分子生物學試驗常用工具酶總結(jié)

1、分子生物學實驗常用工具酶總結(jié)現(xiàn)代分子生物學實驗手冊工具酶基因工程：在人工可以控制條件下，將基因剪切或重新組合，再導入另一生物體內(nèi)，使這些基因在其中表達并遺傳下去的一門技術(shù)。核心：對基因進行人工切割、連接和重新組合，構(gòu)建重組DNA。工具酶：在基因工程的重組DNA過程中，所需要用到的酶的統(tǒng)稱。一、限制性內(nèi)切酶（restrictionendonuclease）主要功能：對外源性的雙鏈DNA進行切割、水解，不允許外源性DNA存在于細菌自身細胞內(nèi)。（這種酶能對在自身細胞內(nèi)存在的DNA種類給予限制限制性內(nèi)切酶）限制-修飾系統(tǒng)：合成限制性內(nèi)切酶的細胞，其自身的DNA不受酶的切割，這是因為細菌細胞還會合成一種

2、修飾酶，可以對自身DNA進行修飾，即改變DNA原來具有的可以被限制性內(nèi)切酶識別的核酸順序結(jié)構(gòu)，從而不被限制性內(nèi)切酶識別及切割、水解。保護自身遺傳物質(zhì)穩(wěn)定的機制。限制性內(nèi)切酶：從原核生物中發(fā)現(xiàn)的，約600種，可識別108種不同的特定DNA順序。以內(nèi)切方式水解核酸鏈中的磷酸二酯鍵，產(chǎn)生DNA片段的5'端為P,3'端為-OH。命名：獲得該酶的細菌屬名的第一個字母（大寫）+該菌種名的前兩個字母（小寫）+株系的字母（小寫）或數(shù)字+羅馬數(shù)字（同一株菌種不同內(nèi)切酶的編號）彳列：細菌屬名細菌種名菌株名稱限制酶名稱ArthrobacterluteusAluIEscherichiacoliRY13

3、EcoRIBacillusamyloliquefaciensHHamHIHaemophilusinfluenzaeRdHindIII（一）三種常用內(nèi)切酶I型限制性內(nèi)切酶同時兼有切割DNA的功能和修飾酶的修飾功能。在酶的識別位點上，若DNA兩條鏈菌沒有發(fā)生甲基化，則行使內(nèi)切酶的功能，對DNA進行切割，同時轉(zhuǎn)變成ATP酶。若DNA雙鏈中有一條鏈已發(fā)生甲基化，則此類酶顯示修飾酶的作用，對另一條DNA進行甲基化修飾，然后在行切割功能。（實際上，有內(nèi)切酶、修飾酶、ATP酶及解旋酶四種功能）I型限制性內(nèi)切酶在DNA鏈上的識別位點和切割位點不一致，也不固定沒有時間應(yīng)用價值。1. DNA甲基化：DNA化學修飾

4、的一種形式，能在不改變DNA序列的前提下，改變遺傳表現(xiàn)（外遺傳機制）。多發(fā)生于CpG二核昔序列上（在甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下，DNA的CG兩個核甘酸中的胞口密呢被選擇性添加甲基，形成5-甲基胞喀呢）。甲基化位點可隨DNA的復(fù)制而遺傳（DNA復(fù)制后，甲基化酶可將新和成的未甲基化的位點進行甲基化）。DNA甲基化可引起基因組中相應(yīng)區(qū)域染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變化，使DNA失去限制性內(nèi)切酶的切割位點，以及DNA酶的敏感位點，使染色質(zhì)高度螺旋化，凝縮成團，失去轉(zhuǎn)錄活性?！縄II型限制性內(nèi)切酶具有內(nèi)切酶和甲基化修飾酶作用。2. 具有專一的識別順序，其切割位點在識別順序旁邊的幾個核甘酸對的固定位置上。（可識別短的不對稱序列，切

