基因工程載體

1、第三章第三章 基因工程載體基因工程載體vectors在基因工程操作中，把能攜帶外源在基因工程操作中，把能攜帶外源DNA進(jìn)入進(jìn)入受體細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增和表達(dá)的受體細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增和表達(dá)的DNA分子叫載體。分子叫載體。1. 載體載體 （Vectors）（1）具有在宿主細(xì)胞中獨(dú)立地進(jìn)行自我復(fù)制和表達(dá)的能力，）具有在宿主細(xì)胞中獨(dú)立地進(jìn)行自我復(fù)制和表達(dá)的能力，在受體細(xì)胞中擴(kuò)增較多的拷貝。在受體細(xì)胞中擴(kuò)增較多的拷貝。（2 2）有兩個以上容易檢測的遺傳標(biāo)記，以賦予宿主細(xì)胞以不）有兩個以上容易檢測的遺傳標(biāo)記，以賦予宿主細(xì)胞以不同的表型，便于識別和篩選同的表型，便于識別和篩選 。（3）具多個限制性內(nèi)切酶的單一切點(diǎn)（單一切

2、點(diǎn)越多，越易具多個限制性內(nèi)切酶的單一切點(diǎn)（單一切點(diǎn)越多，越易選擇合適的酶，保證目的基因的完整性，單一切點(diǎn)最好位選擇合適的酶，保證目的基因的完整性，單一切點(diǎn)最好位于選擇標(biāo)記基因內(nèi)，便于篩選重組體）。于選擇標(biāo)記基因內(nèi)，便于篩選重組體）。（4 4）載體）載體DNADNA的分子量應(yīng)較小，可插入較大的外源的分子量應(yīng)較小，可插入較大的外源DNADNA片段，片段，而不影響其自身的復(fù)制。而不影響其自身的復(fù)制。 （5）容易從宿主細(xì)胞中分離純化。）容易從宿主細(xì)胞中分離純化。2. 基因工程對載體基因工程對載體 的要求的要求 基因工程中常用的載體：基因工程中常用的載體： 3. 載體載體 的種類的種類按功能分：克隆載體

3、與表達(dá)載體按功能分：克隆載體與表達(dá)載體按宿主分：原核按宿主分：原核載體：細(xì)菌質(zhì)粒、載體：細(xì)菌質(zhì)粒、 phagephage、M13M13單鏈單鏈phagephage、CosmidCosmid。 真核載體：真核載體：SV40載體、人工染色體、酵母質(zhì)粒、載體、人工染色體、酵母質(zhì)粒、植物轉(zhuǎn)化載體。植物轉(zhuǎn)化載體。穿梭載體（穿梭載體（shuttle vector）：指帶有兩種宿主復(fù)制子，因而）：指帶有兩種宿主復(fù)制子，因而能在兩種生物體內(nèi)復(fù)制的載體分子能在兩種生物體內(nèi)復(fù)制的載體分子 第一節(jié)第一節(jié) 質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體 一、質(zhì)粒（一、質(zhì)粒（plasmid）是獨(dú)立于染色體以外的能自主復(fù)制的是獨(dú)立于染色體以外的能自主

4、復(fù)制的雙鏈閉合環(huán)狀雙鏈閉合環(huán)狀DNA分子。分子。存在于細(xì)菌、霉菌、藍(lán)藻、酵母等細(xì)胞中。存在于細(xì)菌、霉菌、藍(lán)藻、酵母等細(xì)胞中。質(zhì)粒的命名：一個小寫字母質(zhì)粒的命名：一個小寫字母 p 加加 2-3 個大寫字母和數(shù)個大寫字母和數(shù)字，如字，如 pUC18，pDTG1。1、質(zhì)粒的基本性質(zhì)、質(zhì)粒的基本性質(zhì)（1）質(zhì)粒的復(fù)制）質(zhì)粒的復(fù)制 ： 所有的質(zhì)粒上都至少有一個復(fù)制子，有的質(zhì)粒（小型）借所有的質(zhì)粒上都至少有一個復(fù)制子，有的質(zhì)粒（小型）借用宿主細(xì)胞的用宿主細(xì)胞的DNA復(fù)制酶類來復(fù)制；有些質(zhì)粒含有編碼專門復(fù)制酶類來復(fù)制；有些質(zhì)粒含有編碼專門用于質(zhì)粒復(fù)制的酶的基因；小部分質(zhì)?？坎迦胫了拗骷?xì)胞染色用于質(zhì)粒復(fù)制的酶的

5、基因；小部分質(zhì)粒靠插入至宿主細(xì)胞染色體上隨染色體復(fù)制而復(fù)制。不同的質(zhì)粒用不同的酶系列，在宿體上隨染色體復(fù)制而復(fù)制。不同的質(zhì)粒用不同的酶系列，在宿主中進(jìn)行不同程度的復(fù)制。主中進(jìn)行不同程度的復(fù)制。 復(fù)制子是一個遺傳單位，包括復(fù)制子是一個遺傳單位，包括DNA復(fù)制起點(diǎn)及其相關(guān)的復(fù)制起點(diǎn)及其相關(guān)的調(diào)控元件。在質(zhì)粒中，復(fù)制起點(diǎn)是一段特定的調(diào)控元件。在質(zhì)粒中，復(fù)制起點(diǎn)是一段特定的DNA片段。長片段。長約幾百堿基對，其相關(guān)的順式作用調(diào)控元件中含有參與約幾百堿基對，其相關(guān)的順式作用調(diào)控元件中含有參與DNA合成起始的由質(zhì)?；蛩拗骶幋a的可擴(kuò)散因子的結(jié)合位點(diǎn)。因此，合成起始的由質(zhì)?；蛩拗骶幋a的可擴(kuò)散因子的結(jié)合位點(diǎn)。因

