【干貨】真菌檢測(cè)中常見問(wèn)題專家解答

1、【干貨】真菌檢測(cè)中常見問(wèn)題專家解答近年來(lái)，隨著惡性腫瘤的高發(fā)、艾滋病的流行、化療藥物、廣譜抗生素、糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑等藥物的廣泛使用，以及人工導(dǎo)管等侵入性操作、器官移植等有創(chuàng)診療技術(shù)的應(yīng)用，由真菌所引起的感染日益成為臨床各科室面臨的巨大挑戰(zhàn)。為了提高臨床診斷水平，加強(qiáng)真菌的檢驗(yàn)?zāi)芰︼@得至關(guān)重要，現(xiàn)在臨床微生物實(shí)驗(yàn)室有關(guān)真菌檢驗(yàn)的常見問(wèn)題匯總?cè)缦?，供大家學(xué)習(xí)參考。1、為什么培養(yǎng)要設(shè)定35C?實(shí)驗(yàn)室通常將孵箱溫度設(shè)定為35C,是為了防止溫度的波動(dòng)對(duì)細(xì)菌或真菌生長(zhǎng)的影響。臨床常見細(xì)菌的最適生長(zhǎng)溫度為3337c（嗜熱，嗜中溫菌除外，占少數(shù)），設(shè)定為35c時(shí)上下波動(dòng)2c對(duì)培養(yǎng)無(wú)影響，如設(shè)定為37CC

2、顯然就不合適了。至于真菌培養(yǎng)，要視標(biāo)本來(lái)源而定。一般懷疑淺部真菌感染的標(biāo)本如皮屑、甲屑、頭屑及毛發(fā)等分離培養(yǎng)于2628C。來(lái)源于人體深部組織的標(biāo)本如痰、胸腹水、血及骨髓深部膿腫等,建議放35c培養(yǎng)，是剛離體的標(biāo)本在35c更接近于人體溫度，其次臨床最常見的白念珠菌在35c能形成更為典型的偽足樣菌落，這與血清生芽試驗(yàn)在35c做是同樣的道理。同時(shí)來(lái)源于35c初分離的光滑念珠菌具有更高的酶活性。懷疑溫度型雙相真菌感染或個(gè)別真菌需要較高溫度生長(zhǎng)時(shí)則需要兩種溫度同時(shí)培養(yǎng)。還要注意培養(yǎng)環(huán)境的濕度，一般要求大于60%,如果培養(yǎng)箱的濕度不夠，最好在平板附近放置盛有無(wú)菌水的容器以保證濕度。2、CO2對(duì)真菌生長(zhǎng)影響

3、大嗎？真菌屬于異養(yǎng)型微生物，主要從有機(jī)化合物中獲得碳源，而自養(yǎng)型微生物才需要從CO2中獲得碳源，所以真菌一般不需要在二氧化碳環(huán)境中培養(yǎng)，而且CO2對(duì)真菌的生長(zhǎng)和繁殖均不利，但一定濃度可刺激胞子形成。3、在血培養(yǎng)中培養(yǎng)生真菌2次，但是患兒沒(méi)有臨床表現(xiàn)，而且臨床也沒(méi)用抗真菌藥患兒就好了，是考慮污染嗎？這種情況要判斷是否為污染菌，調(diào)查采血過(guò)程是否規(guī)范、血瓶轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程是否符合要求、針孔是否適當(dāng)封口、轉(zhuǎn)運(yùn)箱是否受到污染等眾多因素，最關(guān)鍵的還是患者的臨床表現(xiàn)，如沒(méi)有真菌感染的癥狀，要么考慮污染，要么考慮定植（可能性不大）。4、我們基層醫(yī)院實(shí)際工作中做陰道分泌物真菌培養(yǎng)，生化鑒定幾乎做不了，很多直接報(bào)白念珠菌