5、割位點與識別序列約距2426bp）|型限制性內(nèi)切酶也具有限制-修飾系統(tǒng)，但由限制酶和修飾酶這兩種不同的酶共同來執(zhí)行這一系統(tǒng)的功能。即II型限制性內(nèi)切酶有在識別位點的切割功能，而不具備甲基化修飾活性，修飾作用由相應(yīng)的修飾酶完成。兩種酶識別同一DNA特定序列，卻發(fā)揮不同作用。能識別雙鏈DNA的特異順序，并在該順序內(nèi)的固定位置上進行切割，產(chǎn)生特異的DNA片段。II型限制性內(nèi)切酶的識別位點和切割位點是專一和固定的，對相同的基因片段的切割，總是得到同樣核甘酸順序的小DNA片段。這些切割后的不同大小的DNA片段，可以與統(tǒng)一內(nèi)切酶切割后的來源不同的其他DNA片段實行連接，而構(gòu)建重組DNA基因工程技術(shù)的核心I

6、I型限制性內(nèi)切酶識別的專一核甘酸順序，最常見的是46個堿基對。II型限制性內(nèi)切酶的識別順序是一個回文對稱順序（反轉(zhuǎn)重復(fù)順序），具有180°的旋轉(zhuǎn)對稱性。識別順序有一個中心對稱軸，從這個軸朝兩個方面讀序都是相同的。這類酶切割DNA可有兩種形式。交錯切割方式：如:5,GAATTCT3,CTTAAG7，tHcoRII5T-<AATTC-3?y-CTTAAG，T又如：jS'CTCGAGm3"G4GCTC5'*1今JI產(chǎn)生4個核君醪酬的丁潞M抹端r-CTCGAG-y3"GAGCTC-5'每種酶切割后個產(chǎn)生兩個DNA片段，每一個片段個含有一個單鏈

7、末端，單鏈末端是互補的，可以通過形成“氫鍵”而黏合。不同來源的兩條DNA片段經(jīng)同一種酶切割后，產(chǎn)生互補的黏性末端，通過選擇合適的DNA鏈接，可將兩條異源性DNA片段組合在一起。一一重組DNA的最基本原理用選擇專一性不同而產(chǎn)生相同黏性末端的兩種酶切割兩條不同的DNA片段，可使重組后的DNA片段不再被原來的酶所切割。如：SalI酶切割后產(chǎn)生的黏性末端st,XhoI酶切割后產(chǎn)生的黏性末端TCGAC+'3'51-GTCGAGTCT"兩者經(jīng)連接酶連接產(chǎn)生的序列3,cmcTOT,既不被SalI酶切割,也不被XhoI酶切割。在質(zhì)粒改造上很有用在同一位置上切割DNA5（鏈，產(chǎn)生平頭末

8、端。如：1CGCC-353'CCGC5nTRea口嚼SL-GGcc-r3CCGG5n（二）其他類型內(nèi)切酶1.同工酶（Boschizomer）：來源不同的兩種II型內(nèi)切酶，它們識別核甘酸順序及切割位點都相同，差別只在于當識別核甘酸序列中有甲基化的核甘酸時，一種內(nèi)切酶可以切割，而另一種不能。如：HpaII和MspI識別順序都是5,CCGG3若其中有5-甲基胞口密嗟）則只有Msp酶可切割（GGmCC）。2.Subset酶：識別順序及切割位點相互有關(guān)的酶，互稱Subset酶。如：SamI酶所識別的6個核甘酸順序中含有HpaII酶識別的4個核甘酸順序。所以這兩個酶可以相互代替使用，它們所切割的D

9、NA片段可以相互連接。3 .可變酶（特殊的）：識別核甘酸順序一般都大于6個，但其中一個或幾個核昔酸時可以變化的。.遠距離切割酶：識別核甘酸順序的位置與切割的位點不一致，一般切割位點與指標核甘酸順序的位置之間有10個左右核甘酸的距離。與I型內(nèi)切酶相似，不過I型內(nèi)切酶識別位點與切割位點的距離更遠一些。（三）甲基化酶（不屬于內(nèi)切酶）使識別順序中的某個核甘酸發(fā)生甲基化，保護DNA不被限制性內(nèi)切酶切開。M5C（5-甲基胞喀噬）大多數(shù)以M5CpG的形式存在，即CpG島中的C最容易是甲基化的底物，而甲基化又與受之調(diào)控的基因的表達程度有關(guān)。因此，研究CpG島的甲基化是研究基因調(diào)控的一個重要方向。當甲基化酶和限