6、此，質(zhì)粒復(fù)制子可被定義為質(zhì)粒質(zhì)粒復(fù)制子可被定義為質(zhì)粒DNA中能自主復(fù)制并維持正?？街心茏灾鲝?fù)制并維持正?？截悢?shù)的一段最小的核酸序列單位。貝數(shù)的一段最小的核酸序列單位。 質(zhì)粒的復(fù)制子質(zhì)粒的復(fù)制子(replicon)決定其拷貝數(shù)，決定其拷貝數(shù)，不同的質(zhì)粒，自身不同的質(zhì)粒，自身復(fù)制能力不同，在宿主細(xì)胞內(nèi)的拷貝數(shù)也不同復(fù)制能力不同，在宿主細(xì)胞內(nèi)的拷貝數(shù)也不同。 質(zhì)粒分子中為質(zhì)粒復(fù)制所必需的最小區(qū)段稱為基本復(fù)制子，質(zhì)粒分子中為質(zhì)粒復(fù)制所必需的最小區(qū)段稱為基本復(fù)制子，它由兩部分組成，一是復(fù)制原點(diǎn)它由兩部分組成，一是復(fù)制原點(diǎn)(origin of replication ori)，二是，二是調(diào)節(jié)復(fù)制起始的基因

7、（編碼蛋白質(zhì)或調(diào)節(jié)復(fù)制起始的基因（編碼蛋白質(zhì)或RNA)。 質(zhì)粒的拷貝數(shù)（質(zhì)粒的拷貝數(shù)（copy number）：某種質(zhì)粒在細(xì)菌細(xì)胞中）：某種質(zhì)粒在細(xì)菌細(xì)胞中的數(shù)目。的數(shù)目。 根據(jù)質(zhì)粒復(fù)制的類型，可將質(zhì)粒分為根據(jù)質(zhì)粒復(fù)制的類型，可將質(zhì)粒分為2類：類： 嚴(yán)緊型質(zhì)粒（嚴(yán)緊型質(zhì)粒（stringent plasmid）和松弛型質(zhì)粒（）和松弛型質(zhì)粒（relaxed plasmid）多數(shù)多數(shù)DNADNA重組都采用松弛型質(zhì)粒，只有當(dāng)基因產(chǎn)物或多拷貝的克重組都采用松弛型質(zhì)粒，只有當(dāng)基因產(chǎn)物或多拷貝的克隆基因?qū)λ拗饔泻r，才用嚴(yán)緊型質(zhì)粒。隆基因?qū)λ拗饔泻r，才用嚴(yán)緊型質(zhì)粒?？截悢?shù)拷貝數(shù)復(fù)制特點(diǎn)復(fù)制特點(diǎn) 對氯霉素對

8、氯霉素/壯觀霉素反應(yīng)壯觀霉素反應(yīng) （抑制蛋（抑制蛋白質(zhì)合成，阻止細(xì)菌染色體白質(zhì)合成，阻止細(xì)菌染色體復(fù)制）復(fù)制）嚴(yán)緊型嚴(yán)緊型1幾個幾個 復(fù)制伴隨著復(fù)制伴隨著染色體的染色體的DNADNA復(fù)制復(fù)制 復(fù)制停止復(fù)制停止 松弛型松弛型10-200 復(fù)制與染色復(fù)制與染色體體DNA的復(fù)的復(fù)制無關(guān)制無關(guān) 繼續(xù)復(fù)制，拷貝數(shù)增至繼續(xù)復(fù)制，拷貝數(shù)增至2000-3000 質(zhì)粒中已鑒定的復(fù)制子已逾質(zhì)粒中已鑒定的復(fù)制子已逾30個。但是，目前在分子克隆個。但是，目前在分子克隆中常規(guī)使用的幾乎所有的質(zhì)粒都帶有一個來源于中常規(guī)使用的幾乎所有的質(zhì)粒都帶有一個來源于pMB1的復(fù)制子，的復(fù)制子，該質(zhì)粒最初是從一例臨床標(biāo)本中分離到的該質(zhì)

9、粒最初是從一例臨床標(biāo)本中分離到的(Hershfield et al.1974)。帶有該復(fù)制子帶有該復(fù)制子或親緣關(guān)系與之十分接近的大腸桿菌或親緣關(guān)系與之十分接近的大腸桿菌E1(colE1)復(fù)復(fù)制子制子(Balbas et al.1986)的質(zhì)粒在每個細(xì)菌細(xì)胞中可維持的質(zhì)粒在每個細(xì)菌細(xì)胞中可維持15一一20個拷貝。個拷貝。 pMB1/colE1復(fù)制子已經(jīng)被大量改造以增加拷貝數(shù)，從而提復(fù)制子已經(jīng)被大量改造以增加拷貝數(shù)，從而提高質(zhì)粒高質(zhì)粒DNA的產(chǎn)量。高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體廣泛應(yīng)用于分子克隆的產(chǎn)量。高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體廣泛應(yīng)用于分子克隆及幾乎所有小片段重組及幾乎所有小片段重組DNA(40 oC）時，拷貝數(shù)會

