韌帶和肌腱修復(fù)的組織工程研究進(jìn)展

1、韌帶和肌腱修復(fù)的組織工程研究進(jìn)展         韌帶和肌腱是平行纖維帶，由致密結(jié)締組織構(gòu)成，對(duì)保持關(guān)節(jié)正常運(yùn)動(dòng)和穩(wěn)定性起重要作用。這些結(jié)構(gòu)損傷可導(dǎo)致明顯關(guān)節(jié)不穩(wěn)，引起其它組織損傷及發(fā)展成退行性關(guān)節(jié)疾病。在一些病例中，如膝關(guān)節(jié)前交叉韌帶損傷后不能自愈，需替代物移植治療。修復(fù)或重建損傷韌帶和肌腱可選擇3種生物替代物：自體移植物、同種異體移植物，及異種移植物。自體移植物已經(jīng)取得了最滿意的長(zhǎng)期效果1，但供體部位常出現(xiàn)疼痛、肌肉萎縮、肌腱炎等，是主要限制性因素2。冰凍異體韌帶移植物常導(dǎo)致免疫反應(yīng)，阻礙了組織重建，但存有傳播

2、疾病的風(fēng)險(xiǎn)，缺少供體及供體與受體之間的相容性是主要問題。牛移植替代物因?yàn)榕既怀霈F(xiàn)反復(fù)滲出、移植失敗及滑膜炎等未取得FDA認(rèn)證。另外，各種合成材料已經(jīng)用于韌帶置換，但855種假體韌帶隨訪15年均未取得滿意結(jié)果3。  組織工程是一項(xiàng)基于發(fā)展生物結(jié)構(gòu)來修復(fù)、重建或替代生物組織的技術(shù)。組織工程應(yīng)包括修復(fù)細(xì)胞，結(jié)構(gòu)模板，且易于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和代謝物質(zhì)運(yùn)輸，及提供分子和機(jī)械調(diào)節(jié)信號(hào)。韌帶和肌腱修復(fù)的組織工程應(yīng)包括：(1)自體細(xì)胞來源；(2)生化及物理因素調(diào)節(jié)BMSCs分化；(3)生物支架；(4)生物反應(yīng)系統(tǒng)。 1  細(xì)胞來源    理想的情況是用自體細(xì)

3、胞來消除異體細(xì)胞帶來的問題，如免疫排斥和疾病傳播。成人骨髓是骨髓基質(zhì)干細(xì)胞庫，骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow stromal cells，BMSc)能自我更新并具備向各種間質(zhì)細(xì)胞分化的能力。BMSCs具備幾點(diǎn)特殊的性質(zhì)使它成為各種組織工程的明確選擇：(1)能形成纖維母細(xì)胞單個(gè)集落，可根據(jù)其黏附于固體表面的能力將其分開并可擴(kuò)增得到大量細(xì)胞4，5；(2)BMSCs數(shù)量隨著年齡增長(zhǎng)而減少4，但在新生兒和年長(zhǎng)者該細(xì)胞的增殖、分化能力無明顯差異6；(3)可通過設(shè)定不同的培養(yǎng)條件誘導(dǎo)BMSCs向不同的間質(zhì)表型分化，包括成骨的骨母細(xì)胞，成軟骨的軟骨細(xì)胞，儲(chǔ)存脂肪的脂肪細(xì)胞，和成肌腱韌帶細(xì)胞7；(4)

4、由BMSCs形成的組織工程韌帶可作為合適的自體移植物，無需除手術(shù)部位以外的外科手術(shù)(傳統(tǒng)自體移植時(shí)需要)，且無免疫反應(yīng)的危險(xiǎn)(異體移植時(shí)可出現(xiàn))。   2  調(diào)節(jié)因子2.1  生化因子  生化因子對(duì)誘導(dǎo)和或支持特殊間質(zhì)細(xì)胞系的表達(dá)起著重要作用。氧氣可影響細(xì)胞外基質(zhì)的合成率及體外組織工程組織的發(fā)育8。氧氣是否會(huì)影響干細(xì)胞向韌帶纖維母細(xì)胞分化還不清楚。Fermor等9研究顯示高氧濃度(21)最大程度支持前交叉韌帶纖維母細(xì)胞分化，而低氧濃度(10)增強(qiáng)細(xì)胞外膠原合成。維生素C磷酸酯作為長(zhǎng)效維生素C來源，明顯增強(qiáng)體外培養(yǎng)細(xì)胞活性并提高I型膠原

