【干貨】真菌檢測中常見問題專家解答

1、【干貨】真菌檢測中常見問題專家解答近年來，隨著惡性腫瘤的高發(fā)、艾滋病的流行、化療藥物、廣譜抗生素、糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑等藥物的廣泛使用，以及人工導(dǎo)管等侵入性操作、器官移植等有創(chuàng)診療技術(shù)的應(yīng)用，由真菌所引起的感染日益成為臨床各科室面臨的巨大挑戰(zhàn)。為了提高臨床診斷水平，加強真菌的檢驗?zāi)芰︼@得至關(guān)重要，現(xiàn)在臨床微生物實驗室有關(guān)真菌檢驗的常見問題匯總?cè)缦?，供大家學(xué)習(xí)參考。1、為什么培養(yǎng)要設(shè)定35C?實驗室通常將孵箱溫度設(shè)定為35C,是為了防止溫度的波動對細(xì)菌或真菌生長的影響。臨床常見細(xì)菌的最適生長溫度為3337c（嗜熱，嗜中溫菌除外，占少數(shù)），設(shè)定為35c時上下波動2c對培養(yǎng)無影響，如設(shè)定為37CC

2、顯然就不合適了。至于真菌培養(yǎng)，要視標(biāo)本來源而定。一般懷疑淺部真菌感染的標(biāo)本如皮屑、甲屑、頭屑及毛發(fā)等分離培養(yǎng)于2628C。來源于人體深部組織的標(biāo)本如痰、胸腹水、血及骨髓深部膿腫等,建議放35c培養(yǎng)，是剛離體的標(biāo)本在35c更接近于人體溫度，其次臨床最常見的白念珠菌在35c能形成更為典型的偽足樣菌落，這與血清生芽試驗在35c做是同樣的道理。同時來源于35c初分離的光滑念珠菌具有更高的酶活性。懷疑溫度型雙相真菌感染或個別真菌需要較高溫度生長時則需要兩種溫度同時培養(yǎng)。還要注意培養(yǎng)環(huán)境的濕度，一般要求大于60%,如果培養(yǎng)箱的濕度不夠，最好在平板附近放置盛有無菌水的容器以保證濕度。2、CO2對真菌生長影響

3、大嗎？真菌屬于異養(yǎng)型微生物，主要從有機化合物中獲得碳源，而自養(yǎng)型微生物才需要從CO2中獲得碳源，所以真菌一般不需要在二氧化碳環(huán)境中培養(yǎng)，而且CO2對真菌的生長和繁殖均不利，但一定濃度可刺激胞子形成。3、在血培養(yǎng)中培養(yǎng)生真菌2次，但是患兒沒有臨床表現(xiàn)，而且臨床也沒用抗真菌藥患兒就好了，是考慮污染嗎？這種情況要判斷是否為污染菌，調(diào)查采血過程是否規(guī)范、血瓶轉(zhuǎn)運過程是否符合要求、針孔是否適當(dāng)封口、轉(zhuǎn)運箱是否受到污染等眾多因素，最關(guān)鍵的還是患者的臨床表現(xiàn)，如沒有真菌感染的癥狀，要么考慮污染，要么考慮定植（可能性不大）。4、我們基層醫(yī)院實際工作中做陰道分泌物真菌培養(yǎng)，生化鑒定幾乎做不了，很多直接報白念珠菌

4、，這樣合適嗎？這樣做不合適。目前有些檢驗科甚至分不清醉母菌和霉菌，在陰道白帶、尿液和糞便中鏡檢發(fā)現(xiàn)念珠菌后報告為“找到霉菌”。霉菌是指絲狀多細(xì)胞真菌；醉母菌是指單細(xì)胞形態(tài)的真菌，二者不可混為一談。陰道中感染的醉母菌大多是白念珠菌，但不排除其他醉母菌?？巳崮钪榫鷮Ψ堤绾?-氟胞喀陡天然耐藥，如果遇到類似存在天然耐藥的菌株，會影響后續(xù)的治療。5、痰標(biāo)本中少量念珠菌需要在報告中體現(xiàn)嗎？還是不報告？標(biāo)本要求和檢驗程序用要體現(xiàn)，臨床醫(yī)生會綜合考慮。雖然白色念珠菌導(dǎo)致肺部真菌感染的概率很小，遇到痰標(biāo)本真菌培養(yǎng)中分離由該真菌，還是建議報告，臨床醫(yī)生結(jié)合影像學(xué)結(jié)果綜合考慮。先進性痰標(biāo)本直接涂片，標(biāo)本質(zhì)量合格

