第十四章 RNA的生物合成

1、第十四章 RNA的生物合成RNA的生物合成包括轉(zhuǎn)錄和RNA的復(fù)制。轉(zhuǎn)錄（transcription）：以一段DNA的遺傳信息為模板，在RNA聚合酶作用下，合成出對(duì)應(yīng)的RNA的過(guò)程，或在DNA指導(dǎo)下合成RNA。轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物：mRNA 、rRNA、 tRNA、小RNA除某些病毒基因組RNA外，絕大多數(shù)RNA分子都來(lái)自DNA轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物。轉(zhuǎn)錄研究的主要問(wèn)題RNA聚合酶 轉(zhuǎn)錄過(guò)程 轉(zhuǎn)錄后加工 轉(zhuǎn)錄的調(diào)控是基本內(nèi)容，是目前研究的焦點(diǎn)，轉(zhuǎn)錄調(diào)控是基因調(diào)控的核心。轉(zhuǎn)錄與DNA復(fù)制的異同：相同：要有模板，新鏈延伸方向53，堿基的加入嚴(yán)格遵循堿基配對(duì)原則。相異：復(fù)制需要引物，轉(zhuǎn)錄不需引物。 轉(zhuǎn)錄時(shí)，模板DNA的信息全

2、保留，復(fù)制時(shí)模板信息是半保留。 轉(zhuǎn)錄時(shí)，RNA聚合酶只有53聚合作用，無(wú)53及35外切活性。轉(zhuǎn)錄是基因表達(dá)的第一步，也是最關(guān)鍵的一步?；虮磉_(dá)的終產(chǎn)物：RNA 蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄過(guò)程涉及兩個(gè)方面RNA合成的酶學(xué)過(guò)程RNA合成的起始信號(hào)和終止信號(hào)，即DNA分子上的特定序列。DNA正鏈：與mRNA序列相同的DNA鏈。 負(fù)鏈：與正鏈互補(bǔ)的DNA鏈。轉(zhuǎn)錄單位的起點(diǎn)核苷酸為+1，起點(diǎn)右邊為下游（轉(zhuǎn)錄區(qū)），轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)左側(cè)為上游，用負(fù)數(shù)表示：-1，-2，-3。第一節(jié) DNA指導(dǎo)的RNA合成（轉(zhuǎn)錄）RNA鏈的轉(zhuǎn)錄，起始于DNA模板的一個(gè)特定位點(diǎn)，并在另一位點(diǎn)終止，此轉(zhuǎn)錄區(qū)域稱為一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位。一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位可以是一個(gè)基因（

3、真核），也可以是多個(gè)基因（原核）?；虻霓D(zhuǎn)錄是有選擇性的，細(xì)胞不同生長(zhǎng)發(fā)育階段和細(xì)胞環(huán)境條件的改變，將轉(zhuǎn)錄不同的基因。轉(zhuǎn)錄的起始由DNA上的啟動(dòng)子區(qū)控制，轉(zhuǎn)錄的終止由DNA上的終止子控制，轉(zhuǎn)錄是通過(guò)DNA指導(dǎo)的RNA聚合酶來(lái)實(shí)現(xiàn)的。一、 RNA聚合酶RNA合成的基本特征底物：NTP（ATP、GTP、CTP、UTP）RNA鏈生長(zhǎng)方向：53不需引物需DNA模板反應(yīng)：1、 E.coli RNA聚合酶（原核）E.coli和其它原核細(xì)胞一樣，只有一種RNA聚合酶，合成各種RNA（mRNA、tRNA、rRNA）。一個(gè)E.coli細(xì)胞中約有7000個(gè)RNA聚合酶分子，在任一時(shí)刻，大部分聚合酶（5000左右）

4、正在參與RNA的合成，具體數(shù)量依生長(zhǎng)條件而定。E.coli RNA聚合酶全酶|（holoenzyme）分子量46萬(wàn)Da，由六個(gè)亞基組成，2 ，另有兩個(gè)Zn2+。無(wú)亞基的酶叫核心酶，核心酶只能使已開(kāi)始合成的RNA鏈延長(zhǎng)，而不具備起始合成活性，加入亞基后，全酶才具有起始合成RNA的能力，因此，亞基稱為起始因子。E.coli RNA聚合酶各亞基的大小與功能：亞基亞基數(shù)分子量（KD）基因功能1160rpoC與模板DNA結(jié)合1150rpoB與核苷酸結(jié)合，起始和催化部位。170rpoD起始識(shí)別因子237rpoA與DNA上啟動(dòng)子結(jié)合19-不詳不同的細(xì)菌，、亞基分子量變化不大，亞基分子量變化較大，44KD92

5、KD。亞基的功能：核心酶在DNA上滑動(dòng)，亞基能增加酶與DNA啟動(dòng)子的結(jié)合常數(shù)，增加停留時(shí)間，使聚合酶迅速找到啟動(dòng)子并與之結(jié)合，亞基本身無(wú)催化活性。不同的因子識(shí)別不同的啟動(dòng)子，從而表達(dá)不同的基因。不同的原核生物，都具有相同的核心酶，但亞基有所差別，這決定了原核基因表達(dá)的選擇性。RNA聚合酶的催化活性：RNA聚合酶以完整的雙鏈DNA為模板，轉(zhuǎn)錄時(shí)DNA的雙鏈結(jié)構(gòu)部分解開(kāi)，轉(zhuǎn)錄后DNA仍然保持雙鏈的結(jié)構(gòu)。P360 圖20-1RNA聚合酶的活性中心核心酶覆蓋60bp的DNA區(qū)域，其中解鏈部分17bp左右，RNA-DNA雜合鏈約12bp。純的RNA聚合酶，在離體條件下可轉(zhuǎn)錄雙鏈DNA，但在體內(nèi)，DNA的