10、制性內(nèi)切酶共同使用時，常常可以使有多個識別位點的內(nèi)切酶只對其中一個識別位點有切割效果，其他位點因被甲基化酶修飾而不能被切割。5-CPvCG?uG-3*如：限制性內(nèi)切酶Aval的識別順序是'等Py可以是任何一種喀呢，pu可以是任何一種喋吟。因此可以有4種識別順序。如果同時使用甲基化酶Taql和甲基化酶HpaH,則AvaI的識別順序?qū)⒅皇?'CCCGAG3'。E：二y-AGCnXCCOOACwTTTTCOCeGGAC-a,-I.；JSLCTQGtNTTmxAjUXCCTC'T匚ch.nuc«,nT7*cTCGAnGCGCC<XGMTTTTCCCGCC

11、AG-I'r-tcgacutccgcutcgwtcthaamxmx工ctc*'1Af*CH,i-AGtTCGOCCCC.4C-.k-TTACC'I*x.r(TljGCCTCH.3.(IX,ACXTTTTCC"CCt；3lC-ftnvuAGXmTCH,事安，*mwmih*t的配X-庠BRJUMrniNfF£FtG*TT申%等的獻瓶噬序術(shù)一sa7如上圖，一個基因片段被AvaI酶切割時，片段中有三個AvaI酶識別順序，該片段被切割成4個片段。但若先用TaqI甲基化酶和HpaII甲基化酶作用該片段時，片段中某些核甘酸發(fā)生甲基化修飾而不能被切割，再用AvaI酶

12、切割時，只能被切割成兩個片段?！疽患谆笇NA的某位點進行甲基化修飾，進而抵御內(nèi)切酶的切割一一構(gòu)建重組質(zhì)?！浚ㄋ模┡c內(nèi)切酶相關(guān)的幾個概念1 .酶活性單位及標準反應(yīng)體系酶活性單位：在一定溫度、PH及離子強度下，1h內(nèi)完全酶解（切割）特定底物DNA,所需限制內(nèi)切酶的量。（底物DNA:多用人噬菌體DNA又是可以用某一種酶在入噬菌體DNA上的切割位點，來推算用這種酶切割這種DNA時所需的活性單位。）2 標準反應(yīng)體系：在50M反應(yīng)體系及指定溫度下，使用特定的緩沖體系，用1個活性單位的限制內(nèi)切酶，酶解1聞底物DNA反應(yīng)1個小時。（若底物比1四多或少，可參照標準體系比例增加或減少酶用量。但增加酶用量時，

13、需注意不可加量過多一一內(nèi)切酶中通常含有甘油防凍劑，加入酶量過多，其中的甘油會降低內(nèi)切酶識別順序的特異性。也可通過延長反應(yīng)時間來保證完全的酶切。）.星號活力限制性內(nèi)切酶在非標準反應(yīng)條件下，切割一些與特異性識別順序相類似的順序活性（該酶的第二活性）。（產(chǎn)生許多不想得到的片段；內(nèi)切酶的識別切割能力下降，識別特異性下降。）引起星號活力的因素：過高的甘油含量（5為；低鹽離子強度（25mmol/L）;高PH值（8.0）;含有有機溶劑；含有非Mg二價離子；酶量過大（酶解1聞底物DNA用的內(nèi)切酶大于100個活性單位）。3 .限制性內(nèi)切酶底物位點優(yōu)勢效應(yīng)限制性內(nèi)切酶對同一DNA片段切割時，在對其可以識別的位點上