5、的情況下，見到真、假菌絲或大量胞子，痰培養(yǎng)有真菌生長，還是要報給臨床醫(yī)生，臨床醫(yī)生會綜合考慮的。至于是否要做藥敏，可和醫(yī)生溝通后決定。建議留樣本前5%蘇打水漱口；清晨第一口痰；連送3d結(jié)果是否一致。最好和臨床醫(yī)生溝通一下，或平時對醫(yī)生、護士進行標(biāo)本采集方法的培訓(xùn)。報告之前，結(jié)合痰涂片鏡檢結(jié)果，備注標(biāo)本質(zhì)量信息及污染可能性。6、請問一下：前幾天遇到一個抽生的膿液標(biāo)本，打到血培養(yǎng)中，報陽后涂片顯示真菌抱子，轉(zhuǎn)種后涂片，形態(tài)上圓形，墨汁染色陽性，但是沒有英膜，轉(zhuǎn)種科瑪嘉沒有顏色，后有白色有點黃色，用莫國產(chǎn)鑒定顯示近平滑，藥敏全耐。問題是:這個結(jié)果可信不？墨汁用的是普通汁有影響嗎？該如何改進？墨汁染色

6、是針對標(biāo)本中懷疑隱球菌屬的莢膜進行負(fù)染，特別是新生隱球菌才做的試驗，對純培養(yǎng)的隱球菌屬不可作為鑒定試驗。（1）將之前的膿液標(biāo)本做個10%KOH濕片檢，尋找真菌抱子和真、假菌絲。（2）培養(yǎng)結(jié)果應(yīng)該是可信的，最好和臨床醫(yī)生溝通一下，看患者是否有癥狀。（3）對莫國產(chǎn)品牌不熟悉，鑒定結(jié)果和藥敏結(jié)果不好判斷（4）按照全國操作規(guī)程配制念珠菌的鑒定生化管，用原衛(wèi)生部質(zhì)控真菌鑒定符合率還是很好的，可以考慮自配生化鑒定管，用質(zhì)控真菌進行驗證。（5）對每批號的莫國產(chǎn)鑒定管用質(zhì)控真菌進行驗證,如果結(jié)果符合，應(yīng)該沒問題。（6）最好參加原衛(wèi)生部微生物質(zhì)控培訓(xùn)，無論細(xì)菌、醉母菌方面，都會幫助你提高業(yè)務(wù)水平和驗證你所用的試

7、劑質(zhì)量。（7）墨汁只要粗細(xì)均勻，顆粒越細(xì)小越好，推薦曹素功墨汁，試劑公司也有印度墨汁可采購。7、臨床常見痰標(biāo)本初次檢由曲霉后，流程是怎么進行下去的？（1）痰標(biāo)本初次培養(yǎng)生絲狀真菌菌落，前提是痰標(biāo)本必須是新鮮的或不能立即送檢應(yīng)4c冰箱保存。流程是接受痰標(biāo)本-鏡檢-培養(yǎng)-鑒定。在痰標(biāo)本合格的情況下，先做個10%KOH濕片鏡檢，低倍鏡尋找真菌菌絲，是透明或暗色，是否有45度分枝。如果痰標(biāo)本合格，又找到菌絲，電話聯(lián)系臨床，告訴醫(yī)生有絲狀真菌生長，懷疑是XXXX,容易的直接報告臨床，難的點種沙氏瓊脂平板或察氏瓊脂平板，再做進步鑒定。（2）若標(biāo)本不合格或合格但標(biāo)本中未見菌絲，和臨床醫(yī)生電話溝通，告知有真菌

8、生長，讓醫(yī)生綜合考慮。鑒定正常進行，并報告臨床，備注不排除污染可能。8、醉母菌同化試驗為什么放28c而不是35C?同化試驗和發(fā)醉試驗有何區(qū)別？為什么教科書上說凡能發(fā)醉莫種糖，一定能同化該糖，同化莫種糖則不一定發(fā)醉該糖？多數(shù)醉母菌體外最適生長溫度為28-30C,故其體外試驗選用此溫度。通話和發(fā)醉分別指真菌的有氧呼吸和無氧醉解，前者將糖類分解為二氧化碳和水，后者將糖類分解為二氧化碳和酒精等。其代謝首先進行的是有氧呼吸獲得能量，再進一步進行無氧醉解，這由細(xì)菌和真菌的相關(guān)酶類決定。醉母菌多數(shù)為專性需氧菌，所以其試驗設(shè)計多以糖同化試驗為主。比如隱球醉母只能進行有氧呼吸，所以只能同化葡萄糖而不能發(fā)醉，而釀