6、兩條鏈中只有一條可用于轉(zhuǎn)錄，這可能是由于RNA聚合酶在分離時(shí)丟失了亞基引起的。解旋和重新螺旋化也是RNA聚合酶的內(nèi)在特性，在酶的前端解螺旋，在后端以相反方向重新螺旋化，活體狀況中，可能還有其它酶活性來(lái)幫助調(diào)整DNA的拓?fù)鋵W(xué)性質(zhì)。37時(shí)，RNA聚合酶的聚合速度可達(dá)40100個(gè)核苷酸/秒2、 真核生物RNA聚合酶真核生物的轉(zhuǎn)錄機(jī)制要復(fù)雜得多，有三種細(xì)胞核內(nèi)的RNA聚合酶：RNA聚合酶I轉(zhuǎn)錄rRNA，RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄mRNA，RNA聚合酶III轉(zhuǎn)錄tRNA和其它小分子RNA。這三種RNA聚合酶分子量都在50萬(wàn)左右，亞基數(shù)分別為6-15。P362 表20-3 真核生物RNA聚合酶的分類、分布及各自

7、的功能動(dòng)物、植物、昆蟲(chóng)等不同來(lái)源的細(xì)胞，RNApol的活性都可被低濃度的-鵝膏蕈堿抑制，而RNApol不受抑制。動(dòng)物RNApol受高濃度的-鵝膏蕈堿抑制，而酵母、昆蟲(chóng)的RNApol不受抑制。除了細(xì)胞核RNA聚合酶外，還分離到線粒體和葉綠體RNA聚合酶，它們的結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，能轉(zhuǎn)錄所有種類的RNA，類似于細(xì)菌RNA聚合酶。3、 噬菌體T3和T7編碼的RNA聚合酶僅為一條分子量11KD的多肽鏈，這些聚合酶只需要識(shí)別噬菌體DNA的少數(shù)啟動(dòng)子，并無(wú)選擇地與其作用，37時(shí)的聚合速度200nt/秒。二、 RNA聚合酶催化的轉(zhuǎn)錄過(guò)程（E.coli）P361 圖20-21、 起始RNA聚合酶結(jié)合到DNA雙鏈的特定部

8、位，局部解開(kāi)雙螺旋，第一個(gè)核苷酸摻入轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，從此開(kāi)始RNA鏈的延伸。在新合成的RNA鏈的5末端，通常為帶有三個(gè)磷酸基團(tuán)的鳥(niǎo)苷或腺苷（pppG或pppA），即合成的第一個(gè)底物是GTP或ATP。起始過(guò)程中，因子起關(guān)鍵作用，它能使聚合酶迅速地與DNA的啟動(dòng)子結(jié)合，亞基與結(jié)合時(shí)，亞基的構(gòu)象有利于核心酶與啟動(dòng)子緊密結(jié)合，。正鏈：與mRNA序列相同的兩、鏈。負(fù)鏈：模板鏈。轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)是+1，上游是-1。2、 延長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄起始后，亞基釋放，離開(kāi)核心酶，使核心酶的亞基構(gòu)象變化，與DNA模板親和力下降，在DNA上移動(dòng)速度加快，使RNA鏈不斷延長(zhǎng)。轉(zhuǎn)錄起始后，亞基便從全酶中解離出來(lái)，然后nusA亞基結(jié)合到核心酶上，

9、由nusA亞基識(shí)別序列序列。3、 終止RNA聚合酶到達(dá)轉(zhuǎn)錄終止點(diǎn)時(shí)，在終止輔助因子的幫助下，聚合反應(yīng)停止，RNA鏈和聚合酶脫離DNA模板鏈，nusA又被亞基所取代。由此形成RNA聚合酶起始復(fù)合物與終止復(fù)合物兩種形式的循環(huán)。三、 啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄因子啟動(dòng)子：RNA聚合酶識(shí)別、結(jié)合并開(kāi)始轉(zhuǎn)錄所必需的一段DNA序列。轉(zhuǎn)錄因子：RNA聚合酶在進(jìn)行轉(zhuǎn)錄時(shí)，常需要一些輔助因子（蛋白質(zhì)）參與作用，此類蛋白質(zhì)統(tǒng)稱為轉(zhuǎn)錄因子。足跡法和DNA測(cè)序法確定啟動(dòng)子的序列結(jié)構(gòu)。P363（一） 原核啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)與功能分析比較上百種啟動(dòng)子序列，發(fā)現(xiàn)不同的啟動(dòng)子都存在保守的共同序列，包括RNA聚合酶識(shí)別位點(diǎn)和結(jié)合位點(diǎn)。（1）、 -1

