木瓜蛋白酶的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用

1、木瓜蛋白酶的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用作者：吉財(cái)（學(xué)院：制藥工程 專業(yè)：制藥工程）摘 要 研究了木瓜蛋白酶生產(chǎn)工藝中的幾個(gè)重要環(huán)節(jié)G 結(jié)果表明: 用丹寧沉淀法既可提高產(chǎn) 品產(chǎn)量 又可保持產(chǎn)品質(zhì)量; 硫代硫酸鈉和半胱氨酸是木瓜蛋白酶活性的有效保護(hù)劑 可使酶活性比 對(duì)照提高2. 39倍; 提取過(guò)程中用抗壞血酸 EDTANa2 和氯化鈉可有效地提高產(chǎn)品的活性和質(zhì)量G關(guān)鍵詞：木瓜蛋白酶；木瓜凝乳酶；固定化酶；嫩肉粉The development and application of papainThe author：ji cai（College：Pharmaceutical engineering Pofession

2、al:Pharmaceutical engineering )Pick toPapain were studied in the process of production of several important links G results show that with tannin precipitation can improve products production and can keep the quality of the products; Sodium thiosulfate and cysteine is the activity of papain and effe

3、ctive protective agent Higher than that of contrast can make the enzyme activity 2. 39 times; Extraction process with EDTANa2 ascorbic acid and sodium chloride can effectively improve the product quality of activity and GKey words:Papain;Papaya rennet; Immobilized enzyme; Tender meat powder木瓜蛋白酶（pap

4、ain）來(lái)源于未成熟番木瓜（Carica papaya）果實(shí)的新鮮乳汁，是一種含疏基（-SH）肽鏈的內(nèi)切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有較廣泛的特異性，對(duì)動(dòng)植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有較強(qiáng)的水解能力；同時(shí)還具有合成的功能，能把蛋白水解物合成為類蛋白質(zhì)。工業(yè)用的木瓜蛋白酶一般都是未經(jīng)純化的多酶體系?，F(xiàn)已知經(jīng)木瓜乳汁干燥而得的木瓜蛋白酶至少含有四種主要酶類：木瓜蛋白酶（papain）、木瓜凝乳蛋白酶（chymopapain）、木瓜蛋白酶（papaya proteinase）、木瓜凝乳蛋白酶M（chymopapain M）1，其中木瓜凝乳蛋白酶的含量最多，占可溶性蛋白的45%。木瓜蛋白酶易溶于水和甘油

5、，水溶液為無(wú)色或淡黃色，有時(shí)呈乳白色；幾乎不溶于有機(jī)溶劑。它的最適pH值為5.7（一般39.5皆可），在中性或偏酸性時(shí)亦有作用；最適溫度為5560（一般1085皆可），耐熱性強(qiáng)，在90時(shí)也不會(huì)完全失活；受氧化劑抑制，還原性物質(zhì)激活。 1 木瓜蛋白酶的分離與純化 1.1木瓜蛋白的組分 工業(yè)用的木瓜蛋白酶一般都是未經(jīng)純化的多酶體系。由木瓜乳膠提取粗制酶,除含有木瓜蛋白酶外,還含有半耽氨酸蛋白酶、纖維素酶、溶菌酶、谷氨酞胺以及低相對(duì)分子質(zhì)量的疏基化合物,還有葡萄糖酶等。其中大部分都是疏基蛋白酶,主要的兩種組分是木瓜凝乳酶和木瓜蛋白酶2 。1.2木瓜蛋白酶的提取工藝 1.過(guò)去的常規(guī)提取方法 木瓜蛋白酶

6、最原始的提取方法是烘干法，就是在番木瓜漿液中加入保護(hù)劑，然后將漿液離心取上清液放置于鼓風(fēng)干燥箱中，在5560烘干，粉碎后即得到粗酶制品。乙引等用這種方法所獲得的酶得率為23.1%，但此法不利于酶活的保持，其酶活力僅為0.16×105U/g，而且產(chǎn)品的純度較低4 。 木瓜蛋白酶的提取也曾廣泛采用單寧沉淀法，乙引等用單寧沉淀法提取了木瓜蛋白酶。先將番木瓜乳汁離心，于上清液中緩慢加入已溶解的單寧溶液，不斷攪拌，使溶液中單寧達(dá)到一定濃度。靜置，沉淀單寧-酶復(fù)合物，調(diào)節(jié)pH值，沉淀后進(jìn)行真空干燥，得到酶制品。結(jié)果表明，這種方法生產(chǎn)的酶得率較低，僅有7.3%，但酶活力較高，為3.53×

