蛋清蛋白酶解物的抗氧化_抗凝血酶活性及生化特性的研究_圖文

1、蛋清蛋白酶解物的抗氧化、抗凝血酶活性及生化特性的研究楊萬根,張煜,王璋,許時(shí)嬰(江南大學(xué)食品學(xué)院,江蘇無錫214122摘要:研究了蛋清蛋白酶解物可能具有的抗氧化和抗凝血酶活性。水解用酶為Alcalase2.4L 堿性蛋白酶和Pro-teaseN 蛋白酶;測定了4個(gè)水解度的酶解物(采用pH-stat 法控制反應(yīng)終點(diǎn)而得到的抗氧化和抗凝血酶活性,分析了活性最高的酶解物的氨基酸組成和相對分子量分布。結(jié)果表明,ProteaseN 蛋白酶的酶解物活性要高于Alcalase 酶解物,在水解度為15%時(shí)抗凝血酶活性最高;兩種來源的、水解度為15%的酶解物的7種必需氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別達(dá)到了48.11%與45.

2、80%,遠(yuǎn)高于天然蛋清的7種必需氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)35.65%,說明兩種酶解物具有很高的營養(yǎng)價(jià)值。相對分子量分布顯示兩種酶解物(水解度為15%的多肽組成相似,因此活性的差異可能是因水解酶種類不同而導(dǎo)致的產(chǎn)物多肽的氨基酸序列不同的緣故。關(guān)鍵詞:蛋清;酶解物;活性肽;抗氧化;抗凝血酶StudyonAntioxidantandAntithrombinAcitivitiesofEggWhiteProteinHydrolysatesandTheirBiochemicalPropertiesYANGWan-gen,ZHANGYu,WANGZhang,XUShi-ying(SchoolofFoodScience

3、andTechnology,JiangnanUniversity,Wuxi214122,ChinaAbstract :Theantioxidantandantithrombinpropertiesofeggwhiteproteinhydrolysateswerestudiedinthisexperiment.Four hydrolysateswithdifferentdegreesofhydrolysis(DHwereobtainedusingAlcalase2.4LandProteaseNbypH-statmethod.Theantioxidantandantithrombinpropert

4、iesofhydrolysatesweredetermined.Also,theaminoacidcompositionandthemolecular weightdistributionofhydrolysateswiththehighestactivitieswereanalyzed.TheresultsshowedthattheactivitiesofProtease NhydrolysatesarehigherthanthoseofAlcalasehydrolysates,withthehydrolysate(DH15%havingthehighestantithrombin acti

5、vity.Theaminoacidsanalysisresultsshowedthatthecontentsofsevenessentialaminoacidsintwokindsofhydrolysates withDH15%are48.11%and45.80%,respectively,muchhigherthanthecontent35.65%ofnativeeggwhiteproteins.Molecular weightdistributionanalysisresultsshowedthatthetwohydrolysateswithDH15%havesimilarpeptides

6、compositions.The differenceonactivitiesisduetoenzymespeciesusedinthehydrolysisforproducingpeptideswithdifferentaminoacidsequences.Keywords :eggwhite ;hydrolysates ;biologicalpeptides ;antioxidant ;antithrombin中圖分類號:TS936.16文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A文章編號:1002-6630(200806-0202-06收稿日期:2007-07-06自由基會(huì)引起機(jī)體損傷變性,是機(jī)體的衰老、癌變、肺氣腫

7、、糖尿病等一系列自由基疾病的病源。機(jī)體中存在著一些抗氧化物質(zhì),它們具有預(yù)防這些疾病發(fā)生的作用1。在自由基疾病病人的營養(yǎng)中,補(bǔ)充一些抗氧化物質(zhì)也能起到控制病情的作用?；瘜W(xué)抗氧化劑因?yàn)槎?、副作用正逐步受到限?因此低價(jià)、高效、低毒的天然食品抗氧化劑的開發(fā)成為研究熱點(diǎn)?；钚噪木哂卸喾N生理活性,其中抗氧化肽能有效地清除體內(nèi)過剩的活性氧自由基,保護(hù)細(xì)胞和線粒體的正常結(jié)構(gòu)和功能,防止脂質(zhì)過氧化的發(fā)生,在預(yù)防和治療自由基誘發(fā)的疾病和抗衰老方面有廣泛的應(yīng)用前景。凝血酶是心血管疾病的重要作用因子,抗凝血酶肽在心血管疾病預(yù)防和治療中有重要作用2。我國蛋品資源豐富,蛋清的利用有待開發(fā)3。蛋清蛋白酶解產(chǎn)物是蛋清蛋白經(jīng)