4、，這樣合適嗎？這樣做不合適。目前有些檢驗(yàn)科甚至分不清醉母菌和霉菌，在陰道白帶、尿液和糞便中鏡檢發(fā)現(xiàn)念珠菌后報(bào)告為“找到霉菌”。霉菌是指絲狀多細(xì)胞真菌；醉母菌是指單細(xì)胞形態(tài)的真菌，二者不可混為一談。陰道中感染的醉母菌大多是白念珠菌，但不排除其他醉母菌?？巳崮钪榫鷮?duì)氟康嚏和5-氟胞喀陡天然耐藥，如果遇到類似存在天然耐藥的菌株，會(huì)影響后續(xù)的治療。5、痰標(biāo)本中少量念珠菌需要在報(bào)告中體現(xiàn)嗎？還是不報(bào)告？標(biāo)本要求和檢驗(yàn)程序用要體現(xiàn)，臨床醫(yī)生會(huì)綜合考慮。雖然白色念珠菌導(dǎo)致肺部真菌感染的概率很小，遇到痰標(biāo)本真菌培養(yǎng)中分離由該真菌，還是建議報(bào)告，臨床醫(yī)生結(jié)合影像學(xué)結(jié)果綜合考慮。先進(jìn)性痰標(biāo)本直接涂片，標(biāo)本質(zhì)量合格

5、的情況下，見到真、假菌絲或大量胞子，痰培養(yǎng)有真菌生長(zhǎng)，還是要報(bào)給臨床醫(yī)生，臨床醫(yī)生會(huì)綜合考慮的。至于是否要做藥敏，可和醫(yī)生溝通后決定。建議留樣本前5%蘇打水漱口；清晨第一口痰；連送3d結(jié)果是否一致。最好和臨床醫(yī)生溝通一下，或平時(shí)對(duì)醫(yī)生、護(hù)士進(jìn)行標(biāo)本采集方法的培訓(xùn)。報(bào)告之前，結(jié)合痰涂片鏡檢結(jié)果，備注標(biāo)本質(zhì)量信息及污染可能性。6、請(qǐng)問(wèn)一下：前幾天遇到一個(gè)抽生的膿液標(biāo)本，打到血培養(yǎng)中，報(bào)陽(yáng)后涂片顯示真菌抱子，轉(zhuǎn)種后涂片，形態(tài)上圓形，墨汁染色陽(yáng)性，但是沒(méi)有英膜，轉(zhuǎn)種科瑪嘉沒(méi)有顏色，后有白色有點(diǎn)黃色，用莫國(guó)產(chǎn)鑒定顯示近平滑，藥敏全耐。問(wèn)題是:這個(gè)結(jié)果可信不？墨汁用的是普通汁有影響嗎？該如何改進(jìn)？墨汁染色

6、是針對(duì)標(biāo)本中懷疑隱球菌屬的莢膜進(jìn)行負(fù)染，特別是新生隱球菌才做的試驗(yàn)，對(duì)純培養(yǎng)的隱球菌屬不可作為鑒定試驗(yàn)。（1）將之前的膿液標(biāo)本做個(gè)10%KOH濕片檢，尋找真菌抱子和真、假菌絲。（2）培養(yǎng)結(jié)果應(yīng)該是可信的，最好和臨床醫(yī)生溝通一下，看患者是否有癥狀。（3）對(duì)莫國(guó)產(chǎn)品牌不熟悉，鑒定結(jié)果和藥敏結(jié)果不好判斷（4）按照全國(guó)操作規(guī)程配制念珠菌的鑒定生化管，用原衛(wèi)生部質(zhì)控真菌鑒定符合率還是很好的，可以考慮自配生化鑒定管，用質(zhì)控真菌進(jìn)行驗(yàn)證。（5）對(duì)每批號(hào)的莫國(guó)產(chǎn)鑒定管用質(zhì)控真菌進(jìn)行驗(yàn)證,如果結(jié)果符合，應(yīng)該沒(méi)問(wèn)題。（6）最好參加原衛(wèi)生部微生物質(zhì)控培訓(xùn)，無(wú)論細(xì)菌、醉母菌方面，都會(huì)幫助你提高業(yè)務(wù)水平和驗(yàn)證你所用的試