5、表達(dá)水平911。生長(zhǎng)因子如表皮生長(zhǎng)因子(EGF)，堿性纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)，胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)，和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)可增強(qiáng)細(xì)胞增殖1214。另外，胰島素、TGF、和IGF可促進(jìn)結(jié)締組織蛋白表達(dá)及細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生1416。TGF與EGF，及TGF與胰島素可協(xié)同作用刺激纖維母細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞增殖13，17。Moreau等11利用高級(jí)DMEM(ADMEM)培養(yǎng)基體外培養(yǎng)BMSCs，無論是否添加生長(zhǎng)因子，與DMEM培養(yǎng)基相比，均可明顯提高BMSCsI型膠原表達(dá)水平。聯(lián)合應(yīng)用EGF和TGF(先后應(yīng)用)可最大限度提高細(xì)胞增殖及I型膠原表達(dá)。生長(zhǎng)因子對(duì)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的影響存在劑量依賴性，H

6、ankemeier等18研究證明低劑量bFGF(3 ngml)明顯促進(jìn)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向纖維母細(xì)胞方向分化，并明顯增加韌帶和肌腱特異性細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞骨架成分的表達(dá)，而高劑量bFGF(30 ngml)則無此作用。2.2  應(yīng)力刺激  影響體內(nèi)韌帶生長(zhǎng)發(fā)育的機(jī)械信號(hào)對(duì)于體外組織工程韌帶的培養(yǎng)同樣起著重要作用。施加應(yīng)力可至少在兩方面影響組織發(fā)育：(1)加強(qiáng)質(zhì)量傳遞；(2)直接刺激細(xì)胞。對(duì)培養(yǎng)的韌帶纖維母細(xì)胞施加機(jī)械刺激可增強(qiáng)I型和型膠原、纖維結(jié)合蛋白及黏蛋白-C的表達(dá)19,20。在缺少特殊生長(zhǎng)因子和調(diào)節(jié)因子作用下，對(duì)人類BMSCs施加生理性周期拉力，BMSCs即可向韌帶

7、樣細(xì)胞分化21,22。應(yīng)力通過直接影響細(xì)胞形狀和原纖維間隙，或通過液體流動(dòng)增強(qiáng)來自細(xì)胞和從細(xì)胞發(fā)出的質(zhì)量傳遞，可改變自體和組織工程韌帶的細(xì)胞外環(huán)境。   3  生物支架  支架結(jié)構(gòu)的機(jī)械性質(zhì)和降解率在很大程度上決定了在細(xì)胞和組織水平上的機(jī)械傳遞。對(duì)承受應(yīng)力的組織進(jìn)行組織工程修復(fù)，在新生組織具備一定的機(jī)械性能前保持支架的機(jī)械性能是對(duì)支架設(shè)計(jì)的一個(gè)很重要的要求。  生物材料支架為細(xì)胞黏附和組織發(fā)育提供了結(jié)構(gòu)模板，且生物降解率要與組織形成保持平衡。研究顯示支架對(duì)于促進(jìn)組織有規(guī)則地修復(fù)必不可少23。支架結(jié)構(gòu)決定營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、代謝物質(zhì)和調(diào)

8、節(jié)分子轉(zhuǎn)入和轉(zhuǎn)出細(xì)胞，而支架的機(jī)械性質(zhì)決定細(xì)胞和組織水平的機(jī)械傳導(dǎo)。理想情況下，支架應(yīng)由生物降解材料制成，且其降解率與新組織形成相配，并具有良好的生物相容性。生物材料可用來輸送調(diào)節(jié)分子，調(diào)節(jié)分子通常添加在培養(yǎng)基中24；也可與支架結(jié)合進(jìn)行局部應(yīng)用25。生物工程能大大受益于新一代生物誘導(dǎo)型生物材料支架，例如可輸送多種生長(zhǎng)因子26或根據(jù)機(jī)械應(yīng)力釋放生長(zhǎng)因子27。3.1  膠原支架  商用高純度I型膠原已經(jīng)用于制成凝膠和平行纖維束。膠原在靜態(tài)張力下可支持韌帶纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)。I型膠原凝膠為韌帶纖維母細(xì)胞增殖提供三維環(huán)境及在機(jī)械應(yīng)力下形成組織。將人類BMSCs種植于交聯(lián)膠原纖

