韌帶和肌腱修復的組織工程研究進展

1、韌帶和肌腱修復的組織工程研究進展         韌帶和肌腱是平行纖維帶，由致密結締組織構成，對保持關節(jié)正常運動和穩(wěn)定性起重要作用。這些結構損傷可導致明顯關節(jié)不穩(wěn)，引起其它組織損傷及發(fā)展成退行性關節(jié)疾病。在一些病例中，如膝關節(jié)前交叉韌帶損傷后不能自愈，需替代物移植治療。修復或重建損傷韌帶和肌腱可選擇3種生物替代物：自體移植物、同種異體移植物，及異種移植物。自體移植物已經取得了最滿意的長期效果1，但供體部位常出現疼痛、肌肉萎縮、肌腱炎等，是主要限制性因素2。冰凍異體韌帶移植物常導致免疫反應，阻礙了組織重建，但存有傳播

2、疾病的風險，缺少供體及供體與受體之間的相容性是主要問題。牛移植替代物因為偶然出現反復滲出、移植失敗及滑膜炎等未取得FDA認證。另外，各種合成材料已經用于韌帶置換，但855種假體韌帶隨訪15年均未取得滿意結果3。  組織工程是一項基于發(fā)展生物結構來修復、重建或替代生物組織的技術。組織工程應包括修復細胞，結構模板，且易于營養(yǎng)物質和代謝物質運輸，及提供分子和機械調節(jié)信號。韌帶和肌腱修復的組織工程應包括：(1)自體細胞來源；(2)生化及物理因素調節(jié)BMSCs分化；(3)生物支架；(4)生物反應系統(tǒng)。 1  細胞來源    理想的情況是用自體細

3、胞來消除異體細胞帶來的問題，如免疫排斥和疾病傳播。成人骨髓是骨髓基質干細胞庫，骨髓基質干細胞(bone marrow stromal cells，BMSc)能自我更新并具備向各種間質細胞分化的能力。BMSCs具備幾點特殊的性質使它成為各種組織工程的明確選擇：(1)能形成纖維母細胞單個集落，可根據其黏附于固體表面的能力將其分開并可擴增得到大量細胞4，5；(2)BMSCs數量隨著年齡增長而減少4，但在新生兒和年長者該細胞的增殖、分化能力無明顯差異6；(3)可通過設定不同的培養(yǎng)條件誘導BMSCs向不同的間質表型分化，包括成骨的骨母細胞，成軟骨的軟骨細胞，儲存脂肪的脂肪細胞，和成肌腱韌帶細胞7；(4)

4、由BMSCs形成的組織工程韌帶可作為合適的自體移植物，無需除手術部位以外的外科手術(傳統(tǒng)自體移植時需要)，且無免疫反應的危險(異體移植時可出現)。   2  調節(jié)因子2.1  生化因子  生化因子對誘導和或支持特殊間質細胞系的表達起著重要作用。氧氣可影響細胞外基質的合成率及體外組織工程組織的發(fā)育8。氧氣是否會影響干細胞向韌帶纖維母細胞分化還不清楚。Fermor等9研究顯示高氧濃度(21)最大程度支持前交叉韌帶纖維母細胞分化，而低氧濃度(10)增強細胞外膠原合成。維生素C磷酸酯作為長效維生素C來源，明顯增強體外培養(yǎng)細胞活性并提高I型膠原

5、表達水平911。生長因子如表皮生長因子(EGF)，堿性纖維母細胞生長因子(bFGF)，胰島素樣生長因子(IGF)，和轉化生長因子(TGF)可增強細胞增殖1214。另外，胰島素、TGF、和IGF可促進結締組織蛋白表達及細胞外基質產生1416。TGF與EGF，及TGF與胰島素可協(xié)同作用刺激纖維母細胞和間質細胞增殖13，17。Moreau等11利用高級DMEM(ADMEM)培養(yǎng)基體外培養(yǎng)BMSCs，無論是否添加生長因子，與DMEM培養(yǎng)基相比，均可明顯提高BMSCsI型膠原表達水平。聯合應用EGF和TGF(先后應用)可最大限度提高細胞增殖及I型膠原表達。生長因子對骨髓基質干細胞的影響存在劑量依賴性，H

6、ankemeier等18研究證明低劑量bFGF(3 ngml)明顯促進骨髓基質干細胞向纖維母細胞方向分化，并明顯增加韌帶和肌腱特異性細胞外基質和細胞骨架成分的表達，而高劑量bFGF(30 ngml)則無此作用。2.2  應力刺激  影響體內韌帶生長發(fā)育的機械信號對于體外組織工程韌帶的培養(yǎng)同樣起著重要作用。施加應力可至少在兩方面影響組織發(fā)育：(1)加強質量傳遞；(2)直接刺激細胞。對培養(yǎng)的韌帶纖維母細胞施加機械刺激可增強I型和型膠原、纖維結合蛋白及黏蛋白-C的表達19,20。在缺少特殊生長因子和調節(jié)因子作用下，對人類BMSCs施加生理性周期拉力，BMSCs即可向韌帶