7、劑質(zhì)量。（7）墨汁只要粗細(xì)均勻，顆粒越細(xì)小越好，推薦曹素功墨汁，試劑公司也有印度墨汁可采購(gòu)。7、臨床常見痰標(biāo)本初次檢由曲霉后，流程是怎么進(jìn)行下去的？（1）痰標(biāo)本初次培養(yǎng)生絲狀真菌菌落，前提是痰標(biāo)本必須是新鮮的或不能立即送檢應(yīng)4c冰箱保存。流程是接受痰標(biāo)本-鏡檢-培養(yǎng)-鑒定。在痰標(biāo)本合格的情況下，先做個(gè)10%KOH濕片鏡檢，低倍鏡尋找真菌菌絲，是透明或暗色，是否有45度分枝。如果痰標(biāo)本合格，又找到菌絲，電話聯(lián)系臨床，告訴醫(yī)生有絲狀真菌生長(zhǎng)，懷疑是XXXX,容易的直接報(bào)告臨床，難的點(diǎn)種沙氏瓊脂平板或察氏瓊脂平板，再做進(jìn)步鑒定。（2）若標(biāo)本不合格或合格但標(biāo)本中未見菌絲，和臨床醫(yī)生電話溝通，告知有真菌

8、生長(zhǎng)，讓醫(yī)生綜合考慮。鑒定正常進(jìn)行，并報(bào)告臨床，備注不排除污染可能。8、醉母菌同化試驗(yàn)為什么放28c而不是35C?同化試驗(yàn)和發(fā)醉試驗(yàn)有何區(qū)別？為什么教科書上說(shuō)凡能發(fā)醉莫種糖，一定能同化該糖，同化莫種糖則不一定發(fā)醉該糖？多數(shù)醉母菌體外最適生長(zhǎng)溫度為28-30C,故其體外試驗(yàn)選用此溫度。通話和發(fā)醉分別指真菌的有氧呼吸和無(wú)氧醉解，前者將糖類分解為二氧化碳和水，后者將糖類分解為二氧化碳和酒精等。其代謝首先進(jìn)行的是有氧呼吸獲得能量，再進(jìn)一步進(jìn)行無(wú)氧醉解，這由細(xì)菌和真菌的相關(guān)酶類決定。醉母菌多數(shù)為專性需氧菌，所以其試驗(yàn)設(shè)計(jì)多以糖同化試驗(yàn)為主。比如隱球醉母只能進(jìn)行有氧呼吸，所以只能同化葡萄糖而不能發(fā)醉，而釀

9、酒醉母可將糧食發(fā)醉為酒，既發(fā)醉也同化葡萄糖。9、鑒于目前真菌培養(yǎng)不是很規(guī)范，如何選擇培養(yǎng)基、溫度、報(bào)告時(shí)間和方式？請(qǐng)講述實(shí)驗(yàn)室的具體流程。(1)培養(yǎng)基：沙氏葡萄糖瓊脂、馬鈴薯葡萄糖瓊脂、腦心浸膏瓊脂等適宜真菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)基，臨床疑似醉母菌及醉母樣菌感染，有條件實(shí)驗(yàn)室可平行接種顯色培養(yǎng)基，推薦采用螺口管斜面培養(yǎng)法，標(biāo)本處理后接種于培養(yǎng)基斜面中下部，真菌絕大多數(shù)為需氧菌建議平行接種兩管。(2)培養(yǎng)條件及報(bào)告時(shí)間：深部真菌28±1C培養(yǎng)714d,如懷疑雙相真菌感染，應(yīng)同時(shí)在28±1C及35±1C培養(yǎng)。懷疑罕見真菌慢生長(zhǎng)真菌感染或臨床已用抗真菌藥物時(shí)，延長(zhǎng)觀察時(shí)間至少培養(yǎng)4