10、0序列（Pribnow框）在轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)上游大約-10處，有一個(gè)6bp的保守序列TATAAT，稱Pribnow框。此段序列出現(xiàn)在-4到-13bp之間，每個(gè)位點(diǎn)的保守性在45%-100%。頻度： T89 A89 T50 A65 A65 T100據(jù)預(yù)測(cè)，Pribnow框中，一開(kāi)始的TA和第6位最保守的T在結(jié)合RNA聚合酶時(shí)起十分重要的作用。目前認(rèn)為，Pribnow框決定轉(zhuǎn)錄方向。酶在此部位與DNA結(jié)合形成穩(wěn)定的復(fù)合物，Pribnow框中DNA序列在轉(zhuǎn)錄方向上解開(kāi)，形成開(kāi)放型起始結(jié)構(gòu)，它是RNA聚合酶牢固的結(jié)合位點(diǎn)，是啟動(dòng)子的關(guān)鍵部位。RNA聚合酶的結(jié)合，誘導(dǎo)富含AT的Pribnow框的雙鏈解開(kāi)，然后進(jìn)

11、一步擴(kuò)大成17個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的泡狀物，在泡狀物中RNA聚合酶從模板鏈開(kāi)始轉(zhuǎn)錄RNA產(chǎn)物。（2）、 -35序列（Sexfama box）（識(shí)別區(qū)域）只含-10序列的DNA不能轉(zhuǎn)錄，在-10序列上游還有一個(gè)保守序列，其中心約在-35位置，稱為-35序列，此序列為RNA酶的識(shí)別區(qū)域。各堿基出現(xiàn)頻率如下：T85 T83 G81 A61 C69 A52 ，其中TTG十分保守。-35序列的功能：它是原核RNA聚合酶全酶依靠因子的初始識(shí)別位點(diǎn)。因此，-35序列對(duì)RNA聚合酶全酶有很高的親和性。-35序列的核苷酸結(jié)構(gòu)，在很大程度上決定了啟動(dòng)子的強(qiáng)度，RNA聚合酶易識(shí)別強(qiáng)的啟動(dòng)子。-35序列提供RNA聚合酶識(shí)別信

12、號(hào)，-10序列有助于DNA局部雙鏈解開(kāi)，啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)的不對(duì)稱性決定了轉(zhuǎn)錄的方向。P364 圖20-4 原核型啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)（二） 真核啟動(dòng)子真核基因的轉(zhuǎn)錄十分復(fù)雜，對(duì)啟動(dòng)子的分析要比原核基因的困難得多。真核生物有三種RNA聚合酶：RNA聚合酶I、II、III，分別轉(zhuǎn)錄rRNA、mRNA、tRNA和小分子RNA，這三類聚合酶的啟動(dòng)子各有其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。1、 RNA聚合酶的啟動(dòng)子RNA聚合酶的啟動(dòng)子有三個(gè)保守區(qū)：（1）、 TATA框（Hogness框）中心在-25至-30，長(zhǎng)度7bp左右。堿基頻率：T82 A97 A85 A63 （T37 ）A83 A50（T37 ）（全為A-T，少數(shù)含有一個(gè)G-C對(duì)）。

13、此序列功能：使DNA雙鏈解開(kāi)，并決定轉(zhuǎn)錄的起點(diǎn)位置，失去TATA框，轉(zhuǎn)錄將可能在許多位點(diǎn)上開(kāi)始。TATA框的改變或缺失，直接影響DNA與酶的結(jié)合程度，會(huì)使轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)偏移，因此，TATA是絕大多數(shù)真核基因正確表達(dá)所必需的。由于RNA聚合酶分子有相對(duì)固定的空間結(jié)構(gòu)，同此框的結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄反應(yīng)催化位點(diǎn)的距離，決定了起始位點(diǎn)的正確選擇。啟動(dòng)子特定序列和酶的正確結(jié)構(gòu)，這兩者把酶置于一種正確的構(gòu)象中，決定了識(shí)別的正確性和轉(zhuǎn)錄起始的正確性。（2）、 CAAT框中心在-75處，9bp，共有序列GGT（G）CAATCT功能：與RNA聚合酶結(jié)合。（3）、 GC框在CAAT框上游，序列GGGCGG，與某些轉(zhuǎn)錄因子結(jié)

14、合。CAAT和GC框均為上游序列，對(duì)轉(zhuǎn)錄的起始頻率有較大影響。2、 RNApol的啟動(dòng)子RNApol的啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)錄區(qū)內(nèi)部。P365圖20-5 由RNA聚合酶III轉(zhuǎn)錄的三個(gè)基因的啟動(dòng)子四、 終止子和終止因子終止子：提供轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)的一段DNA序列。終止因子：協(xié)助RNA聚合酶識(shí)別終止子的蛋白質(zhì)輔助因子。有些終止子的作用可被特異的因子所阻止，使酶越過(guò)終止子繼續(xù)轉(zhuǎn)錄，稱為通讀，這類引起抗終止作用的蛋白質(zhì)稱為抗終止因子。終止子位于已轉(zhuǎn)錄的序列中，DNA的終止子可被RNA聚合酶本身或其輔助因子識(shí)別。P366圖20-61、 大腸桿菌中的兩類終止子P366圖20-6 所有原核生物的終止子在終止點(diǎn)之前都有一個(gè)