9、酒醉母可將糧食發(fā)醉為酒，既發(fā)醉也同化葡萄糖。9、鑒于目前真菌培養(yǎng)不是很規(guī)范，如何選擇培養(yǎng)基、溫度、報告時間和方式？請講述實驗室的具體流程。(1)培養(yǎng)基：沙氏葡萄糖瓊脂、馬鈴薯葡萄糖瓊脂、腦心浸膏瓊脂等適宜真菌生長的培養(yǎng)基，臨床疑似醉母菌及醉母樣菌感染，有條件實驗室可平行接種顯色培養(yǎng)基，推薦采用螺口管斜面培養(yǎng)法，標(biāo)本處理后接種于培養(yǎng)基斜面中下部，真菌絕大多數(shù)為需氧菌建議平行接種兩管。(2)培養(yǎng)條件及報告時間：深部真菌28±1C培養(yǎng)714d,如懷疑雙相真菌感染，應(yīng)同時在28±1C及35±1C培養(yǎng)。懷疑罕見真菌慢生長真菌感染或臨床已用抗真菌藥物時，延長觀察時間至少培養(yǎng)4

10、周。如CSF宜置28c及35c兩個溫度培養(yǎng)至少一周；痰/尿/糞一般35c48h即可，如未見絲狀真菌生長，則延長培養(yǎng)時間；組織標(biāo)本一般30C,24周。10、是否可以用科瑪嘉顯色培養(yǎng)基作為真菌初代培養(yǎng)基？可作為初代培養(yǎng)基之一，建議另外接種沙氏培養(yǎng)基或醉母氮培養(yǎng)基(YPDA),SDA和YPDA一般是醉母樣菌的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基。11、咽拭子真菌培養(yǎng)有意義嗎？咽拭子培養(yǎng)真菌意義不大，存在定植除非患者有臨床表現(xiàn)。12、請問痰標(biāo)本念珠菌定植率那么高，痰涂片看到比較多的胞子和假菌絲要怎么報告才比較合理？個人覺得還是要如實報告臨床醫(yī)生、并將標(biāo)本質(zhì)量是否合格告知臨床醫(yī)生，至于是否感染，臨床醫(yī)生會根據(jù)影像學(xué)資料、患者臨床

11、表現(xiàn)等綜合考慮的。13、患者的手上有濕疹一樣的丘疹，懷疑真菌感染，請問怎么樣采樣好？對于皮損類的標(biāo)本采集，需要用70%的酒精先將患處消毒處理，再使用已消毒的不銹鋼刮刀或外科手術(shù)刀在皮損邊緣刮取皮屑，裝在無菌容器內(nèi)送檢。14、我們用一次性手套裝SDA平板可以嗎？一次性手套無論是PV還是乳膠，都會產(chǎn)生相對低氧的環(huán)境，而真菌是需氧菌會影響真菌的生長，不建議這樣操作?？梢允褂猛笟庑院玫哪z帶(靜脈輸液固定針頭的)封閉平板，注意不要封太死。15、用的墨汁在顯微鏡下不是均勻的黑色背景，而是一些細(xì)小黑色顆粒，這是不是墨汁的質(zhì)量不好？還有，生物安全柜、超凈工作臺和通風(fēng)柜三者有什么區(qū)別？墨汁本身就是一些細(xì)微小顆粒

12、加入溶媒形成的，墨汁質(zhì)量的好壞在于顆粒的大小和均一性。一般的墨汁檢測隱球菌應(yīng)該能觀察，它只是作為背景，莢膜不染色，為透明的，背景是黑色。生物安全柜和超凈工作臺的區(qū)別在于風(fēng)吹的方向：生物安全柜的風(fēng)向是先垂直向下再向柜內(nèi)，經(jīng)過循環(huán)通過HEPA過濾后再排由，柜內(nèi)形成一個相對負(fù)壓的環(huán)境；超凈工作臺的風(fēng)向是先向下再向外吹，保證柜內(nèi)的清潔無塵，通常用來配置平板和操作一些簡單的分子克隆相關(guān)實驗。通風(fēng)柜是通過風(fēng)機將柜內(nèi)的空氣排到實驗室外，通常用來配置有揮發(fā)性的化學(xué)品試劑，有害氣體排向室外。16、痰涂片中看到曲霉頭，有多大臨床意義？毛霉有沒有污染可能？或者是定值？在痰里一直檢查到青霉菌，沒有意義嗎？如果痰標(biāo)本直