8、蛋白酶水解后生成的多肽和氨基酸的混合物,多肽的生理活性取決于多肽的相對分子質(zhì)量大小和氨基酸序列,而多肽的相對分子質(zhì)量大小和氨基酸序列又與蛋白質(zhì)水解所用的蛋白酶種類和控制的水解度大小有關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)選用Alcalase2.4L堿性蛋白酶和ProteaseN蛋白酶水解蛋清蛋白,采用pH-stat法控制反應(yīng)終點(diǎn)得到不同水解度的酶解物,分別考察這些酶解物的抗氧化和抗凝血酶活性,并分析酶解物的生化性質(zhì),為開拓蛋清利用新領(lǐng)域提供依據(jù)。1材料與方法1.1材料、試劑與儀器凍干蛋清粉。ProteaseN蛋白酶Amano酶制劑公司;Alcalase 2.4L堿性蛋白酶Novo酶制劑公司;凝血酶、纖維蛋白原、二苯基苦

9、基苯肼(DPPH,分析純Sigma公司;鄰苯三酚(分析純、鄰二氮菲(分析純中國醫(yī)藥(集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司;三羥甲基氨基甲烷(生化純國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;二硫蘇糖醇(D T T,生化純 M e r c k公司。722型分光光度計(jì)上海精密科學(xué)儀器有限公司; RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上海亞榮生化儀器廠;Plus384酶標(biāo)儀美國MolecularDevices公司;Agilent1100液相色譜儀美國安捷倫公司;4K15冷凍離心機(jī)美國Sigma公司;77585-306L落地式凍干機(jī)美國Labconco公司。1.2方法在磁力攪拌器攪拌下,配3L蛋白質(zhì)濃度為4%(W/ W的蛋清粉溶液,用1N的NaOH或H

10、Cl調(diào)pH至10.0,迅速升溫至85后保溫變性30m i n。冷卻至反應(yīng)溫度后,用1N的H C l調(diào)節(jié)至反應(yīng)p H值。酶的反應(yīng)p H和溫度分別是:ProteaseN蛋白酶:pH7.0,55;Alcalase 蛋白酶:p H8.0,60。按3%(W/W,酶/底物蛋白質(zhì)(ProteaseN或0.1ml/100ml溶液(Alcalase2.4L的加酶量開始反應(yīng)。根據(jù)pH-stat法,在反應(yīng)過程中加入1N 的標(biāo)準(zhǔn)N a O H維持反應(yīng)液的p H不變,通過調(diào)節(jié)加堿量控制反應(yīng)的水解度。到達(dá)預(yù)定的水解度后,在沸水浴中保持15min,冷卻。100000×g離心,上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮,冷凍干燥得到酶解物

11、。根據(jù)pH-stat方法4,如式(1計(jì)算DH。DH(%=B×N b×1/×1/MP×1/h tot×100(1式中,B為耗堿量(ml;N b為堿的摩爾濃度(mol/ L;為-氨基的平均離解度;MP為蛋白質(zhì)質(zhì)量(g;生產(chǎn)過程中堿的加入使酶解物中鹽類物質(zhì)增加,這些鹽類會(huì)影響到生理活性測定實(shí)驗(yàn)結(jié)果,因此需要脫鹽5。具體步驟如下:用無水乙醇預(yù)處理DA201-C大孔吸附樹脂,洗至無酒精后裝柱,上樣,用紫外檢測器在220n m波長下檢測,靈敏度0.5,當(dāng)流出液的O D值超過5時(shí),停止上樣,改用去離子水脫鹽,直到洗脫液的電導(dǎo)率與去離子水一致。換用75%酒精洗

12、脫樹脂至OD值5以下,將洗脫液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮,然后冷凍干燥,得到脫鹽水解產(chǎn)物。采用Lowery法6。將酶解物溶解在6mol/L鹽酸中,110水解24h,蒸干鹽酸,定容得水解液。采用Agilent1100高效液相分析儀分析水解液中氨基酸組成。高效液相色譜儀條件:色譜柱為C18柱(4.0×125mm;柱溫為40;流速為1.0ml/ min;檢測波長為338、262n m(蛋白質(zhì);流動(dòng)相A為20mmol醋酸鈉液,B為20mmol醋酸鈉液-甲醇-乙腈(1: 2:2,V/V/V。酶解物溶液經(jīng)0.45m微孔過濾膜過濾后上TSKgel 2000色譜柱,以細(xì)胞色素C(M W12500、抑肽酶(M W