10、周。如CSF宜置28c及35c兩個(gè)溫度培養(yǎng)至少一周；痰/尿/糞一般35c48h即可，如未見絲狀真菌生長(zhǎng)，則延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間；組織標(biāo)本一般30C,24周。10、是否可以用科瑪嘉顯色培養(yǎng)基作為真菌初代培養(yǎng)基？可作為初代培養(yǎng)基之一，建議另外接種沙氏培養(yǎng)基或醉母氮培養(yǎng)基(YPDA),SDA和YPDA一般是醉母樣菌的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基。11、咽拭子真菌培養(yǎng)有意義嗎？咽拭子培養(yǎng)真菌意義不大，存在定植除非患者有臨床表現(xiàn)。12、請(qǐng)問(wèn)痰標(biāo)本念珠菌定植率那么高，痰涂片看到比較多的胞子和假菌絲要怎么報(bào)告才比較合理？個(gè)人覺(jué)得還是要如實(shí)報(bào)告臨床醫(yī)生、并將標(biāo)本質(zhì)量是否合格告知臨床醫(yī)生，至于是否感染，臨床醫(yī)生會(huì)根據(jù)影像學(xué)資料、患者臨床

11、表現(xiàn)等綜合考慮的。13、患者的手上有濕疹一樣的丘疹，懷疑真菌感染，請(qǐng)問(wèn)怎么樣采樣好？對(duì)于皮損類的標(biāo)本采集，需要用70%的酒精先將患處消毒處理，再使用已消毒的不銹鋼刮刀或外科手術(shù)刀在皮損邊緣刮取皮屑，裝在無(wú)菌容器內(nèi)送檢。14、我們用一次性手套裝SDA平板可以嗎？一次性手套無(wú)論是PV還是乳膠，都會(huì)產(chǎn)生相對(duì)低氧的環(huán)境，而真菌是需氧菌會(huì)影響真菌的生長(zhǎng)，不建議這樣操作?？梢允褂猛笟庑院玫哪z帶(靜脈輸液固定針頭的)封閉平板，注意不要封太死。15、用的墨汁在顯微鏡下不是均勻的黑色背景，而是一些細(xì)小黑色顆粒，這是不是墨汁的質(zhì)量不好？還有，生物安全柜、超凈工作臺(tái)和通風(fēng)柜三者有什么區(qū)別？墨汁本身就是一些細(xì)微小顆粒

12、加入溶媒形成的，墨汁質(zhì)量的好壞在于顆粒的大小和均一性。一般的墨汁檢測(cè)隱球菌應(yīng)該能觀察，它只是作為背景，莢膜不染色，為透明的，背景是黑色。生物安全柜和超凈工作臺(tái)的區(qū)別在于風(fēng)吹的方向：生物安全柜的風(fēng)向是先垂直向下再向柜內(nèi)，經(jīng)過(guò)循環(huán)通過(guò)HEPA過(guò)濾后再排由，柜內(nèi)形成一個(gè)相對(duì)負(fù)壓的環(huán)境；超凈工作臺(tái)的風(fēng)向是先向下再向外吹，保證柜內(nèi)的清潔無(wú)塵，通常用來(lái)配置平板和操作一些簡(jiǎn)單的分子克隆相關(guān)實(shí)驗(yàn)。通風(fēng)柜是通過(guò)風(fēng)機(jī)將柜內(nèi)的空氣排到實(shí)驗(yàn)室外，通常用來(lái)配置有揮發(fā)性的化學(xué)品試劑，有害氣體排向室外。16、痰涂片中看到曲霉頭，有多大臨床意義？毛霉有沒(méi)有污染可能？或者是定值？在痰里一直檢查到青霉菌，沒(méi)有意義嗎？如果痰標(biāo)本直