14、表現(xiàn)出不同的切割速率的現(xiàn)象。4 .限制性內(nèi)切酶質(zhì)量有良好的酶活性；不存在任何其他核酸內(nèi)切酶和外切酶的污染；長時間的酶切反應(yīng)不發(fā)生識別順序特異性的降低；被某一酶切割后的DNA經(jīng)重新連接后，仍能被同一酶再次識別并再次切割。內(nèi)切酶質(zhì)量的鑒定：50M反應(yīng)體系中以等量內(nèi)切酶分別以1h和12h（過夜）時間來切割底物DNA,用凝膠電泳檢查酶切結(jié)果。若不出現(xiàn)條帶數(shù)目的差別，則內(nèi)切酶質(zhì)量好。在T4DNA連接酶作用下，重新連接被內(nèi)切酶切割后的DNA片段，再用同一酶切割，若所產(chǎn)生的DNA片段的大小和數(shù)目和第一次切割的結(jié)果完全一樣，則說明酶的質(zhì)量好。一一可鑒定是否混有其他內(nèi)切酶和磷酸脂酶（DNA被內(nèi)切酶切割后，只有各

15、個片段的3OH和5P基團完好才能再次連接，連接的DNA仍能提供同一酶的相同切割位點，才會出現(xiàn)上面所說的兩個完全相同的結(jié)果。）二、DNA重組常用的其他酶類（一）DNA聚合酶（DNApolymerase）將一個脫氧三磷酸核甘酸加到引物（primer）的3-OH上，再釋放出一個焦磷酸分子（ppi）。1 .大腸桿菌DNA聚合酶（EcoliDNApolymerase）聚合酶I、II、III聚合酶I、II主要參與DNA修復(fù)，III主要參與DNA復(fù)制。三種都有沿模板按5'e方向合成互補DNA鏈的活性和按3'S'向的外切酶活性。聚合酶I還有5'e'向的外切酶活性。5&#

16、39;一3'聚合酶活性：填補DNA鏈上的缺口，或參與修復(fù)DNA合成過程中切除RN用|物后留下的空缺部分。3'-5'外切酶活性：消除在聚合作用中摻入的錯誤核甘酸。5'-CGCAICT3;GCGMg24鬃合酶1¥CGC3sGCGdAMPmn>dCMP5'一3'外切酶活性：切除受損的DNA?分一即門CGCATCTAG小3；GCGTAGATC5二聚合酶15,CATCTAG31.公明3:GCGTAGATC-5Z四螞【切口平移：切口產(chǎn)生3'羥基和5'磷酸基團,被小片段降解，缺口位點沿著雙鏈向3'端移動,射性標記核甘酸的

17、技術(shù)。duplexDftA.duplex;0IMAconiriiriinanickMftha3'OH中§位0byI861件Aevefjgjlfiucsfitter#af<?mewed1re>mtfie5"s&oiIherwekby¥-3rexoinudeaseacliEyc>lE.sJofiDMApatyrmrdsI麗Id：nudQ!iClosir&pk»»dbyinccrporator占laba-odhudM4«s>byE.口NApdyneraseiRepeli1iOHcJarcire

18、st*mtransEocnionH巾crocJcandu-niformabellng*1meSyrttiWSiZfid>MAgtrsndiKlenow酶：大腸桿菌DNA聚合酶I（109000Da）經(jīng)舒替蘭酶（枯草桿菌蛋白酶）水解獲得的76000Da片段。具有5'3'聚合酶活性和3'5'外切酶活性?？捎糜谔钛aDNA單鏈末端成為雙鏈?？捎糜诤铣蒫DNA第二鏈。<若將單核甘酸標記放射性核素，則可是合成的DNA雙鏈上帶上放射性核素標記。可用此酶通過切口平移來進行探針的放射性核素標記>DNA延伸合成3'端，5'端是在體外向DNA分子引入放

