(yàn)一 細(xì)胞的凝集反應(yīng)1、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私饧?xì)胞膜的表面結(jié)構(gòu)；2、 實(shí)驗(yàn)原理凝集素是一類可逆結(jié)合特異糖基的蛋白質(zhì)，能與細(xì)胞外被的寡糖鏈相連接，使細(xì)胞發(fā)生凝集。3、 實(shí)驗(yàn)用品1 器材: 顯微鏡、天平、載玻片、滴管、離心管、燒杯、10ml移液管、試管、試管架2 材料: 土豆塊莖、 2 雞血紅細(xì)胞3 試劑: 抗凝血?jiǎng)?3.8%檸檬酸鈉）、PBS緩沖液（pH 7.4 0.2mol/L Na2HPO4 49ml + 0.2mol/L NaH2PO4 51ml, PBS緩沖液一般作為溶劑，起溶解保護(hù)試劑的作用）、0.17mol/L氯化鈉。4、 實(shí)驗(yàn)步驟1 雞血紅細(xì)胞懸液制備取已加抗凝劑的新鮮雞血1 mL，加

2、等量生理鹽水輕輕混勻后2000 r/min離心 min，重復(fù)3次，按紅細(xì)胞壓積用生理鹽水配成雞血紅細(xì)胞懸液（淡紅色）。2 土豆凝集素制備 土豆克切成薄片后加10 ml PBS，浸泡0.5-2 h（寫具體時(shí)間，80min）3 細(xì)胞凝集反應(yīng)制備不同濃度梯度的紅細(xì)胞液：取1ml已制備好的2%的雞血細(xì)胞懸液，通過系列稀釋將血細(xì)胞懸液制備成不同濃度：在1ml的試管上編號為2%；在標(biāo)號2%的試管中取0.5ml于另一只試管中，在試管中加入0.5ml生理鹽水，混合均勻并編號1%；在1%的試管中取0.5ml的細(xì)胞懸液于另一只試管中，并加入0.5ml的生理鹽水，混合均勻編號0.5%；梯度稀釋制備不同濃度的土豆懸浮

3、液：取1ml的土豆凝集素懸浮液原液于其中一只試管中，并編號1×；另取0.5ml的土豆懸浮液原液于另一只試管中，加入0.5ml的PBS緩沖液，并編號0.5×；再取一只試管，加入1ml的PBS緩沖液，并編號0×；土豆凝集素滴、雞血紅細(xì)胞液滴載玻片上混勻，靜置min（寫實(shí)際時(shí)間，5min）思考題：1、 生理鹽水可以用蒸餾水代替嗎？為什么？不能用蒸餾水代替。生理鹽水的滲透壓與血漿的滲透壓相當(dāng)，用生理鹽水是為了維持滲透壓，保持細(xì)胞正常形態(tài),防止發(fā)生細(xì)胞破裂。2、 如果你在顯微觀察時(shí)，看到很多碎片狀小塊發(fā)生凝集，而不是圓形的細(xì)胞，請分析可能導(dǎo)致這種現(xiàn)象的原因可能是蓋玻片壓片時(shí)

4、細(xì)胞破碎實(shí)驗(yàn)二 MS培養(yǎng)基的配制一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私釳S培養(yǎng)基的組成、掌握MS培養(yǎng)基的配制方法二、 實(shí)驗(yàn)原理植物生長發(fā)育需要多種營養(yǎng)成分，在配制之前，將各種成分按要求的比例，先配制成一定濃度的母液，方便保存和操作3、 實(shí)驗(yàn)用品各種試劑天平、高壓滅菌鍋、電爐、燒杯、pH試紙、容量瓶、量筒、移液管4、 實(shí)驗(yàn)步驟1、配制幾種母液（1）配制MS大量元素母液一般將大量元素分別配制成100倍的母液，使用時(shí)再分別稀釋100倍。分別稱取名稱重量名稱重量NH4NO3165gKH2PO417gKNO3190gCaCl2·2H2O44gMgSO4·7H2O37g各自配成1L的母液。各自倒入1L試劑瓶

5、中，存放于冰箱中。（2）配制MS微量元素母液一般將微量元素配制成100倍母液。依次稱?。ㄗⅲ喝芎靡粋€(gè)后，再加下一個(gè)） 名稱重量名稱重量KI0.083gNa2MoO4·2H2O0.025gH3BO30.62gCuSO4·5H2O0.0025gMnSO4·H2O1.69gCoCl2·6H2O0.0025gZnSO4·7H2O0.86g 配成1L母液，倒入1L試劑瓶中，存放于冰箱中。注：CuSO4·5H2O和CoCl2·6H2O 由于稱取量很小，如果天平精確度沒有達(dá)到萬分之一，可先配成調(diào)整液。分別稱取CuSO4·5H2O

6、 0.05g，CoCl2·6H2O 0.05g，各自配成100ml的調(diào)整液，然后取5ml就還有0.0025g的量。（3）配制MS有機(jī)母液一般配制成100倍MS有機(jī)母液。依次稱?。ㄗⅲ喝芎靡粋€(gè)后，再加下一個(gè)）名稱重量名稱重量肌醇10g鹽酸硫胺素（VB1）0.01g煙酸0.05g甘氨酸0.2g鹽酸吡哆醇（VB6）0.05g配成1L母液，倒入1L試劑瓶中，存放于冰箱中。（4）激素母液的配制各種生長素和細(xì)胞分裂素要單獨(dú)配制，不能混合在一起，生長素類一般要先用少量95%的酒精或1當(dāng)量的NaOH溶解，細(xì)胞分裂素一般要先用1當(dāng)量的鹽酸溶解，然后再加蒸餾水定容。一般取100mg配成100ml母液。2

7、、配制培養(yǎng)基以配置1L MS培養(yǎng)基為例，按順序進(jìn)行如下操作：1）. 先在燒杯中放入一些蒸餾水。2）. 分別取上面八種母液10ml倒入。3）. 一般稱取30g蔗糖倒入，攪拌溶解。4）. 加蒸餾水用量筒定溶至1L。5）. 按設(shè)計(jì)好的方案添加各種激素，由于激素的用量很小，而且激素對組培植物的生長至關(guān)重要。所以有條件的話最好用微量可調(diào)移液器吸取，減少誤差。用精密試紙或酸度計(jì)調(diào)整PH至5.7-5.8。（有條件的話使用酸度計(jì)，比較精確） 可配1當(dāng)量的HCL和1當(dāng)量的NaOH用來調(diào)溶液PH值。當(dāng)量HCL配制：用量筒量取8.3ml配成100ml溶液。當(dāng)量NaOH配制：稱取NaOH 4g 配成100ml溶液。6