15、回文結(jié)構(gòu)，它轉(zhuǎn)錄出來(lái)的RNA可以形成一個(gè)頸環(huán)式的發(fā)莢結(jié)構(gòu)。（1）、 不依賴于的終止子（簡(jiǎn)單終止子）簡(jiǎn)單終止子除具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)外，在終止點(diǎn)前有一寡聚U序列，回文對(duì)稱區(qū)通常有一段富含GC的序列。寡聚U序列可能提供信號(hào)使RNA聚合酶脫離模板。（2）、 依賴的終止子依賴的終止子，必需在因子存在時(shí)，才發(fā)生終止作用。終止點(diǎn)前無(wú)寡聚U序列，回文對(duì)稱區(qū)不富含GC。因子是55KD的蛋白質(zhì)，可水解三磷酸核苷。2、 抗終止作用通讀往往發(fā)生在強(qiáng)啟動(dòng)子、弱終止子的基因上?？菇K止作用常見(jiàn)于某些噬菌體的時(shí)序控制。早期基因于后基因之間以終止子相隔開(kāi)，通過(guò)抗終止作用可以打開(kāi)后基因的表達(dá)。噬菌體前早期（immediate earl

16、y）基因的產(chǎn)物N蛋白就是一種抗終止因子。它與RNA聚合酶作用使其在左右兩個(gè)終止子處發(fā)生通讀，從而表達(dá)晚早期（delayed early）基因。晚早期基因的產(chǎn)物Q蛋白也是一種抗終止因子，它能使晚早期基因得以表達(dá)。五、 轉(zhuǎn)錄過(guò)程的調(diào)節(jié)控制參閱P367轉(zhuǎn)錄過(guò)程的調(diào)節(jié)控制、P450基因表達(dá)的調(diào)節(jié)基因的表達(dá)是受到嚴(yán)格的調(diào)節(jié)控制的，轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，轉(zhuǎn)錄調(diào)控主要發(fā)生在起始和終止階段。時(shí)序調(diào)控：生長(zhǎng)、發(fā)育、分化、時(shí)間程序。適應(yīng)調(diào)控：細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境改變。可位于基因的上游或下游區(qū)或內(nèi)含子中。操縱子：原核生物基因表達(dá)的協(xié)調(diào)單位，包括結(jié)構(gòu)基因、調(diào)節(jié)基因及由調(diào)節(jié)基因產(chǎn)物所識(shí)別的控制序列（啟動(dòng)子、操縱基因）。增

17、強(qiáng)子：真核生物、病毒的基因組內(nèi)，對(duì)轉(zhuǎn)錄起增強(qiáng)作用的一段DNA序列。它具有長(zhǎng)距離效應(yīng)，與方向無(wú)關(guān)，只作用于同一條DNA鏈上的啟動(dòng)子。轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控取決于調(diào)節(jié)因子（RNA或蛋白質(zhì)）與啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、終止子之間的相互作用。（一） 原核生物的轉(zhuǎn)錄調(diào)控1、 操縱子模型調(diào)節(jié)基因的產(chǎn)物可以是負(fù)調(diào)節(jié)物（如阻遏蛋白），也可以是正調(diào)節(jié)物，它們與操縱基因作用，關(guān)閉或打開(kāi)結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)2、 cAMP能促進(jìn)許多原核生物的基因表達(dá)cAMP可以活化環(huán)腺苷酸受體蛋白（cAMP receptor protein，CRP），CRP作為一種廣譜性的正調(diào)節(jié)物，結(jié)合于被調(diào)控的啟動(dòng)子上，促進(jìn)RNA聚合酶與啟動(dòng)子的結(jié)合，從而促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的進(jìn)行

18、。葡萄糖效應(yīng)：培養(yǎng)基中葡萄糖含量較高時(shí)，細(xì)菌首先利用葡萄糖，阻遏利用其它底物的酶類的合成。原因：葡萄糖的降解物可以抑制腺苷酸環(huán)化酶的活力，并激活磷酸脂酶，因而降低cAMP的水平，使這些酶的基因不能轉(zhuǎn)錄。因此，CRP又稱降解物基因活化蛋白（catabolite gene activator protein,CAP）。受cAMP-CRP調(diào)節(jié)的操縱子（既代謝降解物敏感的操縱子）包括許多負(fù)責(zé)糖類分解代謝的誘導(dǎo)性啟動(dòng)子，如乳糖操縱子，半乳糖操縱子。，阿拉伯糖操縱子等，以及負(fù)責(zé)氨基酸合成代謝的可阻遏的操縱子，如Ile-Val操縱子（iLV）。調(diào)節(jié)子：受一種一種調(diào)節(jié)蛋白所控制的幾個(gè)操縱子系統(tǒng)，這些操縱子通常

19、都屬于同一個(gè)代謝途徑或與同一種功能有關(guān)。綜合性調(diào)節(jié)子：一種調(diào)節(jié)蛋白控制幾個(gè)不同代謝途徑的操縱子，如cAMP-CRP對(duì)各種分解代謝和合成代謝的調(diào)控系統(tǒng)。3、 衰減子的調(diào)控作用（二） 真核生物的轉(zhuǎn)錄調(diào)控第二節(jié) RNA轉(zhuǎn)錄后的加工RNA聚合酶合成的原初轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，要經(jīng)過(guò)剪切、修飾、拼接等過(guò)程，才能轉(zhuǎn)變成成熟的RNA分子，此過(guò)程稱RNA轉(zhuǎn)錄后的加工。（1）、 原核、真核的tRNA、rRNA（穩(wěn)定的RNA）細(xì)胞內(nèi)的tRNA、rRNA相對(duì)穩(wěn)定，半衰期一般為幾個(gè)小時(shí)。所有的tRNA、rRNA都不是原初轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，都要經(jīng)過(guò)一系列的加工才能成為有活性的分子。a. 原初轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的5是三磷酸（pppG、pppA），而成

