石蠟切片免疫組化及免疫熒光染色方法

1、石蠟切片免疫組化及免疫熒光染色方法1、組織的采集、固定和保存：實行組織后，方法一：4%多聚甲醛（4%PFA）4°C 固定1小時（依據(jù)組織大小和致密程度調(diào)整固定時間）或過夜方法二：接受bouins固定RT 2h（6-8d tesis）or RT 過夜（成年 tesis）PBS緩沖液洗三次，每次5min，4°C保存于70%乙醇中。2、組織的包埋、切片、展片及保存： 固定后的樣品經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透亮，52-54°C石蠟包埋，常規(guī)切片，切片厚4 -10mm，貼于處理過的潔凈載玻片上，37°C烤片過夜，之后收集于載片盒中，RT密封保存。 石蠟包埋：保存于4&

2、#176;C 70%乙醇中的組織樣品 ¯ 80%乙醇 15 min ¯ 95%乙醇 15 min ¯ 100%乙醇 15min ´ 2 ¯ 1/2乙醇1/2二甲苯 15 min ¯ 二甲苯透亮 5-10 min ¯ 1/2二甲苯1/2石蠟 30 min ¯ 石蠟（1） 1.5hr ¯ 石蠟（2） 1.5-2.5hr ¯石蠟（3） 包埋¯RT保存3、石蠟組織切片的免疫組化方法： 密封保存于RT的組織切片 ¯ 二甲苯(1) 20 min ¯ 二甲苯(2) 20 min

3、¯ 100%乙醇 20min ¯ 95%乙醇 10 min ¯ 80%乙醇 10 min ¯ 通風(fēng)櫥晾干，阻水筆在組織四周畫圈 ¯ 切片在PBS中浸泡 5 min*2 ¯ 0.4%Tritonx RT 10 min ¯ 切片在PBS中浸泡 5 min*3 3%H2O2 RT 10min 切片在PBS中浸泡 5 min*3 0.25%胰酶 RT 10min 切片在PBS中浸泡 5 min*3 Blocking buffer(3%BSA+5%NGS+0.2%Tritonx-100 in PBS) RT 60min 傾去block

4、ing buffer，勿洗 一抗4°C overnight in blocking buffer 取出切片復(fù)溫1h，切片在PBS中浸泡 5 min*3 二抗in blocking buffer GAR1：200 （GAM1：100），RT 1h 切片在PBS中浸泡 5 min*3 DAB顯色5-10min（50微升A+50微升B+900微升PBS+5微升3%H2O2） 假如是增加型DAB只要1min即可。 切片浸入PBS終止顯色，HE襯染1s， 玻片架放入泡沫盒，流水沖洗15min，肉眼看到淡淡的紫色即可停止。 若顏色太深，可用0.1-0.5%鹽酸乙醇分色12秒鐘（或更久） 脫水85

5、%乙醇 5 min ¯ 95%乙醇 5 min ¯ 無水乙醇 5 min ¯ 無水乙醇 5min ¯ 二甲苯(1) 10min ¯ 二甲苯(2) 10min ¯ 中性樹膠封片，室溫干燥保存4、石蠟組織切片的免疫熒光方法： 密封保存于RT的組織切片 ¯ 二甲苯(1) 20 min ¯ 二甲苯(2) 20 min ¯ 100%乙醇 20min ¯ 95%乙醇 10 min ¯ 80%乙醇 10 min ¯ 通風(fēng)櫥晾干，阻水筆在組織四周畫圈 ¯ 切片在PBS中浸泡 5 min*2 ¯ 0.4%Tritonx RT 10 min ¯ 切片在PBS中浸泡 5 min*3 切片在PBS中浸泡 5 min*3 0.25%胰酶 RT 10min 切片在PBS中浸泡 5 min*3 Blocking buffer(3%BSA+5%NGS+0.2%Tritonx-100 in PBS) RT 60min 傾去blocking buffer，勿洗 一抗4°C overnight in blocking buffer 取出切片復(fù)溫1h，切片在PBS中浸泡 5 min*3 熒光二抗in blocking buffer GAR-cy3