13、接鏡檢發(fā)現(xiàn)曲霉頭，那就要考慮是曲霉感染。培養(yǎng)可以確定是哪一種曲霉。毛霉存在污染的可能性，空氣中也可以存在，但又因其高度的侵襲性，報告需謹(jǐn)慎，定值的可能性很小，但操作中污染的情況還是不少的。若標(biāo)本合格，濕片鏡檢有90度分枝及粗大、不分隔的菌絲，那就要考慮感染了，否則有污染可能，最好及時聯(lián)系臨床醫(yī)生。青霉菌是一種條件致病真菌，如果痰中直接鏡檢查到菌絲，培養(yǎng)陽性，還是考慮感染。17、在經(jīng)驗積累的初期，如何得到足夠的菌株，用于練習(xí)各類染色、閱片呢？有條件的話，最好到相關(guān)醫(yī)院真菌室進修學(xué)習(xí)濕片鏡檢、真菌鑒定，將保存的菌株分批轉(zhuǎn)種后，仔細(xì)研究其菌落顏色、大小質(zhì)地等變化和鏡檢變化，并做好筆記?；騾⒓俞t(yī)學(xué)真菌

14、專業(yè)培訓(xùn)班進行系統(tǒng)學(xué)習(xí)。18、如何保存真菌菌株？最好的方法就是真空干燥、低溫凍存。國際菌株保藏機構(gòu)都是這種方法。（1）將生長的斜面直接放在-10c冷凍，表皮癬菌和許多接合菌綱菌種不可用此法保存。（2）蒸儲水保存法：將生長在馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基上的成熟的菌落，刮取菌絲體、芽胞或醉母細(xì)胞或利無菌蒸儲水沖洗斜面表面，再以吸管吸取放在無菌小管中，密封阻止蒸發(fā)，置于室溫保存。（3）另一種方法為直接加無菌礦物油至霉菌生長的瓊脂斜面，至少可保存半年以上。（4）基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基中加入15%30%甘油，將新鮮成熟菌落挑至其中，-80C保存。19、一般什么樣的患者我們會重點去關(guān)注是否為真菌感染呢？免疫缺陷病患者、器官

15、移植患者、腫瘤患者、中性粒細(xì)胞減少患者糖尿病患者及較長時間使用廣譜抗生素的患者。20、霉菌培養(yǎng)箱（28C）被污染后如何處理？培養(yǎng)基放進培養(yǎng)箱后很快長污染菌，尤其門上的密封條上也長菌了，怎么辦？斷電后，甲醛熏蒸，5%苯酚（石炭酸）擦拭后停留30min后，清水擦拭，打開通風(fēng)24h后再使用。21、血培養(yǎng)中可能培養(yǎng)由哪些絲狀真菌？哪些是污染？血培養(yǎng)陽性的絲狀真菌主要有組織胞漿菌、馬爾尼菲藍狀菌、鐮刀菌、念珠菌、隱球菌、毛胞子菌、賽多抱，人眼球組織（研磨后打入血培養(yǎng)瓶）里曾培養(yǎng)由紫色擬青霉。腹水打入血培養(yǎng)瓶培養(yǎng)由棕黑腐殖霉。文獻報告皮炎芽生菌、伊蒙菌、球胞子菌都可以從血培養(yǎng)里培養(yǎng)由來。煙曲霉是污染的，有報告土曲霉的心內(nèi)膜炎患者外周血培養(yǎng)由來土曲霉IClinMicrobiol.1998Nov;36(11):3347-51。22、呼吸科患者，男，61歲，診斷支氣管肺炎，HIIV陰性，在合格痰內(nèi)培養(yǎng)由馬爾尼菲藍狀菌3+,可以診斷嗎？有必要復(fù)檢嗎？他肝脾大嗎？是否有骨骼受累及？