13、接鏡檢發(fā)現(xiàn)曲霉頭，那就要考慮是曲霉感染。培養(yǎng)可以確定是哪一種曲霉。毛霉存在污染的可能性，空氣中也可以存在，但又因其高度的侵襲性，報(bào)告需謹(jǐn)慎，定值的可能性很小，但操作中污染的情況還是不少的。若標(biāo)本合格，濕片鏡檢有90度分枝及粗大、不分隔的菌絲，那就要考慮感染了，否則有污染可能，最好及時(shí)聯(lián)系臨床醫(yī)生。青霉菌是一種條件致病真菌，如果痰中直接鏡檢查到菌絲，培養(yǎng)陽(yáng)性，還是考慮感染。17、在經(jīng)驗(yàn)積累的初期，如何得到足夠的菌株，用于練習(xí)各類染色、閱片呢？有條件的話，最好到相關(guān)醫(yī)院真菌室進(jìn)修學(xué)習(xí)濕片鏡檢、真菌鑒定，將保存的菌株分批轉(zhuǎn)種后，仔細(xì)研究其菌落顏色、大小質(zhì)地等變化和鏡檢變化，并做好筆記?；騾⒓俞t(yī)學(xué)真菌

14、專業(yè)培訓(xùn)班進(jìn)行系統(tǒng)學(xué)習(xí)。18、如何保存真菌菌株？最好的方法就是真空干燥、低溫凍存。國(guó)際菌株保藏機(jī)構(gòu)都是這種方法。（1）將生長(zhǎng)的斜面直接放在-10c冷凍，表皮癬菌和許多接合菌綱菌種不可用此法保存。（2）蒸儲(chǔ)水保存法：將生長(zhǎng)在馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基上的成熟的菌落，刮取菌絲體、芽胞或醉母細(xì)胞或利無(wú)菌蒸儲(chǔ)水沖洗斜面表面，再以吸管吸取放在無(wú)菌小管中，密封阻止蒸發(fā)，置于室溫保存。（3）另一種方法為直接加無(wú)菌礦物油至霉菌生長(zhǎng)的瓊脂斜面，至少可保存半年以上。（4）基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基中加入15%30%甘油，將新鮮成熟菌落挑至其中，-80C保存。19、一般什么樣的患者我們會(huì)重點(diǎn)去關(guān)注是否為真菌感染呢？免疫缺陷病患者、器官

15、移植患者、腫瘤患者、中性粒細(xì)胞減少患者糖尿病患者及較長(zhǎng)時(shí)間使用廣譜抗生素的患者。20、霉菌培養(yǎng)箱（28C）被污染后如何處理？培養(yǎng)基放進(jìn)培養(yǎng)箱后很快長(zhǎng)污染菌，尤其門上的密封條上也長(zhǎng)菌了，怎么辦？斷電后，甲醛熏蒸，5%苯酚（石炭酸）擦拭后停留30min后，清水擦拭，打開通風(fēng)24h后再使用。21、血培養(yǎng)中可能培養(yǎng)由哪些絲狀真菌？哪些是污染？血培養(yǎng)陽(yáng)性的絲狀真菌主要有組織胞漿菌、馬爾尼菲藍(lán)狀菌、鐮刀菌、念珠菌、隱球菌、毛胞子菌、賽多抱，人眼球組織（研磨后打入血培養(yǎng)瓶）里曾培養(yǎng)由紫色擬青霉。腹水打入血培養(yǎng)瓶培養(yǎng)由棕黑腐殖霉。文獻(xiàn)報(bào)告皮炎芽生菌、伊蒙菌、球胞子菌都可以從血培養(yǎng)里培養(yǎng)由來(lái)。煙曲霉是污染的，有報(bào)告土曲霉的心內(nèi)膜炎患者外周血培養(yǎng)由來(lái)土曲霉IClinMicrobiol.1998Nov;36(11):3347-51。22、呼吸科患者，男，61歲，診斷支氣管肺炎，HIIV陰性，在合格痰內(nèi)培養(yǎng)由馬爾尼菲藍(lán)狀菌3+,可以診斷嗎？有必要復(fù)檢嗎？他肝脾大嗎？是否有骨骼受累及？