20、熟的tRNA、rRNA ，5是單磷酸。b. 成熟 tRNA、rRNA分子都比原初轉(zhuǎn)錄物小。c. 所有的tRNA分子，都有原初轉(zhuǎn)錄物所沒(méi)有的稀有堿基（A、G、C、U以外的堿基）。（2）、 真核的mRNA單順?lè)醋?，多?nèi)含子。壽命比原核mRNA的長(zhǎng)。內(nèi)含子、內(nèi)元（intron）：在原初轉(zhuǎn)錄物中，通過(guò)RNA拼接反應(yīng)而被去除的RNA序列，或基因中與這種序列對(duì)應(yīng)的DNA序列。外顯子、外元（exon）：原初轉(zhuǎn)錄物通過(guò)RNA拼接反應(yīng)后，而保留于成熟RNA中的序列，或基因中與成熟RNA對(duì)應(yīng)的DNA序列。（3）、 原核mRNA多順?lè)醋?，半衰期只有幾分鐘。這是原核生物重要的調(diào)控機(jī)制，如果一種酶或蛋白質(zhì)不再需要時(shí)，只

21、需簡(jiǎn)單地關(guān)閉其mRNA的合成就行了。一、 原核生物RNA的加工在原核生物中，rRNA基因與某些tRNA基因組成混合操縱子，可提高效率、節(jié)省空間（增加有效信息）。其它的tRNA基因也成簇存在，并與編碼蛋白質(zhì)的基因組成操縱子，它們?cè)谛问蕉囗樂(lè)醋愚D(zhuǎn)錄物后，斷裂成為rRNA和tRNA的前體，然后進(jìn)一步加工成熟。1、 原核rRNA前體的加工（E.coli）P 370圖20-7 E.coli rRNA前體的加工E.coli共有三種rRNA5S rRNA 120b16S rRNA 1541b23S rRNA 2904brRNA原初轉(zhuǎn)錄物含6300個(gè)核苷酸，約30S。大腸桿菌有7個(gè)rRNA的轉(zhuǎn)錄單位（操縱子）

22、，它們分散在基因組的各處。每個(gè)轉(zhuǎn)錄單位由16SrRNA、23SrRNA、5SrRNSA以及一個(gè)或幾個(gè)tRNA基因所組成。每個(gè)操縱子中tRNA基因的種類、數(shù)量和位置都各不相同。RNAase是一種rRNA、多順?lè)醋觤RNA加工的內(nèi)切酶，識(shí)別特定的RNA雙螺旋區(qū)。RNAase E也可識(shí)別P5（5SrRNA前體）兩端形成的雙螺旋區(qū)。2、 原核tRNA前體的加工 P371圖20-8E.coli染色體基因組有60個(gè)tRNA基因，即某種a.a.的tRNA基因不止一個(gè)拷貝。tRNA基因大多成簇存在，或與rRNA基因，或與蛋白質(zhì)基因組成混合轉(zhuǎn)錄單位。tRNA前體加工步驟a. 核酸內(nèi)切酶(RNAaseP、RNAa

23、seF)在tRNA兩端切斷。b. 核酸外切酶(RNAaseD)從3端逐個(gè)切去附加序列。c. 在tRNA3端加上-CCA-OH。tRNA核苷酰轉(zhuǎn)移酶d. 核苷的修飾（修飾酶）：甲基化酶 / S-腺苷蛋氨酸（SAM），假尿苷合成酶。（1）、 RNAase P能識(shí)別空間結(jié)構(gòu)，很干凈地切除tRNA前體的5端。含有蛋白質(zhì)和RNA（M1 RNA）兩部分。M1 RNA含375nt，在某些條件下，（提高M(jìn)g2+、或加入胺類），RNAase P的RNA能單獨(dú)地切斷tRNA前體的5端序列。（2）、 RNAaseF不干凈地切除tRNA前體的3端序列，需要RNAase D進(jìn)一步修剪。3、 原核mRNA前體的加工由單順

24、反子構(gòu)成mRNA，一般不需加工，一經(jīng)轉(zhuǎn)錄，即可直接進(jìn)行翻譯。有些多順?lè)醋訕?gòu)成的mRNA，須由核酸內(nèi)切酶切成較小的mRNA，然后再進(jìn)行翻譯。例：核糖體大亞基蛋白L10、L7、L12與RNA聚合酶、亞基的基因組成混合操縱子。它在轉(zhuǎn)錄出多順?lè)醋觤RNA后，由RNAase將核糖體蛋白質(zhì)基因與聚合酶亞基基因的mRNA切開(kāi)，然后各自翻譯。該加工過(guò)程的意義：可對(duì)mRNA的翻譯進(jìn)行調(diào)節(jié)，核糖體蛋白質(zhì)的合成必須適應(yīng)于rRNA的合成水平，而細(xì)胞內(nèi)RNA聚合酶的合成水平則要低得多。兩者切開(kāi)，有利于各自的翻譯調(diào)控。二、 真核生物RNA的加工真核rRNA、tRNA前體的加工過(guò)程與原核的很相似，但mRNA的加工過(guò)程與原核