13、6500、桿菌酶(MW1450、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸(MW451、乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸(MW189為標(biāo)準(zhǔn)品,測定酶解物的相對分子量分布。高效液相色譜儀條件:Waters600(配2487紫外檢測器和M32工作站;色譜柱為TSKgel2000SWXL(300×7.8mm;流動(dòng)相為乙腈-水-三氟乙酸(45:55:0.1,V/V/V;檢測波長為220nm;流速為0.5ml/min;柱溫為30。(1不同DH的蛋清酶解物對DPPH自由基的清除作用7準(zhǔn)確稱取10m gD P P H用無水乙醇溶解并定容于250ml容量瓶中,則DPPH濃度為0.1mmol/L,避光保存。將2ml5mg/

14、ml樣品及2mlDPPH溶液加入同一試管中,搖勻,放置30m i n后用溶劑作參比測定其吸光度A t,同時(shí)測定DPPH溶液與2ml溶劑混合后的吸光度A c,以及2ml5mg/ml樣品與2ml溶劑混合后的吸光度A b。按照式(2計(jì)算清除率,清除率越大抗氧化能力越強(qiáng)。以抗壞血酸(VC作陽性對照物。A t-A bDPPH自由基清除率(%=(1-×100(2A c(2不同DH 的蛋清酶解物對羥自由基的清除作用8A 樣品-A 損傷羥自由基清除率(%=×100(3A 未損傷-A 損傷(3不同DH 的蛋清酶解物對超氧自由基的清除作用9按表1測定各個(gè)吸光度,樣品濃度25mg/ml。反應(yīng)在2

15、5恒溫水浴中進(jìn)行,加入鄰苯三酚引發(fā)反應(yīng),準(zhǔn)確反應(yīng)10min,加入30l100mmol/L 的DTT 終止反應(yīng),記錄1h 內(nèi)325nm 處的吸光度(A,以A 2作對照測定A 1,以A 4作對照測定A 3。以抗壞血酸(VC作陽性對照物。按式(4計(jì)算各樣品清除率。A 3-A 4超氧自由基清除率(%=(1-×100(4A 1-A 2酶標(biāo)儀的測定溫度設(shè)定為37,測定波長為405nm,測定時(shí)間10min,每隔30s 讀一次數(shù)。反應(yīng)底物為0.1%的pH7.4的纖維蛋白原溶液。用含0.12mmol NaCl的0.05mol/LTris-HCl(pH7.4緩沖液溶解樣品、纖維蛋白原和凝血酶。往酶標(biāo)板的

16、小井中依次加入40l 90mg/ml 樣品和140l0.1%纖維蛋白原溶液,振蕩混勻,然后加入10l12U/ml 的標(biāo)準(zhǔn)凝血酶溶液,振蕩混勻,開始讀數(shù)。選取動(dòng)力學(xué)曲線中前后差值恒定的點(diǎn)為反應(yīng)終點(diǎn),采用式(5和(6計(jì)算酶解物對凝血酶的抑制率和抑制活性。A e -A iY=×100%(5A e -A o組號pH8.2050mmol/L 1mmol/LEDTA 去離子水(ml樣品(ml0.2mmol/L鄰苯三酚Tris-HCl緩沖液(ml水溶液(ml(用10mmol/LHCl 溶液配制,ml1.01.00.41.0表1超氧自由基的測定方法Table 1 Measurement method

17、 of superoxide radical-scavenging activityC eYV ei =(6V i C i數(shù)據(jù)處理采用SPSS13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析,用SNK 分析水解度間差異的顯著性,顯著性為p <0.05%。2結(jié)果與分析對D P P H 自由基的清除能力圖1酶解物對DPPH 自由基的清除能力Fig.1 Scavenging effect of hydrolysates on DPPH free radical504540355101520Alcalase酶解物ProteaseN酶解物D P P H 自由基清除率(%水解度(%不同水解度的酶解物對DPPH 自由基

18、的清除作用見圖1。從圖1中可以看出,所有酶解物都具有清除DPPH 自由基的活性,但水解度相同時(shí),ProteaseN 酶解物比Alcalase 酶解物具有更高的活性。ProteaseN 酶解物的活性隨D H 增加而增加,在D H 為20%時(shí)達(dá)到最高為48.27%±0.37%,超過陽性對照物VC 的47.59%±0.39%。Alcalase 酶解物的活性在DH 為10%時(shí)達(dá)到最大,為36.16%±0.75%。不同水解度的ProteaseN 酶解物它對羥自由基的清除能力對超氧自由基的清除能力不同水解度的酶解物對超氧自由基的清除作用見圖3。從圖3中看出,酶解物具有較高的清