8、）. 稱取5g左右瓊脂粉（質(zhì)量好的瓊脂粉),倒入上面配好的溶液中，放在電爐上加熱至沸騰，直到瓊脂粉熔化。7）. 稍微冷卻后，分裝入培養(yǎng)容器中。無蓋的培養(yǎng)容器要用封口膜或牛皮紙封口，用橡皮筋或繩子扎緊。8）. 放入消毒滅菌鍋滅菌，滅菌20分鐘左右。滅菌后從滅菌鍋中取出培養(yǎng)基，平放在實(shí)驗(yàn)臺上令其冷卻凝固。實(shí)驗(yàn)三 植物組織培養(yǎng)（外植體的處理與愈傷組織的誘導(dǎo)）（開放） 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?了解植物組織培養(yǎng)的基本原理，掌握培養(yǎng)基配制和消毒、植物材料的處理、接種等基本技術(shù)。二、實(shí)驗(yàn)原理 植物細(xì)胞的全能性三、實(shí)驗(yàn)用品 器材：超凈工作臺、培養(yǎng)架、鑷子、解剖刀、酒精燈、脫脂棉、燒杯、廣口瓶、培養(yǎng)皿。 試劑：20%次氯

9、酸鈉、70%酒精、無菌水、培養(yǎng)基母液。 材料：菊花的莖段與葉片四、實(shí)驗(yàn)步驟1、培養(yǎng)基配置： 誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基為：2,4-D0.5mg/l+NAA0.5-1mg/l+6-BA2mg/l+水解乳蛋白500mg/l 3%蔗糖+0.8%瓊脂（金盞菊）,pH 5.8。2、葉片的消毒： 取幼嫩葉片用自來水充分洗凈后，經(jīng)75%酒精消毒30s, 20%次氯酸鈉溶液浸泡8min，無菌水沖洗5-6次后，去掉主葉脈和大的側(cè)葉脈，將葉片切成1.0-1.5cm2的小方塊。3、接種：用75%酒精擦洗接種臺表面，解除三角瓶上捆扎的線繩，有必要的話可以用沾有75%的酒精的棉球把三角瓶表面擦一下，把三角瓶按培養(yǎng)基處理整齊排

10、列在接種臺左側(cè)，然后輕輕打開封口膜，將三角瓶口在火焰上方灼熱滅菌，同時(shí)把長鑷子也放在火焰上方灼燒，將燒過的鑷子觸動(dòng)培養(yǎng)基部分，使其冷卻，以免燒死被接種的外植體，然后將培養(yǎng)皿打開一小縫，用鑷子取出處理好的葉片，背面朝下放到培養(yǎng)基表面。在酒精燈火焰上轉(zhuǎn)動(dòng)三角瓶一圈使瓶口灼熱滅菌。然后用封口膜封口，待所有人完成實(shí)驗(yàn)后，將其放入培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)箱內(nèi)，分班做好標(biāo)記（標(biāo)記內(nèi)容包括：班級名稱、接種日期、接種數(shù)量、培養(yǎng)基類型等）。4、注意事項(xiàng)：消毒以后的所有操作過程，都應(yīng)在超凈工作臺上進(jìn)行，操作所用的鑷子、解剖刀和剪刀使用前插入95%乙醇溶液中，使用時(shí)在酒精燈火焰上熾燒片刻，冷卻后再切割。注意：（1）

11、從室外取得材料，要用自來水沖洗數(shù)分鐘，對表面不光滑或長有絨毛等結(jié)構(gòu)不容易洗凈的材料，沖洗時(shí)間要長，必要時(shí)要用毛刷刷洗。（2）外植體要選用兩種消毒劑交替浸泡，初次實(shí)驗(yàn)滅菌時(shí)間要設(shè)置一定的時(shí)間梯度來確定最佳的滅菌時(shí)間。常用的消毒劑的見表1。（3）工作臺接種時(shí)，應(yīng)盡量避免做明顯擾亂氣流的動(dòng)作（比如說、笑、打噴嚏），以免影響氣流，造成污染。且操作過程中要不時(shí)用75%的酒精擦拭雙手。（4）接種前培養(yǎng)基出現(xiàn)大量污染現(xiàn)象要區(qū)分原因。（5）接種后培養(yǎng)基出現(xiàn)大面積污染、菌落分布不勻，主要是接種過程中發(fā)生的污染所致?？赡苁墙臃N室不潔凈、菌類孢子過多、鑷子帶菌、操作人員手未徹底消毒、操作人員呼吸及超凈工作臺出現(xiàn)故障

12、等原因引起。應(yīng)保持無菌接種室潔凈，并定期用甲醛等熏蒸滅菌；在接種前無菌室用紫外燈滅菌時(shí)間不低于20-30 min；用75%酒精噴霧殺菌降塵，超凈臺開啟15-20 min后方可使用；鑷子等接種工具嚴(yán)格徹底滅菌，且接種時(shí)使用1次滅菌1次；操作過程中經(jīng)常用75%酒精等消毒劑擦洗手部等措施。（6）接種后外植體周圍發(fā)生菌類污染可能因外植體表面滅菌不徹底所致。解決方法是:外植體用飽和洗滌劑浸泡10-15 min，自來水沖洗0 .5-2h后，再選擇適宜的滅菌劑消毒，一般用0.1-0.2%升汞滅菌最好。對于一些凹凸不平或有茸毛的外植體采用滅菌劑中加“吐溫一80”等濕潤劑的辦法，增加其滲透性，以提高殺菌效果。五

13、、實(shí)驗(yàn)結(jié)果接種后污染調(diào)查觀察接種后第天的污染情況，填入下表： 接種日期培養(yǎng)基種類接種數(shù)污染率生長情況表1 植物組織培養(yǎng)中常用的消毒劑消毒劑名稱使用濃度（%）去殘留難易滅菌時(shí)間（min）消毒效果乙醇7075易0.13好氯化汞0.10.2較難215最好漂白粉飽和溶液易530很好次氯酸鈣910易530很好次氯酸鈉2易530很好過氧化氫1012最易515好 六、思考題1、外植體用消毒劑消毒后，為什么要用無菌水漂洗？有時(shí)候會在消毒溶液中加入12滴的表面活性物質(zhì)，例如吐溫80或吐溫20，為什么？消毒水都具有很強(qiáng)的燒蝕性,在殺滅細(xì)菌的同時(shí),也會作用于正常的細(xì)胞組織,影響正常細(xì)胞的成長或再生,所以外植體消毒后