25、的有很大不同。1、 真核rRNA前體的加工真核生物核糖體的小亞基含：16-18S rRNA，大亞基含：26-28S r RNA、5S rRNA、5.8S rRNA（特有）。真核rRNA基因拷貝數(shù)較多，幾十至幾千個(gè)之間。真核rRNA基因也成簇排列在一起，18S、5.8S、28S rRNA基因組成一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位，彼此被間隔區(qū)分開(kāi)，由RNA聚合酶I轉(zhuǎn)錄生成一個(gè)長(zhǎng)的rRNA前體。5SrRNA基因也成簇排列，間隔區(qū)不被轉(zhuǎn)錄，由RNA聚合酶III轉(zhuǎn)錄后經(jīng)適當(dāng)加工。哺乳動(dòng)物：45SrRNA前體，含18S、5.8S、28S rRNA果蠅：38SrRNA前體，含18S、5.8S、28S rRNA酵母：37SrRN

26、A 前體，17S、5.8S、26S rRNArRNA在成熟過(guò)程中可被甲基化，位點(diǎn)主要在核糖2-OH上。真核rRNA甲基化程度比原核的高，約1-2%的核苷酸被甲基化。真核生物的核仁是rRNA合成、加工和裝配成核糖體的場(chǎng)所，大、小亞基分別組裝后，通過(guò)核孔轉(zhuǎn)移到胞質(zhì)中參與核糖體循環(huán)。2、 真核tRNA前體的加工真核tRNA基因的數(shù)目比原核tRNA的要多的多。例如，E.coli有60個(gè)tRNA基因，啤酒酵母250個(gè)，果蠅850個(gè)，爪蟾1150個(gè)，人1300個(gè)。真核tRNA基因也成簇排列，被間隔區(qū)分開(kāi)，tRNA基因由RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄。真核tRNA前體的剪切、修飾過(guò)程與原核相似。3、 真核生物mRNA前體

27、的加工mRNA原初轉(zhuǎn)錄物是分子量很大的前體，在核內(nèi)加工過(guò)程中形成分子大小不等的中間產(chǎn)物，它們被稱為核內(nèi)不均一RNA（hn RNA）。其中，約有25%可轉(zhuǎn)變成成熟的mRNA。hnRNA半壽期很短，比細(xì)胞質(zhì)中的mRNA更不穩(wěn)定，一般在幾分鐘至1小時(shí)。而細(xì)胞質(zhì)mRNA的半壽期為1-10小時(shí)，神經(jīng)細(xì)胞mRNA最長(zhǎng)可達(dá)數(shù)年。hnRNA轉(zhuǎn)變成mRNA的加工過(guò)程主要包括：a. 5末端形成帽子結(jié)構(gòu)b. 3末端切斷并加上polyAc. 剪接除去內(nèi)含子對(duì)應(yīng)的序列d. 甲基化（1）、 5末端加帽反應(yīng)步驟P 374RNA三磷酸酶，mRNA鳥(niǎo)苷酰轉(zhuǎn)移酶，mRNA（鳥(niǎo)嘌呤-7）甲基轉(zhuǎn)移酶，mRNA（核苷-2）甲基轉(zhuǎn)移酶。

28、由于甲基化的程度不同，有三種類型的帽子：CAP O型，CAP I型，CAP II型。5帽子也出現(xiàn)于hnRNA，說(shuō)明加帽過(guò)程可能在轉(zhuǎn)錄的早期階段或轉(zhuǎn)錄終止前就已完成。5帽子的功能a. 在翻譯過(guò)程中起信號(hào)識(shí)別作用，協(xié)助核糖體與mRNA結(jié)合，使翻譯從AUG開(kāi)始。b. 保護(hù)mRNA，避免5端受核酸外切酶的降解。（2）、 3端加polyA hnRNA鏈由RNAase切斷，由多聚腺苷酸聚合酶催化，加上polyA，ATP為供體。加尾信號(hào)：AATAAA、YGTGTGYY（Y為嘧啶）。高等真核生物和病毒的mRNA在靠近3端區(qū)都有一段非常保守的序列AAUAAA，這一序列離多聚腺苷酸加入位點(diǎn)的距離在11-30nt范

29、圍之內(nèi)。核內(nèi)hnRNA的3端也有多聚腺苷酸，表明加尾過(guò)程早在核內(nèi)已經(jīng)完成。hnRNA中的poly（A）比mRNA略長(zhǎng)，平均150-200nt。polyA的功能a. 防止核酸外切酶對(duì)mRNA信息序列的降解，起緩沖作用。b. 與mRNA從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)有關(guān)。3脫氧腺苷（既冬蟲(chóng)夏草素）是多聚腺苷酸化的特異抑制劑，但它不抑制hnRNA的轉(zhuǎn)錄。（3）、 mRNA甲基化某些真核mRNA內(nèi)部有甲基化的位點(diǎn)，主要是在N6-甲基腺嘌呤（m6A）。三、 RNA的拼接和催化作用（內(nèi)含子的切除）多數(shù)真核基因是斷裂基因，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物通過(guò)拼接，去除內(nèi)含子，使編碼區(qū)（外顯子）成為連續(xù)序列。有些內(nèi)含子可以催化自身的拼接（s