7、樣細胞分化21,22。應力通過直接影響細胞形狀和原纖維間隙，或通過液體流動增強來自細胞和從細胞發(fā)出的質量傳遞，可改變自體和組織工程韌帶的細胞外環(huán)境。   3  生物支架  支架結構的機械性質和降解率在很大程度上決定了在細胞和組織水平上的機械傳遞。對承受應力的組織進行組織工程修復，在新生組織具備一定的機械性能前保持支架的機械性能是對支架設計的一個很重要的要求。  生物材料支架為細胞黏附和組織發(fā)育提供了結構模板，且生物降解率要與組織形成保持平衡。研究顯示支架對于促進組織有規(guī)則地修復必不可少23。支架結構決定營養(yǎng)物質、代謝物質和調

8、節(jié)分子轉入和轉出細胞，而支架的機械性質決定細胞和組織水平的機械傳導。理想情況下，支架應由生物降解材料制成，且其降解率與新組織形成相配，并具有良好的生物相容性。生物材料可用來輸送調節(jié)分子，調節(jié)分子通常添加在培養(yǎng)基中24；也可與支架結合進行局部應用25。生物工程能大大受益于新一代生物誘導型生物材料支架，例如可輸送多種生長因子26或根據機械應力釋放生長因子27。3.1  膠原支架  商用高純度I型膠原已經用于制成凝膠和平行纖維束。膠原在靜態(tài)張力下可支持韌帶纖維母細胞生長。I型膠原凝膠為韌帶纖維母細胞增殖提供三維環(huán)境及在機械應力下形成組織。將人類BMSCs種植于交聯膠原纖

9、維，其支持細胞黏附、擴散及細胞外基質沉積包裹纖維。培養(yǎng)1 d后，細胞形成局部接觸，呈梭形，并沿支架纖維排列。培養(yǎng)3 d后，平滑單層細胞形成，細胞數隨培養(yǎng)時間增加。但支架承受機械應力能力隨培養(yǎng)時間而下降，結果支架纖維不能向黏附的BMSCs傳遞重復的應力。膠原纖維的機械性能較差不利于其體外(在生物反應器)和體內(在膝關節(jié))的固定。3.2  絲支架  絲已經在臨床應用多年，并且又應用在組織工程上。經過處理的天然絲無相應生物危險性，在體內和體外都具有較低生物降解率，且其機械性質較好。與臨床應用的大多數材料相比，絲是一種緩慢降解，具有較好生物相容性的生物材料。原絲經過處理去

10、除潛在過敏原-絲膠蛋白。  當制成合適的鋼纜幾何結構時，絲纖蛋白的機械性質與功能與前交叉韌帶相近22。如果不用特殊方法修飾支架幾何結構將影響支架的彈性強度，且支架的剛度會下降。6股鋼纜絲纖維基質設計用于滿足韌帶組織工程的4點重要要求：(1)增強組織浸潤率(90空隙體積)；(2)增加質量傳遞；(3)增加表面積有利于細胞黏附和細胞外基質沉積；(4)減小線性剛度以適合天然韌帶，避免應力遮擋。  疲勞試驗顯示該支架可承受一千萬次生理負荷的循環(huán)作用。因為絲的高彈性強度和鋼纜式設計使基質有足夠的空隙容積供體外細胞種植和體內細胞長入。與人前交叉韌帶(每當量長度)相比，

11、絲基質只占人前交叉韌帶體積的12(根據長27 mm，直徑8 mm前交叉韌帶確定)。  絲支架具有合適的三維培養(yǎng)環(huán)境支持細胞黏附和擴散。細胞種植后30 min，掃描電鏡觀察到細胞很容易黏附于支架。培養(yǎng)1 h后，細胞開始擴散，7 d形成單細胞層，14 d聚集成韌帶組織基質。3.3  異基因細胞外基質支架    細胞外基質是細胞分泌的產物，組織或器官在其基礎上形成。細胞外基質的組成和超微結構由影響細胞表型的因素決定，包括力學、生物化學環(huán)境、對氧的要求、pH值和固有的基因表達模式。反過來，細胞外基質又影響細胞的生物行為和表型?；|的組成和結構

12、顯著影響細胞黏附、增殖和三維排列。    細胞外基質組成成份是結構和功能蛋白的復雜混合物，氨基葡聚糖、糖蛋白和小分子按照特殊的組織特異性三維結構排列。其成份包括膠原、纖維黏連蛋白、層黏連蛋白、黏多糖及生長因子。天然細胞外基質區(qū)別于其它支架的重要特點是其結構和功能蛋白的多樣性。細胞外基質內的生物活性分子及其特殊空間分布提供了大量生物信號。    醫(yī)用細胞外基質生物材料的制備可將哺乳動物組織和器官做去細胞處理。去除細胞成分就去除了所有與細胞有關的抗原決定簇，此種移植與傳統(tǒng)的自體、同種異體和異種基因組織器官移植相比，是明顯不同的移植類型。&