14、一般要用無菌水漂洗，以清除殘留的具有殺傷力的消毒劑。對于一些凹凸不平或有茸毛的外植體采用滅菌劑中加“吐溫一80”等濕潤劑的辦法，增加其滲透性，以提高殺菌效果。2、 在接種過程中，通過哪些措施防止細(xì)菌對接種工具接種材料的污染？認(rèn)真做好外植體的選擇和消毒工作，防止外植體帶菌改善接種室和培養(yǎng)室的環(huán)境條件，保證接種與培養(yǎng)環(huán)境清潔無菌操作人員嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作規(guī)程培養(yǎng)基及接種工器具要嚴(yán)格滅菌，確保滅菌質(zhì)量在培養(yǎng)基中加入適量的抗生素利用病毒在植株體內(nèi)分布不均勻的原理，生產(chǎn)脫毒苗利用培養(yǎng)基中高鹽或高糖的濃度，抑制微生物的生長減少培養(yǎng)基中的某些有機(jī)成分，可抑制微生物的生長繁殖 實(shí)驗(yàn)四 細(xì)胞膜的滲透性一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

15、了解細(xì)胞膜的滲透性及各類物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞的速度。2、 實(shí)驗(yàn)原理1溶血現(xiàn)象可作為物質(zhì)是否進(jìn)入紅細(xì)胞及測量物質(zhì)進(jìn)入紅細(xì)胞速度的指標(biāo)。2紅細(xì)胞置于等滲溶液中，溶質(zhì)分子進(jìn)入細(xì)胞，使細(xì)胞內(nèi)滲透活性分子的濃度改變，繼而導(dǎo)致水的攝入，使細(xì)胞膨脹，細(xì)胞膜破裂，發(fā)生溶血。3不同溶質(zhì)分子進(jìn)入細(xì)胞膜的速度不同，發(fā)生溶血所需的時(shí)間也不同。4紅細(xì)胞的溶血時(shí)間與溶質(zhì)分子的極性、分子大小有關(guān)；同時(shí)細(xì)胞膜對進(jìn)入細(xì)胞分子的選擇性也對溶血現(xiàn)象的發(fā)生起重要作用。 3、 實(shí)驗(yàn)用品材料：抗凝雞血器材：小燒杯、試管及試管架、移液管實(shí)驗(yàn)試劑0.17 mol/L氯化鈉，0.17mol/L氯化銨，0.17 mol/L醋酸氨，0.17 mol/L硝

16、酸鈉，0.12 mol/L硫酸鈉，0.12 mol/L草酸銨，0.32 mol/L葡萄糖，0.32 mol/L甘油，0.32 mol/L乙醇，0.32 mol/L丙酮，蒸餾水4、 實(shí)驗(yàn)步驟1血細(xì)胞懸液的制備取1mL抗凝全血于50mL小燒杯中，再加入9mL 0.17 mol/L氯化鈉，配置好稀釋的血細(xì)胞懸液。2溶血現(xiàn)象觀察-對照取試管1支，加入mL蒸餾水，然后再加入. mL稀釋的雞血，注意觀察溶液的顏色變化，溶液由不透明的紅色變?yōu)榧t色透明，紅細(xì)胞發(fā)生破裂，造成所有紅細(xì)胞溶血，使光線容易通過。顯微鏡下觀察溶血前后紅細(xì)胞的形態(tài)。3觀察紅細(xì)胞對各類物質(zhì)的滲透性:取試管10支，分別加入上述10種溶液各5

17、 mL，再 加入0.5mL稀釋的雞血，記下時(shí)間，輕輕搖動(dòng)使混勻，注意是否發(fā)生溶血；若發(fā)生溶血，記錄溶血過程所需的時(shí)間 。5、 實(shí)驗(yàn)結(jié)果水乙醇丙酮甘油醋酸氨草酸銨氯化銨氯化鈉、硝酸鈉、硫酸鈉、葡萄糖1ml水+0.1ml紅細(xì)胞懸液：水使紅細(xì)胞發(fā)生溶血的時(shí)間最短，幾乎是瞬時(shí)的。在低滲條件下，大量水分子從水通道易化擴(kuò)散進(jìn)入紅細(xì)胞，從而引起了迅速的紅細(xì)胞溶血現(xiàn)象。1ml0.32M乙醇+0.1ml紅細(xì)胞懸液：乙醇是脂溶性小分子，可以自由擴(kuò)散進(jìn)出細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)中，紅細(xì)胞外有相對高濃度的乙醇，大量乙醇分子順濃度差進(jìn)入紅細(xì)胞，使紅細(xì)胞內(nèi)滲透壓高于紅細(xì)胞外滲透壓，水通道開放，大量水分子進(jìn)入紅細(xì)胞，發(fā)生溶血。1ml0.

18、32M甘油+0.1ml紅細(xì)胞懸液：甘油進(jìn)入紅細(xì)胞引起溶血的機(jī)制與乙醇相同，但其引起溶血的時(shí)間稍長，是由于甘油極性相對比乙醇高，脂溶性相對比乙醇低，且分子量比乙醇高，進(jìn)入紅細(xì)胞的速度比乙醇慢，紅細(xì)胞內(nèi)液達(dá)到使水通道開放的滲透壓時(shí)間長。1mL0.12M草酸銨+0.1mL紅細(xì)胞懸液：銨鹽為弱電解質(zhì)，溶液中存在電離平衡，有許多分子形式存在的氨。氨是小分子，可自由擴(kuò)散進(jìn)出紅細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)中，紅細(xì)胞外氨濃度相對高，氨分子順濃度差進(jìn)入紅細(xì)胞，使紅細(xì)胞內(nèi)滲透壓升高，促使水通道開放，大量水分子進(jìn)入紅細(xì)胞發(fā)生溶血。1mL0.17M氯化銨+0.1mL紅細(xì)胞懸液：氯化銨引起紅細(xì)胞溶血的機(jī)制與草酸銨引起溶血的機(jī)制相同，但其

19、時(shí)間比草酸銨長，這是由于二者雖然均為等滲溶液，但銨離子含量不同。氯化銨中銨離子含量少（幾乎少了一半），相應(yīng)地氨分子含量也少，因此氨分子進(jìn)入紅細(xì)胞的速率也慢，引起溶血的時(shí)間就長（近似長了一倍）。1mL0.17M氯化鈉+0.1mL紅細(xì)胞懸液/1mL0.12M硫酸鈉+0.1mL紅細(xì)胞懸液： 鈉離子在溶液中完全電離，不存在分子形式。鈉離子是通過細(xì)胞膜上的選擇性離子通道進(jìn)入細(xì)胞的，由離子通道介導(dǎo)的易化擴(kuò)散是順濃度梯度或電化學(xué)梯度的。等滲的鈉鹽溶液不能引起紅細(xì)胞膜上的離子通道開放，因而鈉離子無法進(jìn)入紅細(xì)胞，紅細(xì)胞內(nèi)滲透壓不會升高，因而水分子不會進(jìn)入紅細(xì)胞，不會發(fā)生溶血。1mL葡萄糖+0.1mL紅細(xì)胞懸液：