7、105U/g。但是這種方法存在環(huán)境污染等問(wèn)題。木瓜蛋白酶的提取也曾廣泛采用單寧沉淀法，乙引等用單寧沉淀法提取了木瓜蛋白酶。先將番木瓜乳汁離心，于上清液中緩慢加入已溶解的單寧溶液，不斷攪拌，使溶液中單寧達(dá)到一定濃度。靜置，沉淀單寧-酶復(fù)合物，調(diào)節(jié)pH值，沉淀后進(jìn)行真空干燥，得到酶制品。結(jié)果表明，這種方法生產(chǎn)的酶得率較低，僅有7.3%，但酶活力較高，為3.53×105U/g。但是這種方法存在環(huán)境污染等問(wèn)題。 2. 目前較為常見(jiàn)的提取方法 目前生產(chǎn)中多采用超濾、絮凝、鹽析等方法分離提取木瓜蛋白酶。 2.1 超濾法提取木瓜蛋白酶 用超濾技術(shù)純化木瓜蛋白酶。先將中空纖維超濾膜洗凈, 然后取一定

8、量絮凝處理后之清液, 控制一定壓力和流量, 進(jìn)行超濾。在超濾過(guò)程中被截留, 而水及小分子雜質(zhì)透過(guò)膜, 從而達(dá)到濃縮和純化的目的, 試驗(yàn)截留率可達(dá)93% 以上。超濾過(guò)程操作條件溫和, 無(wú)相變化，不易引起生化物質(zhì)破壞, 是一種較好的分離技術(shù)5 。 2.2 鹽析法提取木瓜蛋白酶 曾用硫酸銨沉淀法分離木瓜蛋白酶。在粗酶液中加入一定濃度的硫酸銨溶液進(jìn)行鹽析，然后調(diào)pH值，離心取沉淀，干燥，得酶產(chǎn)品。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，用該法制備的木瓜蛋酶純度相對(duì)較高，酶的比活力達(dá)到了1184U/mg，適宜作為化妝品成分。但這種方法由于用了大量的鹽，使酶中灰分增加，同時(shí)降低了木瓜蛋白酶的活性。因此，鹽析法并不是理想的木瓜蛋白酶

9、提取方法6 。 2.3 絮凝法分離純化木瓜蛋白酶 絮凝法是在木瓜乳膠水提取液中添加某種化合物，該化合物能與木瓜蛋白酶生成難溶性的復(fù)合物，從而使酶從溶液中沉淀析出,研究了用絮凝技術(shù)純化木瓜蛋白酶。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在適宜的條件下進(jìn)行絮凝處理，可使木瓜蛋白酶在這步的收率達(dá)9597%。但這種方法提取專一性不強(qiáng)，制得的木瓜蛋白酶純度不高，雜質(zhì)含量較高7 。 3木瓜蛋白酶的提取新技術(shù) 3.1超聲波法提取木瓜蛋白酶 超聲波提取法作為一種新型的提取技術(shù)已經(jīng)比較廣泛地應(yīng)用于天然植物有效成分的提取。超聲波產(chǎn)生的空化效應(yīng)，一方面賦予溶劑對(duì)細(xì)胞壁更大的滲透力，并強(qiáng)化細(xì)胞內(nèi)外的質(zhì)量傳輸，另一方面破壞細(xì)胞壁，使細(xì)胞內(nèi)含物更

10、易釋放，從而強(qiáng)化了提取過(guò)程19。 4木瓜蛋白酶的固定化 由于木瓜蛋白酶價(jià)格昂貴且無(wú)法重復(fù)利用，促使人們研究和制備固定化木瓜蛋白酶。固定化的木瓜蛋白酶可以避免其在酸堿和有機(jī)介質(zhì)中失活，實(shí)現(xiàn)酶的 反復(fù)利用，達(dá)到節(jié)約生產(chǎn)成本的目的。常用的固定化方法有吸附、載體交聯(lián)和包 埋法。 4.1 吸附法 利用固體吸附劑將酶或含酶菌體吸附在其表面而 使酶固定化的方法稱為吸附法。常用的吸附劑有活性炭、氧化鋁、硅藻土、多孔 陶瓷、多孔玻璃、硅膠、 羧基磷灰石等13。磷酸緩沖液處理后的多孔陶瓷膜 作為固定化酶的載體，采用物理吸附法固定木瓜蛋白 酶。結(jié)果表明，當(dāng)溶液酶質(zhì)量濃度為1.02.0mg/mL、pH為7.0、固定2