10、很快增）時，拷貝數(shù)會很快增加到加到1000個以上。個以上。如如pBEU1、pBEU2。runaway plasmid vectors1979年年B. E. Uhlin等構(gòu)建。等構(gòu)建。（4） 插入失活型質(zhì)粒載體插入失活型質(zhì)粒載體載體的克隆位點(diǎn)位于其某一個選擇性載體的克隆位點(diǎn)位于其某一個選擇性標(biāo)記基因內(nèi)部。標(biāo)記基因內(nèi)部。如如pDF41、pDF42、pBR329?？咕乜剐钥咕乜剐酝庠赐庠碊NA無抗菌素抗性無抗菌素抗性（5）正選擇的質(zhì)粒載體正選擇的質(zhì)粒載體如如pUR2、pTR262等。等。只有帶有選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)化菌細(xì)胞才只有帶有選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)化菌細(xì)胞才能在選擇培養(yǎng)基上生長。能在選擇培養(yǎng)基上生長

11、。直接選擇轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞。直接選擇轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞。目前通用的絕大部分質(zhì)粒載體都是正目前通用的絕大部分質(zhì)粒載體都是正選擇載體。選擇載體。Direct selection vectors（6） 表達(dá)型質(zhì)粒載體表達(dá)型質(zhì)粒載體主要用來使外源基因表達(dá)出蛋白質(zhì)產(chǎn)物。主要用來使外源基因表達(dá)出蛋白質(zhì)產(chǎn)物。如果在大腸桿菌里表達(dá)，必須把所克隆如果在大腸桿菌里表達(dá)，必須把所克隆的真核生物的基因置于大腸桿菌的轉(zhuǎn)的真核生物的基因置于大腸桿菌的轉(zhuǎn)錄錄翻譯信號控制之下。翻譯信號控制之下。注意啟動子的性質(zhì)，終止子、起始注意啟動子的性質(zhì)，終止子、起始密碼、終止密碼的閱讀正確。密碼、終止密碼的閱讀正確。復(fù)制起始點(diǎn)復(fù)制起始點(diǎn)ORI、選

12、擇標(biāo)記、選擇標(biāo)記、多克隆位點(diǎn)多克隆位點(diǎn)MCS2）大腸桿菌操縱子元件）大腸桿菌操縱子元件阻遏基因阻遏基因 I操縱基因操縱基因O啟動基因啟動基因P核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列（核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列（SD）轉(zhuǎn)錄終止信號區(qū)。轉(zhuǎn)錄終止信號區(qū)。1）普通載體元件）普通載體元件 表達(dá)載體的表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)五、經(jīng)典的大腸桿菌質(zhì)粒載體五、經(jīng)典的大腸桿菌質(zhì)粒載體1. pSC101第一個成功地用于克隆實(shí)驗(yàn)的大腸桿菌質(zhì)第一個成功地用于克隆實(shí)驗(yàn)的大腸桿菌質(zhì)粒載體。粒載體。（1）類型）類型天然質(zhì)粒，屬低拷貝型。天然質(zhì)粒，屬低拷貝型。（2）長度）長度9.09 kb。（3）選擇標(biāo)記）選擇標(biāo)記四環(huán)素抗性四環(huán)素抗性Tetr6個克隆位點(diǎn)：個克

13、隆位點(diǎn)：EcoR I、Xho I、Pvu I、Hind III、BamH I、Sal I主要使用主要使用EcoR I。（其中（其中Hind III、BamH I、Sal I 3個位個位于選擇標(biāo)記于選擇標(biāo)記Tetr的內(nèi)部）的內(nèi)部）（4）克隆位點(diǎn)）克隆位點(diǎn)2. ColE1（1）類型）類型天然質(zhì)粒，屬高拷貝型。天然質(zhì)粒，屬高拷貝型。（2）長度）長度6.3 kb。（3）選擇標(biāo)記）選擇標(biāo)記大腸桿菌素（大腸桿菌素（colicin）E1和對和對E1免疫的基因（免疫的基因（immE1）特點(diǎn)是在培養(yǎng)基中加入氯霉素抑制細(xì)菌特點(diǎn)是在培養(yǎng)基中加入氯霉素抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成后，質(zhì)粒仍然能復(fù)制達(dá)到每蛋白質(zhì)合成后，質(zhì)粒仍然能

14、復(fù)制達(dá)到每個細(xì)胞個細(xì)胞1000-30001000-3000拷貝之多！拷貝之多！ colicin E1基因的結(jié)構(gòu)基因的結(jié)構(gòu)ceaimmkil結(jié)構(gòu)基因結(jié)構(gòu)基因免疫基因免疫基因溶菌基因溶菌基因 殺死不含有殺死不含有ColE1細(xì)菌的原因細(xì)菌的原因cea + kil基因產(chǎn)物基因產(chǎn)物 不被其他細(xì)菌的不被其他細(xì)菌的colicin E1所殺死的原因所殺死的原因imm基因基因EcoR I位于位于E1內(nèi)部，插入外源內(nèi)部，插入外源DNA會導(dǎo)會導(dǎo)致致E1失活，使受體菌不能合成失活，使受體菌不能合成E1（ColE1- -），但仍然表現(xiàn)出對），但仍然表現(xiàn)出對E1免疫型免疫型（ImmE1+ +）。）。EcoR I（4）克隆