20、紅細(xì)胞攝取葡萄糖的方式是載體介導(dǎo)的易化擴(kuò)散。實(shí)驗(yàn)中，葡萄糖順濃度梯度進(jìn)入紅細(xì)胞，但隨后很快被紅細(xì)胞代謝，為紅細(xì)胞提供能量，不會引起紅細(xì)胞內(nèi)滲透壓的顯著升高。因此，等滲的葡萄糖溶液不會使紅細(xì)胞發(fā)生溶血。6、 思考題1.推斷下列溶液的溶血反應(yīng)會如何，并做實(shí)驗(yàn)證實(shí)。 0.17 mol/L氯化鉀、0.17 molL硝酸鉀、 0.12molL氯化鎂、0.12 molL氯化鈣、0.10 molL硫酸鉀、0.10molL醋酸鉀、0.10mol/L 檸檬酸鈉、0.32 molL甘露醇、0.32mol/L 蔗糖。 溶血：0.10molL醋酸鉀不溶血：0.17 mol/L氯化鉀、0.17 molL硝酸鉀、 0.1

21、2molL氯化鎂、0.12 molL氯化鈣、0.10 molL硫酸鉀、0.10mol/L 檸檬酸鈉、0.32 molL甘露醇、0.32mol/L 蔗糖 2.溶液的滲透壓主要與哪些因素有關(guān)?對簡單鹽 溶液如何粗略計(jì)算出其滲透壓?滲透壓與溶液中不能通過半透膜的微粒數(shù)目和環(huán)境溫度有關(guān)。在溫度一定時(shí)，稀溶液的滲透壓力與溶液的濃度成正比；在濃度一定時(shí)，稀溶液的滲透壓力與熱力學(xué)溫度成正比。難揮發(fā)非電解質(zhì)稀溶液的滲透壓力與溶液濃度和熱力學(xué)溫度的關(guān)系為：=CRTc為摩爾濃度，單位：mol/L，也可以算作C=n/V（物質(zhì)的量(mol)/體積(L)），R為理想氣體常數(shù)，當(dāng)?shù)膯挝粸镻a，V的單位為升（L）時(shí)，R值為

22、8.314J·K-1·mol-1，T為熱量，單位：K（開爾文），與攝氏度的換算關(guān)系是 T(K) = 273+T(C)。實(shí)驗(yàn)五 葉綠體的分離和熒光觀察1、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 通過植物細(xì)胞葉綠體的分離，了解細(xì)胞器分離的一般原理與方法；了解差速離心特點(diǎn)與用途；2 了解熒光顯微鏡的原理，掌握熒光顯微鏡的操作，觀察白菜葉綠體的形態(tài)、分布與數(shù)量。2、 實(shí)驗(yàn)原理采用差速離心分離細(xì)胞器；沉降順序：核葉綠體線粒體溶酶體與過氧化物酶體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高基體核蛋白體；葉綠體具有熒光現(xiàn)象，可利用熒光顯微鏡觀察。白菜葉富含葉綠體，可采用徒手切片觀察 其形態(tài)和分布；三、實(shí)驗(yàn)用品1器材：離心機(jī)、研缽或組織搗碎機(jī)、顯微

23、鏡、天平、離心管、紗布、燒杯、量筒、滴管、載玻片、蓋玻片2材料：新鮮白菜葉3試劑：0.35mol/L氯化鈉溶液 ，0.01%丫啶橙四、實(shí)驗(yàn)步驟（一）葉綠體的分離與觀察取新嫩白菜葉，洗凈檫干、去梗，稱30g，分批放入研缽。加入0.35mol/L氯化鈉溶液， 共150ml，研磨，制成勻漿；將勻漿用層紗布過濾于燒杯中；取濾液ml在1000r/min離心min，取上清；上清液3000r/min離心min去上清，沉淀即為葉綠體；加0.35mol/L氯化鈉溶液懸浮沉淀；取葉綠體懸液滴于載玻片上，加蓋片：普通光鏡下觀察；加0.01%丫啶橙,熒光顯微鏡下演示,（二）白菜葉徒手切片觀察新嫩白菜葉斜切面片，0.3

24、5mol/L氯化鈉溶液滴；加蓋片輕壓：光鏡下觀察葉綠體在表皮細(xì)胞和保衛(wèi)細(xì)胞中的分布；加0.01%丫啶橙,熒光顯微鏡下演示。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果繪圖：菠菜葉肉細(xì)胞的形態(tài)，顯示葉綠體。六、思考題簡述：葉綠體的分離原理和方法（見實(shí)驗(yàn)原理、步驟）使用熒光顯微鏡時(shí)應(yīng)注意：1打開燈源，超高壓汞燈要預(yù)熱幾分鐘才能達(dá)到最亮點(diǎn)。2放置標(biāo)本片，調(diào)焦后即可觀察；3高壓汞燈關(guān)閉后不能立即重新打開，至少需經(jīng)5min后才能再啟動(dòng)，否則會不穩(wěn)定，影響汞燈壽命。實(shí)驗(yàn)六 動(dòng)物細(xì)胞原代培養(yǎng)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?高等生物是由多細(xì)胞構(gòu)成的整體，在整體條件下要研究單個(gè)細(xì)胞或某一群細(xì)胞在體內(nèi)（in vivo）的功能活動(dòng)是十分困難的。2如果把活細(xì)胞拿到體

25、外（in vitro）培養(yǎng)進(jìn)行觀察和研究，則要方便得多。3高等動(dòng)植物細(xì)胞要求的生存條件極其嚴(yán)格，稍有不適就要死亡。所以細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)（cell culture）就是選用最佳生存條件對活細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)和研究的技術(shù)。 二、實(shí)驗(yàn)原理原代培養(yǎng) （primary culture）：從動(dòng)物機(jī)體取出的進(jìn)行培養(yǎng)的細(xì)胞群。原代培養(yǎng)的細(xì)胞生長比較緩慢，而且繁殖一定的代數(shù)后（一般10代以內(nèi)）停止生長，需要重新更換培養(yǎng)基。將細(xì)胞從一個(gè)培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移到另外一個(gè)培養(yǎng)瓶即稱為傳代或傳代培養(yǎng)（Passage）。三、實(shí)驗(yàn)用品器材：倒置顯微鏡、鑷子、剪刀、燒杯、培養(yǎng)皿、 錐瓶、培養(yǎng)瓶、膠塞、移液管、EP管試劑：1640培養(yǎng)基、hanks