13、#160; 去細胞處理的典型方法包括在低滲鹽水中廣泛漂洗，用稀釋的過氧乙酸(0.1)處理或在Triton 100×中培育，然后用環(huán)氧乙烷或輻照消毒。這些方法已被證明可完全去除細胞成分，降解300 bp的核酸碎片，且保留生長因子如bFGF和VEGF的生物活性28。  Cartmell和Dunn29，30研究了韌帶和肌腱組織去細胞處理的方法。他們比較了磷酸三丁酯(bri(nbutyl)phosphate，TBP)與十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)的去細胞效果。結果用SDS去細胞可達90，用TBP達84，所剩細胞集中于韌帶

14、骨連接處。韌帶去細胞后機械和生化性質無明顯改變。與SDS處理韌帶相比，經過TBP處理的去細胞韌帶更加有利于細胞增殖及長入。            4  生物反應系統(tǒng)  組織工程反應器設計用來支持生理濃度的黏附細胞復合于特定支架上及通過增強質量傳遞來控制環(huán)境條件32。目前認為正常自體組織存在的機械調節(jié)信號(如韌帶動力性拉力與扭曲力的結合)對組織形成一定的功能性質必不可少21，31。最近研究顯示生物反應器提供的動力性負荷對于滿足體外組織工程的復雜要求必不可少。 

15、; 現在有多種商用生物反應系統(tǒng)。一種應用基質灌流和機械應力生物反應系統(tǒng)被應用于BMSCs組織工程韌帶32。該生物反應器為韌帶組織工程特殊設計，對培養(yǎng)于水凝膠和纖維支架上的BMSCs提供多維機械應力(軸向拉伸壓縮和扭曲力)。生物反應器由電腦控制：(1)由12個單獨的反應皿組成，每個反應皿內有一組織工程韌帶，且各自有一灌流回路；(2)氣體交換器用來控制培養(yǎng)基pH值和氧濃度；(3)12通道振動泵；(4)應力控制系統(tǒng)對韌帶行機械刺激。2個生物反應器可同時運作培養(yǎng)24個韌帶，如12個施以機械應力，12個作為對照。該生物反應器主要功能包括：(1)對施加機械應力進行精確控制；(2)控制培養(yǎng)基的流速

16、和通路；(3)精確控制培養(yǎng)基中氧濃度和pH值。  與未經機械刺激的細胞則呈任意方向生長21相比，機械刺激誘導細胞順著力的方向排列，且促進了型膠原、型膠原和黏蛋白C的表達。同時，未觀察到骨和軟骨特異性細胞標記物。重要的是，在沒有添加特殊韌帶分化誘導物的情況下，張力和扭曲力使BMSCs向韌帶細胞方向分化，而沒有向其它細胞分化。細胞功能(如增殖率和分化)、韌帶結構(如組織成份的量和分布，超微結構組成)、機械行為和韌帶特異性標記物的表達隨組織培養(yǎng)過程不斷變化。這個模型系統(tǒng)能控制系統(tǒng)條件，定量評價環(huán)境條件和細胞組織反應，所以可對體外組織發(fā)育進行定量研究。韌帶特異性標記物(型膠原、型膠

17、原和黏蛋白C)轉錄隨著培養(yǎng)時間增加而增加，且經RTPCR測定，在機械刺激組轉錄水平始終高于無機械刺激韌帶。重要的是，機械刺激韌帶的細胞和細胞外組織基質是沿應力的方向排列和包圍支架的，形成多層組織2。   5  總結    韌帶和肌腱損傷的治療已經進行了大量研究。無論其自行愈合形成瘢痕組織或用異體移植物、異種移植物都無法達到其功能要求。而自體移植供體部位的并發(fā)癥又決定了其不可能廣泛應用。組織工程為韌帶和肌腱損傷的愈合提供了新的治療途徑，其目的是使韌帶和肌腱達到功能性再生，達到正常未損傷組織的結構和功能。將來組織工程的研究重點在于具有合適

18、生物結構和機械強度的組織工程支架，并對其表面加以修飾以增強細胞反應；對種子細胞進行基因修飾以加強其細胞外基質的表達；促進組織工程韌帶在體內形成接近正常自體韌帶的局部條件。隨著研究的發(fā)展一定會形成新一代組織工程韌帶和肌腱并生理性修復韌帶和肌腱的損傷。韌帶和肌腱組織工程的發(fā)展將為韌帶和肌腱損傷提供理想的治療途徑?！緟⒖嘉墨I】  1 Fu FH, Bennett CH, Lattermann C, et al. Current trends in anterior cruciate ligament reconstruction, part I. Biology and biomechan

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