15、位點(diǎn)）克隆位點(diǎn)Colicin E1外源外源DNA無無Colicin用對外源用對外源colicin E1的免疫性和自身不能的免疫性和自身不能合成合成colicin E1作選擇，操作非常繁雜。作選擇，操作非常繁雜。對對colicin E1敏感的細(xì)菌群體中自發(fā)突變敏感的細(xì)菌群體中自發(fā)突變產(chǎn)生抗產(chǎn)生抗colicin E1的頻率很高！的頻率很高?。?）ColE1的選擇缺陷的選擇缺陷ColE1抗抗 colicinE1殺殺ColE1- -仍抗仍抗 colicinE1不殺不殺ColE1- -插入片斷插入片斷ColE1pSP2124質(zhì)粒的質(zhì)粒的Ampr基因基因3. pBR322：（1）元件來源）元件來源F. B

16、olivar和和R.L. Rodriguez人工構(gòu)建載體。人工構(gòu)建載體。 復(fù)制起點(diǎn)復(fù)制起點(diǎn) oripMB1系列（來源于系列（來源于ColE1）的的高拷貝高拷貝型復(fù)制起點(diǎn)型復(fù)制起點(diǎn) Ampr基因基因 Tetr基因基因pSC101的的Tetr 基因?；?。（2）長度）長度4363bp（3）選擇標(biāo)記）選擇標(biāo)記氨芐青霉素和四環(huán)素抗性。氨芐青霉素和四環(huán)素抗性。（4）克隆位點(diǎn)）克隆位點(diǎn)其中其中9個會導(dǎo)致個會導(dǎo)致Tetr基因失活（如基因失活（如BamH I、Hind 、Sal I）；）；3個會導(dǎo)致個會導(dǎo)致Ampr基因失活（基因失活（Sca I、PvuI、Pst I）。）。24個克隆位點(diǎn)。個克隆位點(diǎn)。（5）p

17、BR322的優(yōu)點(diǎn)的優(yōu)點(diǎn) 雙抗菌素抗性選擇標(biāo)記雙抗菌素抗性選擇標(biāo)記插入失活，分兩次先后選擇：插入失活，分兩次先后選擇：沒有獲得載體的寄主細(xì)胞沒有獲得載體的寄主細(xì)胞在在Amp或或Tet中中都都死亡。死亡。獲得載體的寄主細(xì)胞獲得載體的寄主細(xì)胞在在Amp或或Tet其中之一其中之一中死亡。中死亡。外源基因外源基因BamH IAmp中存活中存活但在但在Tet中死亡中死亡外源基因外源基因Pst ITet中存活中存活但在但在Amp中死亡中死亡氯霉素?cái)U(kuò)增之后，每個細(xì)胞可達(dá)氯霉素?cái)U(kuò)增之后，每個細(xì)胞可達(dá)10003000copy 安全安全失去了轉(zhuǎn)移蛋白基因失去了轉(zhuǎn)移蛋白基因mob（mobilization）。）。不能

18、通過接合轉(zhuǎn)移。不能通過接合轉(zhuǎn)移。 高拷貝數(shù)高拷貝數(shù) 分子小，克隆能力大分子小，克隆能力大載體越小越好。載體越小越好。10kb的的DNA在純化過程中容易斷裂。在純化過程中容易斷裂。保留了轉(zhuǎn)移蛋白（保留了轉(zhuǎn)移蛋白（mob）的）的作用位點(diǎn)作用位點(diǎn)。（6）pBR322的缺點(diǎn)的缺點(diǎn)能夠被能夠被ColK質(zhì)粒編碼的質(zhì)粒編碼的mob蛋白識別，蛋白識別，如果再有如果再有F質(zhì)粒的參與，就有可能轉(zhuǎn)移！質(zhì)粒的參與，就有可能轉(zhuǎn)移！ 刪除刪除mobmob識別位點(diǎn)識別位點(diǎn)（如質(zhì)粒（如質(zhì)粒pBR327、pAT153等）。等）。pAT153：從從pBR322上切去上切去HaeII片斷，既除片斷，既除去了去了mob識別位點(diǎn)，又增

19、加質(zhì)粒的識別位點(diǎn)，又增加質(zhì)粒的拷貝數(shù)。拷貝數(shù)。（7）pBR322的改進(jìn)的改進(jìn)pBR325：在在pBR322位點(diǎn)上接入一段來自噬菌位點(diǎn)上接入一段來自噬菌體體PICm的的HaeII酶切片斷（帶有氯霉酶切片斷（帶有氯霉素抗性基因素抗性基因cmlr）。）。cmlr上也帶一個上也帶一個EcoRI位點(diǎn)位點(diǎn)。使使EcoRI 也成為插入失活型位點(diǎn)。也成為插入失活型位點(diǎn)。 改造改造EcoR I 位點(diǎn)位點(diǎn)4. pUC系列系列University of California的的J. Messing和和J. Vieria于于1978年，在年，在pBR322的基礎(chǔ)上改的基礎(chǔ)上改造而成。屬正選擇載體。造而成。屬正選擇載體