26、液、胰酶、雙抗材料：小鼠1.超凈工作臺內(nèi)： 污物缸1個(gè)、酒精燈2個(gè)、 酒精棉球1瓶、大鑷子1把、打火機(jī)1個(gè)、 5毫升移液器, 1640培養(yǎng)基30毫升(方瓶，2人共用） 、 Hanks液20毫升（圓瓶，2人共用）；2.飯盒1個(gè),槍頭4支抗 菌 素 的 使 用抗生素的作用：在培養(yǎng)液配制后，培養(yǎng)液內(nèi)常加適量抗菌素，以抑制可能存在的細(xì)菌的生長?？股氐氖褂昧浚和ǔＪ乔嗝顾睾玩溍顾芈?lián)合使用。培養(yǎng)基內(nèi)青霉素、鏈霉素最終使用濃度為每毫升100單位。慶大霉素：每毫升100單位方便、廣譜、穩(wěn)定完全培養(yǎng)基的組成1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基 95血清 5碳酸氫鈉 2.0 g/L青、鏈霉素 各100單位毫升四、實(shí)驗(yàn)步驟1取小鼠

27、，用頸椎脫臼法處死.然后將其整個(gè)浸泡在含有75%酒精的燒杯中，5分鐘后（注意時(shí)間不能太長，以避免酒精從口或其他通道進(jìn)入體內(nèi)，影響組織活力），臺面消毒，取出動(dòng)物消毒。2戴無菌袖套.點(diǎn)燃酒精燈，手部消毒。3在無菌操作臺內(nèi)將胎鼠外表再次消毒。4將腹部剪開，取出肝臟。5 Hanks液培養(yǎng)皿A，B。(大鑷子夾瓶塞，用吸管吸取)6小鑷挑出肝臟 A清洗,剪去其它組織與器官等。7將材料轉(zhuǎn)入B再次清洗;8 A換Hanks，材料再于A中漂洗;9剪取1/51/3的組織,轉(zhuǎn)入小燒杯(10ml) ，剪成0.51mm3碎塊。10將碎塊倒入三角錐瓶,用1ml胰酶清洗小燒杯,合入錐瓶,迅速搖勻;11錐瓶加塞,覆口,拿出工作臺

28、,于37 水浴鍋中消化57分鐘(嚴(yán)格)!,中間搖動(dòng)23次;12于超凈工作臺中加入45ml培養(yǎng)基,終止消化.用吸管充分吹打78次;13將細(xì)胞懸液用紗布過濾,進(jìn)入20ml燒杯(凹面!)用培養(yǎng)基清洗紗布2次,每次34ml;14分別取2ml ,2ml和3ml細(xì)胞懸液接種至三只培養(yǎng)瓶中(3ml在塑料瓶),補(bǔ)加培養(yǎng)液至總體積5ml;15培養(yǎng)瓶加塞, 側(cè)面標(biāo)記。 37 培養(yǎng).16明天來觀察細(xì)胞,并進(jìn)行細(xì)胞傳代.注 意清理臺面,用品洗凈,交回.細(xì)胞培養(yǎng)的結(jié)果觀察與鑒定肉眼觀察顯微鏡觀察污染細(xì)菌黃、混大量小粒、桿霉菌霉斑大量菌絲未污染未生長紅、清組織邊緣無遷移生長黃、清、生長暈、連片鋪瓶組織邊緣細(xì)胞遷移、細(xì)胞長

29、梭形、連片 其他說明1霉菌一般紅、清，初期只有菌絲，沒有霉斑。2放線菌、酵母菌污染。3細(xì)胞初期呈三角形，后呈長梭形。4胞體大而透明，說明生長情況良好，反之，則說明培養(yǎng)條件不佳或細(xì)胞已經(jīng)衰老。5黃、清培養(yǎng)基的更換。實(shí)驗(yàn)七 液泡系的超活染色與觀察一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 觀察動(dòng)植物活細(xì)胞內(nèi)線粒體、液泡系的形態(tài)、發(fā)育和分布；2 了解細(xì)胞和細(xì)胞器的超活染色技術(shù) 二、實(shí)驗(yàn)原理1線粒體是細(xì)胞進(jìn)行呼吸作用的場所，具形態(tài)和數(shù)量隨不同物種、不同組織器官和不同的生理狀態(tài)面發(fā)生變化。 2詹納斯綠B是毒性較小的堿性染性，可專一性地對線粒體進(jìn)行超活染色，這是由于線粒體內(nèi)的細(xì)胞色素氧化酶系的作用，使染料始終保持氧化狀態(tài)(即有色狀態(tài)

30、)，呈藍(lán)綠色：而線粒體周圍的細(xì)胞質(zhì)中，這些染料被還原為無色的色基(即無色狀態(tài))。3中性紅為弱堿性染料，對液泡系(即高爾基體)的染色有專一性，只將活細(xì)胞中的液泡系染紅色，細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)完全不著色，這可能是與液泡中某些蛋白質(zhì)有關(guān)。 三、實(shí)驗(yàn)用品1 器材：顯微鏡、恒溫水浴鍋、剪刀、鑷子、解剖刀、載玻片、蓋玻片、吸管、牙簽、吸水紙2 試劑：Ringer液、1/5000詹納斯綠、1/3000中性紅3 材料：人口腔上皮細(xì)胞、蠶豆幼根根尖四、實(shí)驗(yàn)步驟（一）線粒體的超活染色與觀察1 口腔上皮細(xì)胞線粒體的超活染色（1）取清潔載玻片放在37恒溫水溶鍋的金屬板上，滴2滴1/5000詹納斯綠B染液。（2）實(shí)驗(yàn)者用牙簽

31、寬頭在自己口腔頰粘膜處稍用力刮取上皮細(xì)胞，將刮下的粘液狀物放入載玻片的染液滴中，染色10-15min(注意染液不可干燥，必要時(shí)可再加滴染液)，蓋上蓋玻片，用吸水紙吸去四周溢出的染液，置顯微鏡下觀察。（3）在低倍鏡下，選擇平展的口腔上皮細(xì)胞，換高倍鏡進(jìn)行觀察?？梢姳馄綘钌掀ぜ?xì)胞的核周圍胞質(zhì)中，分布著一些被染成藍(lán)綠色的顆粒狀或短棒狀的結(jié)構(gòu)，即是線粒體。（二） 蠶豆幼根根尖液泡系的中性紅染色觀察（1）實(shí)驗(yàn)前，把蠶豆培養(yǎng)在培養(yǎng)皿內(nèi)潮濕的濾紙上，使具發(fā)芽，胚根伸長到lcm以上（2）用雙面刀得把初生的蠶豆幼苗根尖(1-2cm)小心切一縱切面，放入載玻片上的1/3000中性紅染液滴中，染色5一10min。（