11、h時(shí)，固定化酶的活力最高可達(dá)111.1U/g，活力回收達(dá)57.9%，半衰期為54d。 4.2 載體交聯(lián)法 交聯(lián)法是采用雙功能試劑使酶分子之間或酶分子與固相載體之間發(fā)生交聯(lián)作用 而制成固定化酶的方法。常用的雙功能試劑有戊二醛、己二胺等14。以殼聚糖為載體、戊二醛為交聯(lián)劑固定化木瓜蛋白酶，研究結(jié)果表 明殼聚糖固定化木瓜蛋 白酶的最佳條件為：殼聚糖濃度2.5%，加酶量0.3g/g載體，時(shí)間6h，溫度15，pH7.5，酶活力回收率38.98%。固定化酶重復(fù)使用五次，酶活力仍保持50% 以上 4.3 包埋法將酶或含酶菌體包埋在多孔載體中，使酶固定化的方法稱為包埋法15。采用微孔淀粉-海藻酸鈉包埋法固定化

12、木 瓜蛋白酶，結(jié)果表明，最佳固定化木瓜蛋白酶制備條件為微孔淀粉濃度4%，海 藻酸鈉濃度3%，CaC12 濃度5.5%。此時(shí)固定化木瓜蛋白酶的最適pH值為5.7，最適溫度72，其耐熱性、操作穩(wěn)定性、機(jī)械強(qiáng)度都不同程度增加，操作成本低 適合工業(yè)推廣。 4.4 其他新方法 近幾年來(lái)人們不斷地開(kāi)發(fā)新型的固定化載體和新方法，取得了較好的成果16。以氧化硅介孔泡沫材料為載體對(duì)木瓜蛋白酶進(jìn)行了固定，結(jié)果表明，固定化木瓜蛋白酶的最 適反應(yīng)溫度較游離酶提高 了10，最適pH值向堿性方向偏移0.5個(gè)單位，酶活保留65.1%17。對(duì)高沸醇木質(zhì)素和酶解木質(zhì)素進(jìn)行化學(xué)改性，以增加木質(zhì)素的親水性，制得新型 高 聚物高沸醇

13、木質(zhì)素酚（HBS木質(zhì)素酚）和木質(zhì)素氨基酚衍生物，對(duì)木瓜蛋白進(jìn) 行了固定化的研究，結(jié)果 表明，木瓜蛋白酶被酶解木質(zhì)素氨基酚和 HBS木質(zhì)素酚吸附時(shí)活性回收率達(dá)到 50%以上，有望成為固定化 酶的優(yōu)良載體。 5、 木瓜蛋白酶在食品加工業(yè)的應(yīng)用5.1焙烤食品：將木瓜蛋白酶加入生面團(tuán)中，可使面筋降解，生面團(tuán)被軟化后易于加工，并能提高餅干與面包的口感與品質(zhì)。 5.2啤酒釀造：應(yīng)用于啤酒釀造工藝流程中能降低麥芽用量，提高麥汁氨基氮（提供酵母生產(chǎn)氮源），促進(jìn)發(fā)酵雙乙酰的降解，使啤酒澄清防凍、阻止冷藏過(guò)程中啤酒冷濁形成，效果顯著。 5.3干酪：木瓜蛋白酶用于干酪素的凝結(jié)。 5.4肉類的嫩化：木瓜蛋白酶將肉類蛋

14、白質(zhì)的大分子蛋白質(zhì)水解為易吸收的小分子氨基酸和蛋白質(zhì)。可用于各類肉制品的精加工（制成牛排肉坯、雞精等）、肉類的嫩化、處理老韌筋雜肉類等。 5.5水產(chǎn)品深加工：如水解珍珠蛋白。 5.6淀粉糖工業(yè)：原料經(jīng)液化后，加入木瓜蛋白酶，原料保溫糖化18。 5.7木瓜蛋白酶在其它食品加工業(yè)中的應(yīng)用，亦正在被廣泛地研究與開(kāi)發(fā)，如增加豆餅和豆粉的PDI值和NSI值，生產(chǎn)可溶性蛋白制品及含豆粉的早餐、谷類食物和飲料；脫水豆類；嬰兒食品和人造黃油；澄清蘋(píng)果汁；制造軟糖；蛋與蛋制品；促消化保健食品及其他醫(yī)藥品等8。 6、 廣州華琪的木瓜蛋白酶的應(yīng)用案例和工藝技術(shù)分享 廣州華琪（原廣州酶制品廠）自1985年生產(chǎn)和應(yīng)用木

15、瓜蛋白酶，木瓜蛋白酶方向的應(yīng)用方案和工藝技術(shù)已經(jīng)非常純熟。多年來(lái)廣州華琪生產(chǎn)的大量雞肉類提取物已得到市場(chǎng)的廣泛認(rèn)可。現(xiàn)將工藝技術(shù)和應(yīng)用案例分享如下： 6.1木瓜蛋白酶應(yīng)用在肉類水解，如豬肉、雞肉、海鮮肉類等。 l 肉類嫩化 牛肉、羊肉或豬瘦肉切薄片或小塊，按200U/g400U/g肉將本品添加到清水或其他腌制料中，常溫下腌制3050min或在4060下腌制1025min，可使粗糙、老硬的肉類變得細(xì)嫩爽滑、鮮美醇厚20.雞肉水解雞骨架絞碎，加水12倍，按8002000U/g雞骨架添加本品，5065下攪拌酶解24h可以將蛋白全部液化，酶解液鮮美、無(wú)苦味，適用于雞粉、雞肉抽提物和雞肉香精反應(yīng)基料的生