20、。pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19 復(fù)制起點(diǎn)復(fù)制起點(diǎn)pBR322的的 ori但其上失去了克隆位點(diǎn)。但其上失去了克隆位點(diǎn)。 Ampr 基因基因（1）元件來源）元件來源 lacZ的啟動子的啟動子大腸桿菌大腸桿菌 lacZ基因基因大腸桿菌大腸桿菌lacZ的的 -肽鏈序列，肽鏈序列， 是是LacZ 的氨基端片斷。的氨基端片斷。pBR322的的Ampr基因基因（2）長度）長度約約2.7kb（3）克隆位點(diǎn)）克隆位點(diǎn)10個連續(xù)的單一限制酶切位個連續(xù)的單一限制酶切位點(diǎn)，位于點(diǎn)，位于lacZ基因的基因的5端。端。pUC18/19Ampicillin 抗性抗性和和 la

21、cZ的的 肽互補(bǔ)肽互補(bǔ)（藍(lán)白（藍(lán)白斑）相結(jié)合。斑）相結(jié)合。（4）選擇標(biāo)記）選擇標(biāo)記藍(lán)白斑選擇原理：藍(lán)白斑選擇原理： Xgal（5-Bromo-4-chloro-3-indolyl- -D-galactoside） -半乳糖苷酶半乳糖苷酶能把無色的化合物能把無色的化合物Xgal分解成半乳糖和一個分解成半乳糖和一個深藍(lán)色深藍(lán)色的的物質(zhì)物質(zhì)5-溴溴-4-氯靛藍(lán)。氯靛藍(lán)。Xgal半乳糖半乳糖5-溴溴-4-氯靛藍(lán)氯靛藍(lán) -半乳糖苷酶半乳糖苷酶 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶Xgal顯色反應(yīng)：顯色反應(yīng)： lacZ的的 肽互補(bǔ)肽互補(bǔ)1） -肽（肽（ lacZ ）：）： -半乳糖苷酶半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片斷端的

22、一段氨基酸片斷（11-41氨基酸）。氨基酸）。lacZ只有在只有在4 4聚體的狀態(tài)下才有功能聚體的狀態(tài)下才有功能. .C端大部分端大部分N端的端的11-41aaC端大部分端大部分N端的端的11-41aaC端大部分端大部分N端的端的11-41aaC端大部分端大部分N端的端的11-41aa4聚體聚體2）受體菌）受體菌lacZ突變（突變（lacZM15）受體菌基因組的受體菌基因組的 -半乳糖苷酶基因的半乳糖苷酶基因的氨基端有缺失（缺失氨基端有缺失（缺失 肽），不能形成肽），不能形成4聚體的活性酶，不能分解聚體的活性酶，不能分解Xgal 受體菌株：受體菌株：JM系列系列、TG1、TG2、XL1-blu

23、e、XS127、XS101、KK2186、MV1184、DH5apUC質(zhì)粒載體上的質(zhì)粒載體上的lacZ 編碼編碼 肽與這個肽與這個缺失突變的缺失突變的 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶“互補(bǔ)互補(bǔ)”，使，使它能形成它能形成4聚體。又能分解聚體。又能分解Xgal。產(chǎn)生。產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)。藍(lán)色物質(zhì)。C端大部分端大部分N端的端的11-41aapUC lacZ受體菌受體菌lacZ3）載體）載體lacZ與與 互補(bǔ)互補(bǔ)4） 互補(bǔ)的插入失活互補(bǔ)的插入失活pUC載體上載體上LacZ的的5端有一段多克隆位端有一段多克隆位點(diǎn)點(diǎn)(MCS)區(qū)，本身雖不干擾區(qū)，本身雖不干擾LacZ的合的合成，但插入外源基因就會阻止成，但插入外源基因就

24、會阻止LacZ的的合成。不能互補(bǔ)。合成。不能互補(bǔ)。 lacZ53 肽移碼突變肽移碼突變lacZ53 肽肽不互補(bǔ)不互補(bǔ)互補(bǔ)互補(bǔ)MCS外源外源DNA IPTG的誘導(dǎo)作用的誘導(dǎo)作用IPTG是乳糖的類似物。能誘導(dǎo)是乳糖的類似物。能誘導(dǎo)lac操操縱子的啟動轉(zhuǎn)錄，使受體菌基因組中縱子的啟動轉(zhuǎn)錄，使受體菌基因組中的的lacZ 的的C端部分端部分和載體的和載體的lacZ 肽肽都表達(dá)。從而互補(bǔ)。都表達(dá)。從而互補(bǔ)。但載體但載體MCSMCS上插入外源上插入外源DNADNA后，仍然后，仍然不能產(chǎn)生不能產(chǎn)生 肽！肽！IPTG通過看培養(yǎng)皿上的菌斑的顏色就能直接知道通過看培養(yǎng)皿上的菌斑的顏色就能直接知道是否有是否有DNAD