9、維，其支持細(xì)胞黏附、擴(kuò)散及細(xì)胞外基質(zhì)沉積包裹纖維。培養(yǎng)1 d后，細(xì)胞形成局部接觸，呈梭形，并沿支架纖維排列。培養(yǎng)3 d后，平滑單層細(xì)胞形成，細(xì)胞數(shù)隨培養(yǎng)時(shí)間增加。但支架承受機(jī)械應(yīng)力能力隨培養(yǎng)時(shí)間而下降，結(jié)果支架纖維不能向黏附的BMSCs傳遞重復(fù)的應(yīng)力。膠原纖維的機(jī)械性能較差不利于其體外(在生物反應(yīng)器)和體內(nèi)(在膝關(guān)節(jié))的固定。3.2  絲支架  絲已經(jīng)在臨床應(yīng)用多年，并且又應(yīng)用在組織工程上。經(jīng)過處理的天然絲無相應(yīng)生物危險(xiǎn)性，在體內(nèi)和體外都具有較低生物降解率，且其機(jī)械性質(zhì)較好。與臨床應(yīng)用的大多數(shù)材料相比，絲是一種緩慢降解，具有較好生物相容性的生物材料。原絲經(jīng)過處理去

10、除潛在過敏原-絲膠蛋白。  當(dāng)制成合適的鋼纜幾何結(jié)構(gòu)時(shí)，絲纖蛋白的機(jī)械性質(zhì)與功能與前交叉韌帶相近22。如果不用特殊方法修飾支架幾何結(jié)構(gòu)將影響支架的彈性強(qiáng)度，且支架的剛度會(huì)下降。6股鋼纜絲纖維基質(zhì)設(shè)計(jì)用于滿足韌帶組織工程的4點(diǎn)重要要求：(1)增強(qiáng)組織浸潤(rùn)率(90空隙體積)；(2)增加質(zhì)量傳遞；(3)增加表面積有利于細(xì)胞黏附和細(xì)胞外基質(zhì)沉積；(4)減小線性剛度以適合天然韌帶，避免應(yīng)力遮擋。  疲勞試驗(yàn)顯示該支架可承受一千萬次生理負(fù)荷的循環(huán)作用。因?yàn)榻z的高彈性強(qiáng)度和鋼纜式設(shè)計(jì)使基質(zhì)有足夠的空隙容積供體外細(xì)胞種植和體內(nèi)細(xì)胞長(zhǎng)入。與人前交叉韌帶(每當(dāng)量長(zhǎng)度)相比，

11、絲基質(zhì)只占人前交叉韌帶體積的12(根據(jù)長(zhǎng)27 mm，直徑8 mm前交叉韌帶確定)。  絲支架具有合適的三維培養(yǎng)環(huán)境支持細(xì)胞黏附和擴(kuò)散。細(xì)胞種植后30 min，掃描電鏡觀察到細(xì)胞很容易黏附于支架。培養(yǎng)1 h后，細(xì)胞開始擴(kuò)散，7 d形成單細(xì)胞層，14 d聚集成韌帶組織基質(zhì)。3.3  異基因細(xì)胞外基質(zhì)支架    細(xì)胞外基質(zhì)是細(xì)胞分泌的產(chǎn)物，組織或器官在其基礎(chǔ)上形成。細(xì)胞外基質(zhì)的組成和超微結(jié)構(gòu)由影響細(xì)胞表型的因素決定，包括力學(xué)、生物化學(xué)環(huán)境、對(duì)氧的要求、pH值和固有的基因表達(dá)模式。反過來，細(xì)胞外基質(zhì)又影響細(xì)胞的生物行為和表型。基質(zhì)的組成和結(jié)構(gòu)

12、顯著影響細(xì)胞黏附、增殖和三維排列。    細(xì)胞外基質(zhì)組成成份是結(jié)構(gòu)和功能蛋白的復(fù)雜混合物，氨基葡聚糖、糖蛋白和小分子按照特殊的組織特異性三維結(jié)構(gòu)排列。其成份包括膠原、纖維黏連蛋白、層黏連蛋白、黏多糖及生長(zhǎng)因子。天然細(xì)胞外基質(zhì)區(qū)別于其它支架的重要特點(diǎn)是其結(jié)構(gòu)和功能蛋白的多樣性。細(xì)胞外基質(zhì)內(nèi)的生物活性分子及其特殊空間分布提供了大量生物信號(hào)。    醫(yī)用細(xì)胞外基質(zhì)生物材料的制備可將哺乳動(dòng)物組織和器官做去細(xì)胞處理。去除細(xì)胞成分就去除了所有與細(xì)胞有關(guān)的抗原決定簇，此種移植與傳統(tǒng)的自體、同種異體和異種基因組織器官移植相比，是明顯不同的移植類型。&