32、3）吸去染液，滴一滴Ringer液，蓋上蓋玻片，并用鑷子輕輕地下壓蓋玻片，使根尖壓扁，利于觀察。（4）在高倍鏡下，先觀察根尖部分的生長點(diǎn)的細(xì)胞，可見細(xì)胞質(zhì)中散在很多大小不等的染成玫瑰紅色的圓形小泡，這是初生的幼小液泡。然后，由生長點(diǎn)向延長區(qū)觀察，在一些已分化長大的細(xì)胞內(nèi)，液泡的染色較淺，體積增大，數(shù)目變少。在成熱區(qū)細(xì)胞中，一般只有一個(gè)淡紅色的巨大液泡，占據(jù)細(xì)胞的絕大部分，將細(xì)胞核擠到細(xì)胞一側(cè)貼近細(xì)胞壁處。注：活體染色是指對生活有機(jī)體的細(xì)胞或組織能著色但又無害毒的一種染色方法。它的目的是顯示生活細(xì)胞內(nèi)的某些結(jié)構(gòu)。而不影響細(xì)胞的生命活動(dòng)和產(chǎn)生任何物理、化學(xué)變化以致引起細(xì)胞的死亡。活染技術(shù)可用來研究

33、生活狀態(tài)下的細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理病理狀態(tài)。 根據(jù)所用染色劑的性質(zhì)和染色方法的不同，通過把活體染色分為體內(nèi)活染與體外活染兩類。體內(nèi)活染是以膠體狀的染料溶液注入動(dòng)、植物體內(nèi)，染料的膠粒固定、堆積在細(xì)胞內(nèi)某些特殊結(jié)構(gòu)里，達(dá)到易于識別的目的。體外活染又稱超活染色，它是由活的動(dòng)、植物分離出部分細(xì)胞或組織小塊，以染料溶液浸染，染料被選擇固定在活細(xì)胞的某種結(jié)構(gòu)上而顯色?；铙w染料之所以能固定、堆積在細(xì)胞內(nèi)某些特殊的部分，主要是染料的“電化學(xué)”特性起重要作用。堿性染料的膠粒表面帶陽離子，酸性染料的膠粒表現(xiàn)帶有陰離子，而被染的部分本身也是具有陰離子或陽離子，這樣，它們彼此之間就發(fā)生了吸引作用。但不是任何染料皆可以作

34、為活體染色劑之用，應(yīng)選擇那些對細(xì)胞無毒性或毒性極小的染料，而且總是要配成稀淡的溶液來使用。一般是以堿性染料最為適用，可能因?yàn)樗哂腥芙庠陬愔|(zhì)(如卵磷脂、膽固醇等)的特性，易于被細(xì)胞吸收。詹納斯綠B(Janus peen B)和中性紅(neutral red)兩種堿性染料是活體染色劑中最重要的染料，對于線粒體和液泡系的染色各有專一性。液泡系是指由內(nèi)膜所包圍的小泡和液泡，除線粒體和質(zhì)體外，都屬于液泡系。液泡的類型可分為以下幾種：高爾基液泡，溶酶體，圓球體（植物細(xì)胞所特有），微體，自噬小體，吞噬泡，胞飲液泡，糊粉粒（植物的種子中產(chǎn)生的一種特異的液泡），收縮泡，動(dòng)、植物液泡都是由一層單位膜包圍而成。

35、實(shí)驗(yàn)八、九 巨噬細(xì)胞吞噬現(xiàn)象的觀察一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?了解小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬現(xiàn)象的原理2熟悉細(xì)胞吞噬作用的基本過程二、實(shí)驗(yàn)原理1在高等動(dòng)物中，單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)和嗜中性粒細(xì)胞專司吞噬功能，在細(xì)胞的非特異性免疫功能中發(fā)揮重要作用。單核吞噬系統(tǒng)包括血液中的單核細(xì)胞和組織中固定和游走的巨噬細(xì)胞。2但靜息的巨噬細(xì)胞其分泌和殺傷功能低下，受到病原微生物或炎癥因子的刺激時(shí)，巨噬細(xì)胞成為激發(fā)或致敏狀態(tài)，分泌能力得以增強(qiáng)，但殺傷功能仍然很低。只有活化的巨噬細(xì)胞才具有較強(qiáng)的吞噬能力，具有非特異抗感染和抗腫瘤作用。 3大吞噬細(xì)胞來源：單核巨噬細(xì)胞存在部位：血液（單核細(xì)胞)，全身結(jié)締組織及小血管的基底 膜組織（巨噬細(xì)胞）

36、功能：吞噬病原微生物（寄生蟲等），死亡細(xì)胞。4小吞噬細(xì)胞來源： 中性粒細(xì)胞存在部位： 血液 、 炎癥部位（全身）功能：主要吞噬化膿菌三、實(shí)驗(yàn)用品1器材：顯微鏡、解剖盤、剪刀、鑷子、載玻片、蓋玻片、注射器、吸管、吸水紙2試劑：生理鹽水、Alsever溶液、瑞氏染液3材料：小白鼠、1%雞血紅細(xì)胞。四、實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)前3天取小白鼠腹腔注射6淀粉液1毫升（連續(xù)注射三天效果較好）。1小鼠腹腔注射1的雞紅細(xì)胞懸液2ml，輕揉腹部使雞細(xì)胞分散。2 2530分鐘后，用頸椎脫臼法處死小鼠。并腹腔注射生理鹽水2毫升3.在干凈的載玻片上滴加一滴生理鹽水，向其中滴加一滴腹腔液，靜置10分鐘，腹腔巨噬細(xì)胞貼壁，棄去生理鹽