25、NA插入。插入。MCS無插入時，互補(bǔ)，藍(lán)菌斑。無插入時，互補(bǔ)，藍(lán)菌斑。MCS有插入時，不互補(bǔ)，白菌斑。有插入時，不互補(bǔ)，白菌斑。IPTG誘導(dǎo)的結(jié)果：誘導(dǎo)的結(jié)果：無質(zhì)粒的無質(zhì)粒的受體菌受體菌 - -半乳糖苷酶半乳糖苷酶部分缺失，不部分缺失，不能分解能分解XgalXgal；無抗菌素抗性無抗菌素抗性在含抗菌素在含抗菌素和和XgalXgal的培的培養(yǎng)基上培養(yǎng)養(yǎng)基上培養(yǎng)無菌斑無菌斑生長生長質(zhì)粒轉(zhuǎn)化質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的受體菌的受體菌 - -半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的缺失被載體產(chǎn)物缺失被載體產(chǎn)物 互補(bǔ)，能分解互補(bǔ)，能分解XgalXgal。且有抗菌。且有抗菌素抗性素抗性在含抗菌素在含抗菌素和和XgalXgal的培的培養(yǎng)基

26、上培養(yǎng)養(yǎng)基上培養(yǎng)有藍(lán)色有藍(lán)色菌斑生菌斑生長長帶外源帶外源DNADNA插插入的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的受體菌的受體菌載體產(chǎn)物失活，載體產(chǎn)物失活，不能互補(bǔ)不能互補(bǔ) - -半半乳糖苷酶的缺乳糖苷酶的缺失。不能分解失。不能分解XgalXgal，但有抗，但有抗菌素抗性菌素抗性在含抗菌素在含抗菌素和和XgalXgal的培的培養(yǎng)基上培養(yǎng)養(yǎng)基上培養(yǎng)有白色有白色菌斑生菌斑生長長（5）pUC系列載體的優(yōu)點(diǎn)系列載體的優(yōu)點(diǎn) 更小的分子量：更小的分子量：如如pUC18為為2682bp，pUC8為為2750bp。 選擇方便選擇方便Xgal顯色、抗菌素雙重直接選擇。顯色、抗菌素雙重直接選擇。 克隆便利克隆便利具有多克隆位點(diǎn)（

27、具有多克隆位點(diǎn)（MCS），使有兩個不），使有兩個不同粘性末端的外源同粘性末端的外源DNA方便地插入。方便地插入。 測序方便測序方便pUC的的MCS與與M13噬菌體載體的噬菌體載體的MCS完完全相同，便于把外源全相同，便于把外源DNA轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)移到M13載載體上測序。體上測序。M13mp18的多克隆位點(diǎn)的多克隆位點(diǎn)11六、其它質(zhì)粒載體六、其它質(zhì)粒載體1. pGEM-3Z由由pUC派生而來。派生而來。與與pUC的主要區(qū)別是在的主要區(qū)別是在MCS的兩側(cè)分別的兩側(cè)分別加了一個噬菌體加了一個噬菌體啟動子啟動子T7和和SP6。T7啟動子啟動子SP6啟動子啟動子MCSlacZAmprori可被可被T7和和SP

28、6的的RNA聚合酶識別轉(zhuǎn)錄。聚合酶識別轉(zhuǎn)錄。 如果加入純化的如果加入純化的T7或或SP6 RNA聚合酶，聚合酶，在試管里就可以轉(zhuǎn)錄在試管里就可以轉(zhuǎn)錄mRNA 外源基因正接反接都可以轉(zhuǎn)錄。外源基因正接反接都可以轉(zhuǎn)錄。 MCS與與pUC18的完全一樣。的完全一樣。2. pGEM-4Z：與與pGEM-3Z相同，只是相同，只是T7啟動子和啟動子和SP6啟動子的啟動子的位置互換位置互換。（1 1）pGEM-3Z的特點(diǎn)：的特點(diǎn)：3. 穿梭質(zhì)粒載體穿梭質(zhì)粒載體（1 1）穿梭質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu)）穿梭質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu)人工構(gòu)建的、具有兩種不同復(fù)制起人工構(gòu)建的、具有兩種不同復(fù)制起點(diǎn)和選擇標(biāo)記、可以在兩種不同的點(diǎn)和選擇標(biāo)記

29、、可以在兩種不同的寄主細(xì)胞中存活和復(fù)制的質(zhì)粒載體。寄主細(xì)胞中存活和復(fù)制的質(zhì)粒載體。Yeast復(fù)制起點(diǎn)復(fù)制起點(diǎn)E.coli復(fù)制起點(diǎn)復(fù)制起點(diǎn)E.coli選擇標(biāo)記選擇標(biāo)記Yeast選擇標(biāo)記選擇標(biāo)記MCS大腸桿菌大腸桿菌枯草桿菌穿梭載體枯草桿菌穿梭載體大腸桿菌大腸桿菌釀酒酵母穿梭載體釀酒酵母穿梭載體大腸桿菌大腸桿菌動物細(xì)胞穿梭載體動物細(xì)胞穿梭載體（2 2）常用的穿梭質(zhì)粒載體）常用的穿梭質(zhì)粒載體（3 3）穿梭載體的優(yōu)點(diǎn)）穿梭載體的優(yōu)點(diǎn) 也能利用其它細(xì)胞系統(tǒng)（酵母、枯草桿也能利用其它細(xì)胞系統(tǒng)（酵母、枯草桿菌、哺乳動物細(xì)胞等）進(jìn)行基因表達(dá)。菌、哺乳動物細(xì)胞等）進(jìn)行基因表達(dá)。 可以自如地在兩種不同寄主細(xì)胞之可