13、#160; 去細(xì)胞處理的典型方法包括在低滲鹽水中廣泛漂洗，用稀釋的過氧乙酸(0.1)處理或在Triton 100×中培育，然后用環(huán)氧乙烷或輻照消毒。這些方法已被證明可完全去除細(xì)胞成分，降解300 bp的核酸碎片，且保留生長(zhǎng)因子如bFGF和VEGF的生物活性28。  Cartmell和Dunn29，30研究了韌帶和肌腱組織去細(xì)胞處理的方法。他們比較了磷酸三丁酯(bri(nbutyl)phosphate，TBP)與十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)的去細(xì)胞效果。結(jié)果用SDS去細(xì)胞可達(dá)90，用TBP達(dá)84，所剩細(xì)胞集中于韌帶

14、骨連接處。韌帶去細(xì)胞后機(jī)械和生化性質(zhì)無明顯改變。與SDS處理韌帶相比，經(jīng)過TBP處理的去細(xì)胞韌帶更加有利于細(xì)胞增殖及長(zhǎng)入。            4  生物反應(yīng)系統(tǒng)  組織工程反應(yīng)器設(shè)計(jì)用來支持生理濃度的黏附細(xì)胞復(fù)合于特定支架上及通過增強(qiáng)質(zhì)量傳遞來控制環(huán)境條件32。目前認(rèn)為正常自體組織存在的機(jī)械調(diào)節(jié)信號(hào)(如韌帶動(dòng)力性拉力與扭曲力的結(jié)合)對(duì)組織形成一定的功能性質(zhì)必不可少21，31。最近研究顯示生物反應(yīng)器提供的動(dòng)力性負(fù)荷對(duì)于滿足體外組織工程的復(fù)雜要求必不可少。 

15、; 現(xiàn)在有多種商用生物反應(yīng)系統(tǒng)。一種應(yīng)用基質(zhì)灌流和機(jī)械應(yīng)力生物反應(yīng)系統(tǒng)被應(yīng)用于BMSCs組織工程韌帶32。該生物反應(yīng)器為韌帶組織工程特殊設(shè)計(jì)，對(duì)培養(yǎng)于水凝膠和纖維支架上的BMSCs提供多維機(jī)械應(yīng)力(軸向拉伸壓縮和扭曲力)。生物反應(yīng)器由電腦控制：(1)由12個(gè)單獨(dú)的反應(yīng)皿組成，每個(gè)反應(yīng)皿內(nèi)有一組織工程韌帶，且各自有一灌流回路；(2)氣體交換器用來控制培養(yǎng)基pH值和氧濃度；(3)12通道振動(dòng)泵；(4)應(yīng)力控制系統(tǒng)對(duì)韌帶行機(jī)械刺激。2個(gè)生物反應(yīng)器可同時(shí)運(yùn)作培養(yǎng)24個(gè)韌帶，如12個(gè)施以機(jī)械應(yīng)力，12個(gè)作為對(duì)照。該生物反應(yīng)器主要功能包括：(1)對(duì)施加機(jī)械應(yīng)力進(jìn)行精確控制；(2)控制培養(yǎng)基的流速

16、和通路；(3)精確控制培養(yǎng)基中氧濃度和pH值。  與未經(jīng)機(jī)械刺激的細(xì)胞則呈任意方向生長(zhǎng)21相比，機(jī)械刺激誘導(dǎo)細(xì)胞順著力的方向排列，且促進(jìn)了型膠原、型膠原和黏蛋白C的表達(dá)。同時(shí)，未觀察到骨和軟骨特異性細(xì)胞標(biāo)記物。重要的是，在沒有添加特殊韌帶分化誘導(dǎo)物的情況下，張力和扭曲力使BMSCs向韌帶細(xì)胞方向分化，而沒有向其它細(xì)胞分化。細(xì)胞功能(如增殖率和分化)、韌帶結(jié)構(gòu)(如組織成份的量和分布，超微結(jié)構(gòu)組成)、機(jī)械行為和韌帶特異性標(biāo)記物的表達(dá)隨組織培養(yǎng)過程不斷變化。這個(gè)模型系統(tǒng)能控制系統(tǒng)條件，定量評(píng)價(jià)環(huán)境條件和細(xì)胞組織反應(yīng)，所以可對(duì)體外組織發(fā)育進(jìn)行定量研究。韌帶特異性標(biāo)記物(型膠原、型膠