16、產(chǎn)9。 6.2木瓜蛋白酶應(yīng)用于植物蛋白水解。如小麥、大豆、玉米蛋白等。小麥蛋白淺度酶解生產(chǎn)仔豬膳食補(bǔ)充劑11。小麥蛋白粉加水至濃度為20%30%，按8004000U/g小麥蛋白粉添加本品，pH自然，于4550下攪拌酶解0.54h，酶解液咸鮮、無(wú)苦味，噴霧干燥得到的改性小麥蛋白具有良好的分散性，其中可溶性多肽占4060%，易于吸收利用，仔豬飼料中添加2.05.0%的淺度小麥蛋白可有效預(yù)防腹瀉、促進(jìn)仔豬生長(zhǎng)。小麥蛋白深度酶解生產(chǎn)鮮味肽和美拉德反應(yīng)基料 小麥蛋白粉經(jīng)有機(jī)酸或還原劑預(yù)處理后加水至2030%的濃度，按8001600U/g谷朊粉加入本品，在自然pH下，于4555與其他蛋白酶聯(lián)用復(fù)合酶解26

17、h，水解利用率達(dá)8085%，水解度達(dá)25%40%，酶解液無(wú)苦味且具有獨(dú)特的呈鮮作用，可作為新型的鮮味劑和優(yōu)良的美拉德反應(yīng)基料。 6.3木瓜蛋白酶用于烘焙類產(chǎn)品 餅干松化劑，先將本品按4001000U/g面粉的比例分散到水中再按比例加入 面粉，在混攪、揉搓和發(fā)酵過(guò)程中可適度降解面筋蛋白，增加呈味多肽和氨基酸，改善面筋蛋白的結(jié)構(gòu)，降低面團(tuán)的筋度，使產(chǎn)品酥脆可口。 7.結(jié)尾 目前，木瓜蛋白酶被廣泛地應(yīng)用于食品行業(yè)，如肉類、啤酒、調(diào)味品等的生產(chǎn)。隨著我國(guó)人民生活水平的提高，人們對(duì)食品安全和食品營(yíng)養(yǎng)的問(wèn)題越來(lái)越注，而木瓜蛋白酶可用來(lái)生產(chǎn)安全、營(yíng)養(yǎng)的食品，如具有保健功能的口服液等，具有良好的市場(chǎng)前景。 同

18、時(shí)，為了滿足各行各業(yè)對(duì)木瓜蛋白酶的需求，尤其是食品與醫(yī)藥行業(yè)，研究如何分離純化得到成本低、純度高的木瓜蛋白酶就很有意義。因此，對(duì)木瓜蛋白酶的提取和分離純化技術(shù)進(jìn)行深入的研究，提取高質(zhì)量的木瓜蛋白酶具有重要的實(shí)用價(jià)值10 。 參考文獻(xiàn) 1 齊 杰,李 強(qiáng). 高比活木瓜蛋白粗酶的快速分離J.吉林大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報(bào)，1996(4): 103-104. 2 吳建中,趙謀明.木瓜蛋白酶水解大豆分離蛋白研究J.大豆科學(xué),2002,8(21):187-190. 3 巫慶華.木瓜蛋白酶凝固大豆蛋白機(jī)理J.乳業(yè)科學(xué)與技術(shù).2002(1): 6-9. 4 解 蕊,張根生.木瓜蛋白酶水解雞骨泥工藝條件的研究J.食品工

19、業(yè), 2002(1):40-42. 5 宋常欣,陳 玲.啤酒非生物穩(wěn)定劑的應(yīng)用和比較J.食品與發(fā)酵工業(yè)，2001,3(27): 79-81. 6乙 引,陳 平.木瓜蛋白酶改良啤酒品質(zhì)的研究J.貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)2000,28(4):14-16. 7 沈悅. 番木瓜蛋白酶研究與應(yīng)用綜述. 科技信息. 2008 8 吳顯榮. 木管蛋白酶的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào). 2005 9 Guo W., Ruckenstein E. Separation and purification of horseradish peroxidase by membrane affinity chromato-graphy J. Membr Sci , 2003 , 211 : 101-111. 10 蔡曉雯等. 肉的嫩化與番木管蛋白酶. 肉類研究.