30、以自如地在兩種不同寄主細(xì)胞之間來回轉(zhuǎn)移基因。間來回轉(zhuǎn)移基因。克隆、構(gòu)建克隆、構(gòu)建表達(dá)表達(dá)E.coliAnimal cell 利用大腸桿菌進(jìn)行基因克隆、表達(dá)利用大腸桿菌進(jìn)行基因克隆、表達(dá)七、質(zhì)粒載體的不穩(wěn)定性七、質(zhì)粒載體的不穩(wěn)定性1. 質(zhì)粒穩(wěn)定遺傳必須的兩個條件：質(zhì)粒穩(wěn)定遺傳必須的兩個條件：（1）每個世代、每個質(zhì)粒至少要復(fù)制一次）每個世代、每個質(zhì)粒至少要復(fù)制一次（2）在細(xì)胞分裂時，復(fù)制過的質(zhì)粒必須分）在細(xì)胞分裂時，復(fù)制過的質(zhì)粒必須分 配到兩個子細(xì)胞中。配到兩個子細(xì)胞中。有主動分配和隨機(jī)分配兩種假說。有主動分配和隨機(jī)分配兩種假說。（1）主動分配）主動分配天然質(zhì)粒。天然質(zhì)粒。2. 質(zhì)粒分配方式質(zhì)粒分

31、配方式具有一個控制質(zhì)?？截惙峙涞墓δ軈^(qū)具有一個控制質(zhì)?？截惙峙涞墓δ軈^(qū)（Par），能以主動分配的方式確保質(zhì)），能以主動分配的方式確保質(zhì)粒能正確分配到兩個子細(xì)胞中。粒能正確分配到兩個子細(xì)胞中。人工構(gòu)建的質(zhì)粒載體人工構(gòu)建的質(zhì)粒載體缺失了缺失了par區(qū)區(qū)，只，只能以隨機(jī)分配方式分到子細(xì)胞中。能以隨機(jī)分配方式分到子細(xì)胞中。人工質(zhì)粒。人工質(zhì)粒。（一般情況下也能保證質(zhì)粒的穩(wěn)定遺傳）（一般情況下也能保證質(zhì)粒的穩(wěn)定遺傳）（2）隨機(jī)分配）隨機(jī)分配但在一定條件下會出現(xiàn)質(zhì)粒丟失的現(xiàn)象。但在一定條件下會出現(xiàn)質(zhì)粒丟失的現(xiàn)象。在寄主菌細(xì)胞分裂的過程中，有一個細(xì)在寄主菌細(xì)胞分裂的過程中，有一個細(xì)胞沒有獲得質(zhì)?？截?，并最終繁

32、殖成無胞沒有獲得質(zhì)?？截悾⒆罱K繁殖成無質(zhì)粒的優(yōu)勢群體。質(zhì)粒的優(yōu)勢群體。3. 分離的不穩(wěn)定性分離的不穩(wěn)定性（segregation instability）4. 結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性（structural instability）寄主基因組的寄主基因組的IS序列插入質(zhì)粒、質(zhì)粒序列插入質(zhì)粒、質(zhì)粒間的同源重組等都會使質(zhì)粒發(fā)生插入間的同源重組等都會使質(zhì)粒發(fā)生插入或缺失?；蛉笔?。ISdimer重組重組（1）新陳代謝負(fù)荷：）新陳代謝負(fù)荷：5. 影響質(zhì)粒載體穩(wěn)定性的主要因素影響質(zhì)粒載體穩(wěn)定性的主要因素使寄主細(xì)胞生長減緩：使寄主細(xì)胞生長減緩：質(zhì)粒載體使寄主的世代時間延長約質(zhì)粒載體使寄主的世代時間延長

33、約15%。 復(fù)制負(fù)荷復(fù)制負(fù)荷減緩的程度與質(zhì)粒的分子量成正比。減緩的程度與質(zhì)粒的分子量成正比。 轉(zhuǎn)錄和翻譯負(fù)荷轉(zhuǎn)錄和翻譯負(fù)荷丟失質(zhì)粒的細(xì)胞反而會成為優(yōu)勢群體！丟失質(zhì)粒的細(xì)胞反而會成為優(yōu)勢群體！每個菌體中所擁有的質(zhì)粒拷貝數(shù)不完每個菌體中所擁有的質(zhì)?？截悢?shù)不完全相同，稱差度。全相同，稱差度。（2）質(zhì)粒載體的拷貝數(shù)）質(zhì)粒載體的拷貝數(shù)低拷貝數(shù)的質(zhì)粒的差度小，遺傳穩(wěn)定。低拷貝數(shù)的質(zhì)粒的差度小，遺傳穩(wěn)定。差度（差度（variance）：）：是產(chǎn)生無質(zhì)粒細(xì)胞的重要原因。是產(chǎn)生無質(zhì)粒細(xì)胞的重要原因。高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體差度大，擁有少量拷高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體差度大，擁有少量拷貝數(shù)的菌體多，發(fā)生丟失的可能性大。貝數(shù)的菌