30、elf-splicing）,有些內(nèi)含子需要在有關(guān)酶的作用下才能拼接。1、 tRNA前體的拼接酵母tRNA約有400個(gè)基因，有內(nèi)含子的基因約占1/10，內(nèi)含子長(zhǎng)度14-46bp，沒(méi)有保守性。切除內(nèi)含子的酶識(shí)別的是tRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，而不是什么保守序列。拼接過(guò)程：第一步切除內(nèi)含子，第二步RNA連接酶將兩個(gè)tRNA半分子連接。P375圖20-9酵母tRNAPhe及其前體的結(jié)構(gòu)P376圖20-10酵母和植物tRNA前體的拼接過(guò)程2、 四膜蟲(chóng)rRNA前體的自我拼接四膜蟲(chóng)35S rRNA前體，經(jīng)加工可以生成5.8S 、17S和26SrRNA。某些品系的四膜蟲(chóng)在其26SrRNA基因中有一個(gè)內(nèi)含子，35S r

31、RNA前體需要拼接除去內(nèi)含子。該拼接過(guò)程只需一價(jià)和二價(jià)陽(yáng)離子和鳥(niǎo)苷酸(提供3-OH)，無(wú)需能量和酶。P377圖20-11四膜蟲(chóng)rRNA的拼接3、 mRNA前體的拼接真核生物所有編碼蛋白質(zhì)的核結(jié)構(gòu)基因，其內(nèi)含子的左端均為GT，右端均為AG。此規(guī)律稱GT-AG規(guī)律（對(duì)于mRNA就是GU-AG，此規(guī)律不適合于線粒體、葉綠體的內(nèi)含子，也不適合于tRNA和某些rRNA的核結(jié)構(gòu)基因）外顯子內(nèi)含子A64G73 G100T100A62A68G84T63 6Py74-84NC65A100G100 N外顯子酵母核基因的內(nèi)含子在靠近3端還有一個(gè)保守序列，與5端序列互補(bǔ)，稱為T(mén)ACTAAC box，也與拼接有關(guān)。真核

32、細(xì)胞內(nèi)存在許多種類的小分子RNA，大小在100-300nt，有些由聚合酶III轉(zhuǎn)錄，有些由聚合酶II轉(zhuǎn)錄。核內(nèi)小RNA（snRNA）主要存在于核內(nèi)，細(xì)胞質(zhì)小RNA（scRNA）主要存在于細(xì)胞質(zhì)。重要的snRNA有U系列snRNA，因其尿嘧啶含量高而得名。U系列snRNA通常都與多肽或蛋白質(zhì)結(jié)合形成核糖核蛋白顆粒（RNP）。U-snRNA參與hnRNA的拼接過(guò)程。U3-snRNA與rRNA前體的加工有關(guān)，U1、U2、U4、U5、U6可能都與hnRNA的加工有關(guān)。P378 圖20-12 U1-snRNA的5端序列與hnRNA內(nèi)含子拼接處的序列互補(bǔ)P379圖20-13 hnRNA的拼接過(guò)程真核生物編

33、碼蛋白質(zhì)的核基因的內(nèi)含子屬于II類內(nèi)含子（反式剪接）四、 RNA的催化功能 P3771、 I類內(nèi)含子的自我剪接（順式剪接）I類內(nèi)含子包括四膜蟲(chóng)rRNA的內(nèi)含子，幾種酵母線粒體的內(nèi)含子，噬菌體T4胸苷酸合成酶的內(nèi)含子等。這些內(nèi)含子有較大的同源性，可自我拼接。1981，Cech（美國(guó)），四膜蟲(chóng)rRNA前體（約6400nt）能自動(dòng)切除413個(gè)nt的內(nèi)含子，然后加工生成5.8S、17S、26S rRNA。1984，Apirion（美國(guó)），噬菌體T4的RNA可以在沒(méi)有蛋白質(zhì)參與下自我斷裂，由215nt前體鏈切下76nt 。2、 獨(dú)具催化活性的小分子RNA1984，Altman，Pace（美國(guó)），細(xì)菌加工

34、tRNA前體的酶RNAase P中的M1RNA（375nt）在高濃度的Mg2+或胺類存在時(shí)能單獨(dú)切下tRNA前體的5端。1，4-葡聚糖分支酶中的RNA（31nt）也單獨(dú)具有分支酶活力。真核的U-snRNA催化rRNA前體、hnRNA前體的加工。第三節(jié) RNA的復(fù)制有些RNA病毒，進(jìn)入寄主細(xì)胞后，借助復(fù)制酶而進(jìn)行RNA病毒的復(fù)制。從感染RNA病毒的細(xì)胞中可以分離出RNA復(fù)制酶，這些RNA復(fù)制酶的模板特異性很強(qiáng)，只識(shí)別病毒自身的RNA，它以病毒RNA為模板，合成與模板性質(zhì)相同的RNA。一、 噬菌體QRNA的復(fù)制噬菌體Q：直徑20nm，正十二面體，含30%RNA，其余為蛋白質(zhì)，單鏈RNA，4500個(gè)