37、水，待其標(biāo)本稍干后瑞氏染液染色。4.瑞氏染色：滴加34滴瑞氏染液于標(biāo)本上，以完全蓋住標(biāo)本為宜。5分鐘后甩去玻片上的染液，自來水輕洗，吸水紙吸干。干燥后油鏡鏡檢5. 清洗油鏡，解剖盤及器具，打掃桌面衛(wèi)生、實(shí)驗(yàn)室衛(wèi)生，老鼠尸體要掩埋！思考題1.在高等動(dòng)物中哪些細(xì)胞具有吞噬功能？白細(xì)胞（分為：淋巴細(xì)胞，嗜堿性粒細(xì)胞，中性粒細(xì)胞，嗜酸性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞) 吞噬細(xì)胞 （包括大吞噬細(xì)胞和小吞噬細(xì)胞，大吞噬細(xì)胞即單核-巨噬細(xì)胞，細(xì)胞小吞噬細(xì)胞即中性粒細(xì)胞。）2.在什么情況下巨噬細(xì)胞吞噬功能加強(qiáng)？受到病原微生物或炎癥因子的刺激時(shí)，巨噬細(xì)胞成為激發(fā)或致敏狀態(tài)，分泌能力得以增強(qiáng)，但殺傷功能仍然很低。只有活化的巨噬

38、細(xì)胞才具有較強(qiáng)的吞噬能力，具有非特異抗感染和抗腫瘤作用。實(shí)驗(yàn)十、 細(xì)胞中酸性磷酸酶的定位一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.了解并掌握酸性磷酸酶定位的原理及操作步驟。 2.觀察酸性磷酸酶在細(xì)胞中的分布。二、實(shí)驗(yàn)原理1 酸性磷酸酶（ACP）是溶酶體的特征性酶，主要存在于巨噬細(xì)胞,定位于溶酶體內(nèi)。正常條件下,巨噬細(xì)胞處于休止?fàn)顟B(tài),酶活性很低。但在合適的pH條件下，經(jīng)過活化，其形態(tài)、代謝和功能上表現(xiàn)出一系列顯著的變化， 如膜活性增高和酸性磷酸酶活性增強(qiáng)，從而改變其滲透性底物可以滲入,酶活力被顯示。2 通常酸性磷酸酶在pH5.0左右發(fā)生作用，能分解磷酸酯而釋放出磷酸基，磷酸基能與鉛鹽反應(yīng)形成磷酸鉛沉淀物。但因其是無色的，

39、需再經(jīng)過與硫化銨作用，形成棕黃到棕黑色的硫化鉛沉淀，由此能顯示酸性磷酸酶在細(xì)胞中的存在與分布。反應(yīng)如下：-甘油磷酸鈉- 甘油 +PO4 3-PO43-+Pb(NO3)2 -Pb3(PO4)2（沉淀）Pb3(PO4)2 +(NH4)2S-PbS (棕黑色)三、實(shí)驗(yàn)用品1.材料：小白鼠2.試劑：1)甲醛鈣固定液：甲醛10ml,10%氯化鈣 10ml,蒸餾水80毫升。2)酸性磷酸酶作用液:稱取硝酸鉛25mg,加0.05mol/L乙酸緩沖液22.5ml,攪動(dòng)使之全部溶解后,再緩慢地滴加3% -甘油磷酸鈉液2.5ml,邊加邊攪動(dòng)防止產(chǎn)生沉淀,總量25ml.(現(xiàn)配制,不能儲存) 。 3)2硫化銨溶液：硫酸

40、銨2毫升98毫升水。4)0.05molL乙酸緩沖液。A液（0.2mol/L乙酸液）：冰醋酸1.2ml加蒸餾水100ml 。 B液（0.2mol/L乙酸鈉液）：NaAc.3H2O 2.72g加蒸餾水至00毫升。取A液毫升B液70毫升蒸餾水300毫升。6)6%淀粉肉湯:牛肉膏0.3g ,蛋白胨1.0g,NaCl 0.5g,可溶性淀粉.0g，蒸餾水00ml，煮沸滅菌，保存，使用時(shí)熱水浴融化。3.儀器、 用具：注射器、恒溫水箱、顯微鏡、擦鏡紙、解剖盤、解剖剪、蓋玻片、吸水紙。四、實(shí)驗(yàn)步驟.前處理 （）小白鼠每日腹腔注射淀粉肉湯ml，連續(xù)注射天 （）在第天,再向腹腔注射ml生理鹽水，過min用頸椎脫臼法

41、處死小鼠，剖開腹腔，把內(nèi)臟推向一側(cè)，用不帶針頭的注射器或吸管吸取腹腔液.制片1）.將腹腔液滴一滴于冰凍的干凈載玻片上，涂開，自然干燥。2）.放入作用液中，37 保溫30min 。3）.蒸餾水漂洗片刻。4）.放入甲醛鈣固定液中固定5min 。5）.蒸餾水漂洗片刻。6）.放入2%硫化銨液3-5min 。7).蒸餾水漂洗,鏡檢。3.對照實(shí)驗(yàn):標(biāo)本放入作用液前先用高溫（50）處理30min,使酶失去活性，做好標(biāo)記，其它步驟同上3)-7)步。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析巨噬細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，出現(xiàn)許多棕色或棕黑色的顆粒和斑塊。部分細(xì)胞內(nèi)，酸性磷酸酶極為豐富。整個(gè)細(xì)胞質(zhì)區(qū)域都有黑色沉淀。中性粒細(xì)胞呈現(xiàn)陰性反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)中的

42、注意事項(xiàng)：1.鉛離子的濃度，作用時(shí)間作用液中鉛離子的濃度是至關(guān)重要的，必須現(xiàn)配現(xiàn)用，當(dāng)鉛離子濃度過低時(shí)產(chǎn)生的磷酸離子不能被捕捉而引起彌散，并可進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)造成細(xì)胞核染色的假陽性，孵育時(shí)間過長也可發(fā)生酶擴(kuò)散和核染色的現(xiàn)象2.腹腔注射1.小鼠腹腔注射可以用5ml的注射器，配合5.57號針頭。2. 腹腔注射時(shí)右手持注射器，左手的小指和無名指抓住小鼠的尾巴，另外三個(gè)手指抓住小鼠的頸部，使小鼠的頭部向下。這樣腹腔中的器官就會自然倒向胸部，防止注射器刺入時(shí)損傷大腸、小腸等器官。進(jìn)針的動(dòng)作要輕柔，防止刺傷腹部器官。3. 尤其是對于體重較小的小鼠，腹腔注射時(shí)針頭可以在腹部皮下穿行一小段距離，最好是從腹部一側(cè)進(jìn)