19、當雙鏈DNA分子的一條鏈上產(chǎn)生切口時，E.coli聚合酶I就可以將核普酸連接到切口的3,-OH末騎。2 .噬菌體DN隙合酶T4DNA聚合酶，也具有5'3'聚合酶活性和外切酶活性。外切酶活性比大腸桿菌DNAIK合酶外切酶活性強200倍。可用于探針的放射性核素標記。3 .噬熱水牛菌DN隙合酶從噬熱水生菌ThemusaquaticusYT-1菌株中分離得到。耐熱其中TaqDN咪合酶使用最多。7075C生物活性最高。在7580C條件下，每個酶蛋白分子每秒可以延長150個核甘酸一一被廣泛應(yīng)用于體外擴增特異性DNA>t段的技術(shù)（聚合酶鏈式反應(yīng)，PCR（二）RN咪合酶能利用DNAf乍為

20、模板，催化四種核糖核甘三磷酸（NTP底物合成RNAI:核仁中，轉(zhuǎn)錄rRNA順序RNAII:細胞質(zhì)中，轉(zhuǎn)錄大多數(shù)基因（蛋白質(zhì)基因和部分核內(nèi)小RNA基1I聚合因），轉(zhuǎn)錄是需要“TATA框（酶開始結(jié)合的位置，啟動子，II型轉(zhuǎn)錄單位特有的）。III:細胞核質(zhì)中，轉(zhuǎn)錄tRNA5SrRNA基因等少數(shù)幾個基因。（核質(zhì)：由單一密閉環(huán)狀DNA分子反復(fù)回旋卷曲盤繞組成的松散網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。無核膜、核仁）（三）DNA!接酶一一基因工程比用的工具酶T4DNA連接酶（T4DNAligase）Mg2+依賴性酶催化雙鏈DNAh具有相鄰的3'羥基和5'磷酸末端單鏈缺口的修復(fù)，以及具有黏性末端或平端的DNAt段的端端

21、連接的酶。DN啦接既可發(fā)生在DN砌子之間，也可發(fā)生在分子內(nèi)部。高濃度的DNA末端有利于分子間連接，低濃度則有利于環(huán)狀DN砌子的形成。DN啦接酶只能連接雙鏈DNAW不能連接單鏈DNA（四）反轉(zhuǎn)錄酶（逆轉(zhuǎn)錄酶，reversetranscriptase）以RNAJ模板指導三磷酸脫氧核甘酸合成互補DNA（cDNA的酶。需要Mg+、Mn+作為輔助因子I反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)SscDNA1反轉(zhuǎn)錄誨、DNA聚合馥以RNA為模板時，在反轉(zhuǎn)錄酶作用下，先合成單鏈DNA（ssDNA。再在反轉(zhuǎn)錄酶和DN咪合酶I作用下，以單鏈DNAJ模板合成“發(fā)夾”型的雙鏈DNA（dsDNA）odscDMA1核窿-51dsDNA,VJA最后在核酸

22、酶S1作用下，切割成兩條單鏈DNA反轉(zhuǎn)錄酶可用來把任何基因的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA拷貝，然后可大量擴增插入載體后的DNA。可用來標記cDNA作為放射性的分子探針。（五）核糖核甘酸A（RNaseA,ribnucleaseA）核酸內(nèi)切酶。特異的攻擊RNA上喀呢殘基的3'端，切割與相鄰核甘酸形成的磷酸二酯鍵，產(chǎn)生3'-磷酸喀噬核甘酸和以3'-磷酸喀嚏核甘酸結(jié)尾的寡核昔峻（一類只有20個以下堿基的短鏈核甘酸的總稱。寡核甘酸可以很容易地與它們的互補對鏈接，所以常用作探針確定DNA或RNA的結(jié)構(gòu)）。高濃度時，可對單鏈RNA的任何位點進行切割；低濃度時，只切割C和U的位點。一一檢測

23、寡核甘酸片段中是否含有C和U。有顯著的細胞毒性。RNaseA可用于檢測基因突變：利用RNA探針與突變基因形成RNA-DNA雜交體時，突變點處不能產(chǎn)生堿基互補（局部單鏈）這一特點，用RNaseA進行切割，切割產(chǎn)物可通過跑變性膠得到分離，可用放射自顯影等其他方法檢查片段數(shù)目及大小，從而推知發(fā)生突變的位點。RNA探針可通過將相應(yīng)的DNA片段克隆至含有SP6或T7啟動子的載體中得到。在操作RNA的實驗時一定要戴口罩和手套（RNaseA存在非常廣泛，人唾液、汗液中均含有），以避免有RNase的污染，所用的容器及蒸儲水也都必須經(jīng)去RNase處理。【用DEPC處理：0.1?100比例力口DEPC,37C12