35、核苷酸，編碼3-4個(gè)蛋白質(zhì)。結(jié)構(gòu)：5端成熟蛋白（A或A2蛋白）外殼蛋白（或A1蛋白）復(fù)制酶亞基3端Q復(fù)制酶：四個(gè)亞基，只有是自己編碼，其余三個(gè)亞基來(lái)自寄主細(xì)胞。P380 表20-4 Q復(fù)制酶亞基的性質(zhì)和功能進(jìn)入E.coli細(xì)胞后，其RNA即為mRNA，可以直接合成與病毒繁殖有關(guān)的蛋白質(zhì)（復(fù)制酶亞基）。QRNA的復(fù)制過(guò)程：P381 圖20-14噬菌體QRNA的復(fù)制過(guò)程：在Q特異的復(fù)制酶合成并裝備好后就開(kāi)始病毒RNA的復(fù)制。QRNA翻譯和復(fù)制的自我調(diào)節(jié)：P381圖20-15QRNA的高級(jí)結(jié)構(gòu)（尤其是雙螺旋區(qū)的結(jié)構(gòu)）參與翻譯的調(diào)節(jié)控制：（1） 只有剛復(fù)制的QRNA，成熟蛋白基因才能翻譯。（2） 核糖

36、體能直接啟動(dòng)外殼蛋白基因的翻譯（3） 復(fù)制酶亞基基因只有在外殼蛋白合成時(shí)雙鏈打開(kāi)才能進(jìn)行翻譯。QRNA的翻譯、復(fù)制受寄主細(xì)胞調(diào)節(jié)，以正鏈RNA為模板復(fù)制負(fù)鏈RNA時(shí)，另需寄主細(xì)胞的HF和HF因子。而以負(fù)鏈RNA 為模板復(fù)制正鏈RNA時(shí)，不需這兩個(gè)因子，感染后期大量合成的是正鏈RNA。二、 病毒RNA復(fù)制的主要方式1、 正鏈RNA病毒（mRNA）：噬菌體Q、灰質(zhì)炎病毒等。進(jìn)入寄主細(xì)胞后，利用寄主的翻譯系統(tǒng)，首先合成復(fù)制酶及有關(guān)的蛋白質(zhì)，然后進(jìn)行病毒RNA的復(fù)制，最后由病毒RNA和蛋白質(zhì)裝配成病毒顆粒。2、 負(fù)鏈RNA病毒（帶有復(fù)制酶）：狂犬病毒等此類病毒帶有復(fù)制酶，侵入后，復(fù)制酶首先合成出正鏈R

37、NA（mRNA），再以正鏈RNA為模板，合成負(fù)鏈RNA及蛋白質(zhì)，然后裝配。3、 雙鏈RNA病毒（帶有復(fù)制酶）：呼腸孤病毒等以雙鏈RNA為模板，在復(fù)制酶作用下先轉(zhuǎn)錄正鏈RNA（mRNA），從而翻譯出蛋白質(zhì)，然后合成負(fù)鏈RNA，形成雙鏈RNA，再包裝。4、 反轉(zhuǎn)錄病毒（含反轉(zhuǎn)錄酶）：白血病病毒、肉瘤病毒等致癌RNA病毒正鏈RNA病毒，它們的復(fù)制需要經(jīng)過(guò)DNA前病毒階段。不同RNA病毒合成mRNA的途徑可以分4類： P382 圖20-16第四節(jié) RNA生物合成的抑制劑某些核酸代謝的拮抗物和抗生素可抑制核苷酸或核酸的合成，因而可以用于抗病毒或抗腫瘤藥物，也可以用于核酸的研究一、 嘌呤和嘧啶類似物抑制核

38、苷酸的合成，還能摻入核酸分子中去，形成異常DNA、RNA，影響核酸功能。主要有：6-巰基嘌呤、硫鳥(niǎo)嘌呤、2.6二氨基嘌呤、8-氮鳥(niǎo)嘌呤、5-氟尿嘧啶 、6-氮尿嘧啶堿基類似物進(jìn)入體內(nèi)后需轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的核苷酸，才表現(xiàn)出抑制作用。二、 DNA模板功能的抑制劑此類化合物能與DNA結(jié)合，使DNA失去模板功能，從而抑制其復(fù)制與轉(zhuǎn)錄。1、 烷化劑氮芥（二（氯乙基）胺的衍生物）、磺酸酯、氮丙啶、乙撐亞胺類。它們帶有活性烷基，使DNA烷基化。烷化位點(diǎn)：鳥(niǎo)嘌呤N7 ，腺嘌呤N1、N3、N7，胞嘧啶N1烷基化后，堿基易被水解下來(lái)，留下的空隙可干擾DNA復(fù)制或引起錯(cuò)誤堿基摻入。帶有雙功能基團(tuán)的烷化劑，可同時(shí)與DNA兩條鏈結(jié)合，使雙鏈DNA交聯(lián)，從而失去模板功能。環(huán)磷酰胺：腫瘤細(xì)胞中磷酰胺酶活化，生成活性氮芥。苯丁酸氮芥：癌細(xì)胞酵解作用強(qiáng)，乳酸多，pH低，苯丁酸氮芥易進(jìn)入。2、 放線菌素D（對(duì)真核、原核細(xì)胞都起作用）有抗菌和抗癌作用。它可與DNA形成非共價(jià)復(fù)合物，使其多肽部分在DNA的“淺溝”上如同阻遏蛋白一樣，抑制DNA的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。此類機(jī)理的放線菌素還有色霉素A3、橄欖霉素、光神霉素。3、 嵌入染料扁平芳香族染料，可插入雙鏈DNA相鄰堿基對(duì)之間。溴化乙錠插入后，使DNA在復(fù)制時(shí)缺失或增添一個(gè)核苷酸，從而導(dǎo)致移碼突變，并能抑制RNA鏈的起始及質(zhì)粒的復(fù)制。此外還有原黃素、吖啶黃