19、除超氧自由基活性,兩種酶解物在D H 為10%以后活性增加緩慢,甚至P r o t e a s e N 酶解物的活性在D H 為15%后下降。Alcalase和ProteaseN酶解物的最大活性點(diǎn)分別是DH為20%時(shí)的79.66%±1.12%和DH 為15%時(shí)的82.39%±0.88%,而陽性對照值是63.35%±0.76%。ProteaseN 的不同水解度的酶解物的超氧自由基清除能力存在顯著差異,而Alcalase 酶解物在DH 為15%和DH 為20%之間無顯著差異,其他水解度的酶解物之間存在顯著差異。2.2酶解物的抗凝血酶活性酶解物的抗凝血酶活性見圖4。從圖

20、4看出,Alcalase 酶解物的抗凝血酶活性隨DH 增加,DH 為20%時(shí),Alcalase酶解物的活性最大點(diǎn)為11.04±0.21ATU/g pro。ProteaseN 酶解物的活性從DH 為5%開始增加,D H 為15%時(shí)達(dá)到最大,在D H 為20%時(shí)又減小,最大時(shí)的抗凝血酶活性為19.885±0.48ATU/gpro。不同水解度酶解物之間活性均差異顯著。圖3酶解物對超氧自由基的清除能力Fig.3 Scavenging effect of hydrolysates on superoxide radical80706050405101520Alcalase酶解物Pro

21、teaseN酶解物超氧自由基清除率(%水解度(%圖4不同DH 酶解物的抗凝血酶活性Fig.4 Antithrombin activities of hydrolysates with different DHs201510505101520Alcalase酶解物ProteaseN酶解物抗凝血酶活性(A T U /g p r o 水解度(%2.3氨基酸組成天然蛋清及其ProteaseN蛋白酶的酶解物(DH為5%與Alcalase(DH 為15%酶解物的氨基酸組成分析結(jié)果見表2。從表2可知,ProteaseN 和Alcalase 酶解物的氨基酸組成相似,其中天冬氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、亮氨酸的質(zhì)量

22、分?jǐn)?shù)比較高,分別是9.43%與10.89%、11.28%與13.56%、10.41%與12.35%、12.25%與10.28%。兩種酶解物的7種必需氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別達(dá)到了48.11%與45.80%,遠(yuǎn)高于天然蛋清的7種必需氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)35.65%。由于這些氨基酸在人體不能合成或合成的速度不能滿足機(jī)體的需要,必須由食物蛋白供給,因此這兩種酶解物具有很高的營養(yǎng)價(jià)值。遲玉杰等用大鼠喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)證明蛋清蛋白酶解物的營養(yǎng)價(jià)值優(yōu)于酪蛋白,消化利用率較高,是一種理想的氮源11。兩種酶解物的游離氨基酸組成分析結(jié)果見表3?？梢钥闯?ProteaseN 的DH 為15%酶解物的游離氨基酸含量為4.193mg/gp

23、ro,小于Alcalase 的DH 為15%的酶解物的游離氨基酸含量(6.429mg/gpro?？赡苁且駻lcalase 中含有少量外切酶引起。圖2酶解物對羥自由基的清除能力33305101520Alcalase酶解物ProteaseN酶解物羥自由基清除率(%水解度(%氨基酸游離氨基酸含量(mg/gpro4.1936.429表3酶解物的游離氨基酸組成Table 3 Free amino acid compositions of hydrolysates 圖5Protease N (DH 為15%酶解物的相對分子量分布Fig.5 Molecular weight distribution of

24、hydrolysate prepared withProtease N (DH 15%5.003300A U時(shí)間(min21991415717260圖6Alcalase (DH 為15%酶解物的相對分子量分布Fig.6 Molecular weight distribution of hydrolysate prepared withAlcalase (DH 15%5.003300A U時(shí)間(min21991418736268峰編號相對分子質(zhì)量分布(D各峰值的保留時(shí)間(min所占比例(%407219.00028.83362.24表4Protease N (DH 為15%酶解物的相對分子質(zhì)量分布

25、及相對含量Table 4 Molecular weight distribution and relative content ofhydrolysate prepared with Protease N (DH 15%名稱相對分子質(zhì)量分布(D各峰值的保留時(shí)間(min所占比例(%4113表5Alcalase (DH 為15%酶解物的相對分子質(zhì)量分布及相對含量Table 5 Molecular weight distribution and relative content ofhydrolysate prepared with Alcalase (DH 15%2.4相對分子質(zhì)量分布比例列于表4。可以看出,ProteaseN 的DH 為15%酶解物的相對分子質(zhì)量分布在28638D 之間,其中數(shù)ProteaseN(DH為15%和Alcalase(DH 為15%酶解物的相對分子質(zhì)量分布見圖5、6,它們分別由多種不同相對分子質(zhì)量的組分組成。為了更好地描述各組分的分子大小,引入數(shù)均相對分子質(zhì)量來描述各組分的平均相對分子質(zhì)