24、h,高溫5min除去DEP熨留。含Tris的溶液不能用0.1%DEP（Ct理（DEPS和Tris的氨基反應(yīng)而降解，失去滅活RNase的能力），通?？筛挠肈EP（Ct理過的水來配DEPC已配好的可用1%DEPC理（不過會有DEP噴留）（六）核糖核酸酶T1（RNaseT1）核酸內(nèi)切酶。特異地攻擊鳥甘酸3惻的磷酸基團，切割與其相鄰核甘酸的5'-磷酯鍵，產(chǎn)生3'-磷酸鳥音和以3'-磷酸鳥喋吟核甘酸結(jié)尾的寡核甘酸。主要用于RNA測序和指紋圖譜分析/也可和RNase合用，以除去樣品中RNA;除去DNA-RNA雜交體中雜交體的RNA區(qū)。（七）核糖核酸酶H（RNaseH）核酸內(nèi)切酶。水

25、解RNA-DNA雜交體中的RNA鏈,產(chǎn)生5'-磷酸寡核甘酸和5'-磷酸核糖核甘。；使RNA被切割后成為DNA聚合酶合成第二條cDNA的引物，形成cDNA。（八）脫氧核糖核酸酶I（DNaseI,deoxyribonucleaseI）核酸內(nèi)切酶。Mg2+條件下，隨機切割單、雙鏈DNA,產(chǎn)生5'磷酸末端的單脫氧核甘酸和寡脫氧核甘酸。Mn2+存在下能將雙鏈DNA同時切斷，是DNA片段化。其活性依賴于Ca2+（輔因子），活化劑：Mg2+,抑制劑：螯合劑（EDTA等）DNase污染：用具要高溫處理，樣品中加EDTA,抑制酶活性；或冰水中滅活。、用途：除去RNA樣品中污染的基因組DN

26、A;轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后DNA模板的降解。（九）核酸酶S1（nucleaseS1）內(nèi)切酶（高度單鏈特異）。酶解單鏈DNA、單鏈RNA,產(chǎn)生5'-磷酸的單核甘酸或寡核甘酸。對雙鏈DNA、雙鏈RNA和DNA-RNA雜交體相對不敏感。需要低水平的Zn2+激活，PH4.04.3,抑制劑：螯合劑（EDTA、檸檬酸等）、磷酸緩沖液、和0.6%左右的SDS溶液。S1核酸酶的水解功能可以作用于雙鏈核酸分子的單鏈區(qū)，并從單戀部分切斷核酸分子，且這種單鏈區(qū)可以小刀只有一個堿基對的程度。一一去除DNA片段中突出的單鏈末端；切開合成dsDNA時形成的“發(fā)火”結(jié)構(gòu)。（十）核酸酶Bal31水解超螺旋DNA成開環(huán)狀，進而成為線狀DNA。有外切酶活性，在Mg2+、Ca2+參與下，能從DNA雙鏈兩端連續(xù)向中間切割水解?？捎糜贒NA鏈的限制性內(nèi)切酶切割位點分析（繪制DNA限制圖譜）；縮短DNA片段。（H一）核酸外切酶（exonuclease）是具有從DNA分子鏈的末端順次水解磷酸二酯鍵而生成單核甘酸作用的酶。兩種：水解磷酸二酯鍵的5'端生成3'-單核甘酸的酶；水解磷酸二酯鍵的3'端生成5'-單核甘酸的酶（大腸桿菌核酸外切酶I、II和III）。核酸外切酶III:從雙鏈DNA3O誼一降解切除5'單核甘酸。才0115Oii孑亍不降解單鏈DNA3'突出的雙鏈DNA具有多種酶