17、原和黏蛋白C)轉(zhuǎn)錄隨著培養(yǎng)時(shí)間增加而增加，且經(jīng)RTPCR測(cè)定，在機(jī)械刺激組轉(zhuǎn)錄水平始終高于無機(jī)械刺激韌帶。重要的是，機(jī)械刺激韌帶的細(xì)胞和細(xì)胞外組織基質(zhì)是沿應(yīng)力的方向排列和包圍支架的，形成多層組織2。   5  總結(jié)    韌帶和肌腱損傷的治療已經(jīng)進(jìn)行了大量研究。無論其自行愈合形成瘢痕組織或用異體移植物、異種移植物都無法達(dá)到其功能要求。而自體移植供體部位的并發(fā)癥又決定了其不可能廣泛應(yīng)用。組織工程為韌帶和肌腱損傷的愈合提供了新的治療途徑，其目的是使韌帶和肌腱達(dá)到功能性再生，達(dá)到正常未損傷組織的結(jié)構(gòu)和功能。將來組織工程的研究重點(diǎn)在于具有合適

18、生物結(jié)構(gòu)和機(jī)械強(qiáng)度的組織工程支架，并對(duì)其表面加以修飾以增強(qiáng)細(xì)胞反應(yīng)；對(duì)種子細(xì)胞進(jìn)行基因修飾以加強(qiáng)其細(xì)胞外基質(zhì)的表達(dá)；促進(jìn)組織工程韌帶在體內(nèi)形成接近正常自體韌帶的局部條件。隨著研究的發(fā)展一定會(huì)形成新一代組織工程韌帶和肌腱并生理性修復(fù)韌帶和肌腱的損傷。韌帶和肌腱組織工程的發(fā)展將為韌帶和肌腱損傷提供理想的治療途徑?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1 Fu FH, Bennett CH, Lattermann C, et al. Current trends in anterior cruciate ligament reconstruction, part I. Biology and biomechan

19、ics of reconstructionJ. J Sports Med(Am), 1999,27:821-830.2 Weitzel PP, Richmond JC, Altman GA, et al. Future direction of the treatment of ACL rupturesJ. Orthop. Clin. North（Am）, 2002, 33:653-661.3 Richmond JC, Manseau CJ, Patz R, et al. Anterior cruciate reconstruction using a dacron ligament pros

20、thesis. A longterm studyJ. Am. J. Sports Med, 1992, 20:24-28.4 Bruder SP, Jaiswal N, Haynesworth SE. Growth kinetics, selfrenewal, and the osteogenic potential of purified human mesenchymal stem cells during extensive subcultivation and following cryopreservationJ. J. Cell. Biochem, 1997, 64:278-294

21、.5 Ohgushi H, Caplan Al. Stem cell technology and bioceramics: from cell to gene engineeringJ. J Biomed Mater Res, 1999, 48:913-927.6 Turgeman G, Pittman DD, Muller R, et al. Engineered human mesenchymal stem cells: a novel platform for skeletal cell mediated gene therapy J. J Gene Med, 2001, 3:240-

22、251.7 Young RG, Butler DL, Weber W, et al. Use of mesenchymal stem cells in a collagen matrix for Achilles tendon repairJ. J Orthop Res, 1998,16:406-413.8 Obradovic B, Carrier RL, VunjakNovakovic G, et al. Gas exchange is essential for bioreactor cultivation of tissue engineered cartilageJ. Biotechnol. Bioeng, 1999, 63:197-205.9 Fermor B, Urban J, Murray D, et al. Proliferation and collagen synthesis of human ACL cells in vitro: effects of ascorbate2phosphate, dexamethasone and oxygen tensionJ. Cell Biol Int, 1998, 22:635-640.10Murray MM, Rice K, Wright R J, et al. The effect of selected g