43、針，穿過腹中線后在腹部的另一側(cè)進(jìn)入腹腔。3.小鼠的處死脊柱脫臼法 用左手拇指和食指捏住小白鼠頭的后部，并用力下壓，右手抓住鼠尾，用力向后上方拉，即可使頸椎脫臼，瞬間死亡 。 皮膚和腹膜要分別剪開，并確保皮膚血液 不流入腹腔。腹腔內(nèi)的沖洗液要全部吸干。相關(guān)理論知識：1巨噬細(xì)胞（M）發(fā)育：骨髓多能干細(xì)胞定向干細(xì)胞（髓樣干細(xì)胞）單核母細(xì)胞前體單核細(xì)胞單核細(xì)胞血液組織（分化為巨噬細(xì)胞）2 M分布：單核細(xì)胞主要于血液中，巨噬細(xì)胞幾乎存在于所有表皮和黏膜下組織。3 M形態(tài)：有偽足，馬蹄狀單核，細(xì)胞形體大。4 M分離純化：小鼠和大鼠腹腔內(nèi)有豐富的巨噬細(xì)胞，可用腹腔清洗的方法獲得較多細(xì)胞懸液。正常小鼠每只可收

44、集腹腔滲出細(xì)胞106，其中30%為巨噬細(xì)胞，如果給小鼠腹腔注射某種刺激物，可使巨噬細(xì)胞滲出增加，易于分離更多的巨噬細(xì)胞。5在高等動(dòng)物中存在大小兩類吞噬細(xì)胞（巨噬細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞），專司吞噬作用，在細(xì)胞的非特異免疫功能中發(fā)揮重要作用。.單核細(xì)胞 單核細(xì)胞來自骨髓的前單核細(xì)胞，發(fā)育成熟后釋放到血液中。血液中單核細(xì)胞已向全身各組織并進(jìn)一步分化成各種組織的巨噬細(xì)胞。血液中單核細(xì)胞為圓形或橢圓形，直徑14-20微米，在形態(tài)上很難和其他獨(dú)核細(xì)胞相區(qū)分。胞質(zhì)中含有嗜天青顆粒，它是一種溶酶體，其中含有過氧化物酶，酸性磷酸酶，非特異性酯酶和溶菌酶等，這些酶與單核細(xì)胞的殺傷和消化功能有關(guān)。單核吞噬細(xì)胞在血液中約

45、占白細(xì)胞的1%-3%，其在血液中的半衰期約為8-10個(gè)小時(shí)，一旦進(jìn)入組織分化為巨噬細(xì)胞后，其生命周期可長達(dá)數(shù)月至數(shù)年。.巨噬細(xì)胞的特性 組織中的巨噬細(xì)胞則呈顯著的多形性，在培養(yǎng)條件下對塑料或玻璃表面具有極強(qiáng)的粘附性，一次可利用這一特性分離巨噬細(xì)胞并與非粘附性細(xì)胞分開，但其作用機(jī)制不詳。巨噬細(xì)胞在體內(nèi)可借其表面粘附分子與其它細(xì)胞或細(xì)胞外基質(zhì)黏附在一起。巨噬細(xì)胞的另一特性是對異物通過不同機(jī)制具有吞噬作用（phagocytosis）,吞飲（endocytosis）或胞飲作用（pinocytosis）?？蓪愇锿倘氚麅?nèi)，并借其胞漿內(nèi)的大量液泡及顆粒中的內(nèi)含物和代謝產(chǎn)物將吞入的異物降解，消化和清除。思考

46、題1在制片的過程中為什么要采用冷凍涂片？可避免在固定、包埋及制片過程中酶的失活，保證了實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性。2簡述巨噬細(xì)胞（M）發(fā)育及M分布？巨噬細(xì)胞（M）發(fā)育：骨髓多能干細(xì)胞定向干細(xì)胞（髓樣干細(xì)胞）單核母細(xì)胞前體單核細(xì)胞單核細(xì)胞血液組織（分化為巨噬細(xì)胞）M分布：單核細(xì)胞主要于血液中，巨噬細(xì)胞幾乎存在于所有表皮和黏膜下組織。實(shí)驗(yàn)十一、十二 玉米成熟胚培養(yǎng)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?學(xué)習(xí)掌握成熟胚培養(yǎng)方法。2玉米的組織培養(yǎng)，特別是胚性細(xì)胞系的建立，作為遺傳轉(zhuǎn)化操作的主要技術(shù)基礎(chǔ)，一直受到廣泛關(guān)注。前人已采用過玉米的多個(gè)部分如根、莖、葉、幼穗、幼胚和成熟胚等為外植體，研究了其愈傷組織細(xì)胞的分化再生情況，發(fā)現(xiàn)幼穗和幼胚愈

47、傷組織具有較高的再分化能力。但幼穗，幼胚的采用受季節(jié)限制，而種子保存期長，易獲得，可用于較長時(shí)間的研究。只是成熟胚脫分化能力較弱，愈傷組織再分化能力差，但如果能改變種子的生理狀態(tài)，提高其胚性愈傷組織的形成能力，無疑將大大促進(jìn)小麥胚性細(xì)胞系的建立。低溫處理具有促進(jìn)種子從體眠狀態(tài)轉(zhuǎn)向萌發(fā)狀態(tài)的效應(yīng)。低溫處理對玉米成熟胚愈傷組織的形成也有一定影響，可以提高其愈傷形成和分化能力。二、實(shí)驗(yàn)器材超凈工作臺、鑷子、酒精燈、棉球、燒杯、廣口瓶。三、實(shí)驗(yàn)藥品MS培養(yǎng)基母液、2,4-D、6-BA、KT、吲哚乙酸(IAA)、腺嘌呤、天冬氨酸、谷氨酰胺、水解酪蛋白、蔗糖、瓊脂。四、實(shí)驗(yàn)步驟1、培養(yǎng)基的制備誘導(dǎo)培養(yǎng)基：

48、MS+ 2 ,4-D2 mg/ L + KT0.5 mg/ L+水解酪蛋白500 mg/ L +蔗糖3%+瓊脂0.8%，pH5.8。繼代培養(yǎng)基：MS+ 2 ,4-D1 mg/ L + KT0.5 mg/ L+水解酪蛋白300 mg/ L +蔗糖3%+瓊脂0.8%，pH5.8。分化培養(yǎng)基：MS+6-BA 2m g/l+水解酪蛋白500 mg/ L +蔗糖3%+瓊脂0.8%，pH5.8。小苗培養(yǎng)基:MS +NAA0.2m g/1+腺嘌呤40m g/l+蔗糖3%+瓊脂0.8%，pH5.8。生根壯苗培養(yǎng)基：1/2 MS +NAA0.5m g/1 +蔗糖3%+瓊脂0.8%，pH5.8。2、無菌材料的獲得將玉米種子在4冰箱中充分吸水，用0.1% HgCl2滅菌20min，無菌