34、體多，發(fā)生丟失的可能性大。野生型野生型E.coli中，質(zhì)粒在寄主的中，質(zhì)粒在寄主的重組酶重組酶作作用下會發(fā)生重組形成用下會發(fā)生重組形成二聚體質(zhì)粒二聚體質(zhì)粒。（3）寄主菌的重組體系）寄主菌的重組體系二聚體災(zāi)難（二聚體災(zāi)難（dimer catastrophe）：）：含有大分子量插入片斷的質(zhì)粒載體普遍含有大分子量插入片斷的質(zhì)粒載體普遍能形成質(zhì)粒寡聚體。能形成質(zhì)粒寡聚體。二聚體質(zhì)粒的復(fù)制速度是單體的二倍！二聚體質(zhì)粒的復(fù)制速度是單體的二倍！導(dǎo)致質(zhì)粒失控。導(dǎo)致質(zhì)粒失控。八、常用宿主菌八、常用宿主菌 ： 宿主菌株不僅是質(zhì)粒制備過程中不純物的主要來源，也宿主菌株不僅是質(zhì)粒制備過程中不純物的主要來源，也是影響質(zhì)

35、粒是影響質(zhì)粒DNA的質(zhì)量的重要因素，因此，選擇合適的宿主的質(zhì)量的重要因素，因此，選擇合適的宿主菌株可以減少最后純化的工作量，例如，避免使用高產(chǎn)碳水菌株可以減少最后純化的工作量，例如，避免使用高產(chǎn)碳水化合物的菌株和選用低產(chǎn)核酸酶的菌株化合物的菌株和選用低產(chǎn)核酸酶的菌株(end-)，質(zhì)粒加工過程，質(zhì)粒加工過程中的穩(wěn)定性就會大大增加。中的穩(wěn)定性就會大大增加。Urthaler等用相同的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化等用相同的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化兩種菌株兩種菌株JM108和和DH5a，培養(yǎng)提取質(zhì)粒，培養(yǎng)提取質(zhì)粒DNA后，比較發(fā)現(xiàn)從后，比較發(fā)現(xiàn)從菌株菌株JM108中提出的質(zhì)粒多而且結(jié)構(gòu)均一，明顯優(yōu)于從菌株中提出的質(zhì)粒多而且結(jié)構(gòu)均一

36、，明顯優(yōu)于從菌株DH5a中得到的質(zhì)粒。中得到的質(zhì)粒。 表達(dá)載體對宿主菌的要求更嚴(yán)格。表達(dá)載體對宿主菌的要求更嚴(yán)格。 常用的宿主菌：常用的宿主菌：DH5 、DH10b、JM101109、HB101和和C600 。 菌株特點(diǎn)：菌株特點(diǎn)：rec+發(fā)生缺失，發(fā)生缺失，LacZ基因缺失?；蛉笔?。九、轉(zhuǎn)化子與重組子的篩選方法九、轉(zhuǎn)化子與重組子的篩選方法轉(zhuǎn)化子：轉(zhuǎn)化后在含抗生素的平板上長出的菌落即為轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)化子：轉(zhuǎn)化后在含抗生素的平板上長出的菌落即為轉(zhuǎn)化子 重組子：含有插入片段的轉(zhuǎn)化子重組子：含有插入片段的轉(zhuǎn)化子1、插入失活：抗性基因中有適當(dāng)分布的酶切位點(diǎn)，當(dāng)外源、插入失活：抗性基因中有適當(dāng)分布的酶切位點(diǎn)

37、，當(dāng)外源DNA插入，抗藥性基因即被破壞。插入，抗藥性基因即被破壞。2、-互補(bǔ)（互補(bǔ)（-complementation）：）： 載體中帶有載體中帶有E.coli lac操縱子的調(diào)節(jié)序列和編碼操縱子的調(diào)節(jié)序列和編碼 半乳糖苷半乳糖苷酶酶N-末端末端146個氨基酸的序列（個氨基酸的序列（-半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的-肽段，多克隆肽段，多克隆區(qū)域位于區(qū)域位于 此區(qū)域此區(qū)域 ），并受），并受IPTG（Isopropyl -D-1-thiogalactopyranoside，也稱，也稱Isopropyl -D-thiogalactoside，中，中文名為異丙基文名為異丙基-D-硫代半乳糖苷）誘導(dǎo)合成。宿主帶

38、有硫代半乳糖苷）誘導(dǎo)合成。宿主帶有l(wèi)ac其它其它部分序列（部分序列（-半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的-肽段）；載體與宿主編碼的片段肽段）；載體與宿主編碼的片段本身沒有活性，但它們互相協(xié)助可在本身沒有活性，但它們互相協(xié)助可在E.coli內(nèi)形成一個具有酶活內(nèi)形成一個具有酶活性的蛋白質(zhì)，故性的蛋白質(zhì)，故IPTG和和X-gal（X-Gal也稱也稱5-Bromo-4-chloro-3-indolyl -D-galactopyranoside或或5-Bromo-4-chloro-3-indolyl -D-galactoside， 中文中文名為名為5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚吲哚-D-半乳半乳糖苷糖苷）培養(yǎng)）培養(yǎng)

39、基上形成蘭色菌落；當(dāng)多克隆位點(diǎn)中插入外源基上形成蘭色菌落；當(dāng)多克隆位點(diǎn)中插入外源DNA， 半乳糖半乳糖苷酶苷酶N端失活，菌落紅色。端失活，菌落紅色。 lacZ 基因是乳糖基因是乳糖 lac 操縱子中編碼操縱子中編碼 -半乳糖苷酶的基因，半乳糖苷酶的基因，乳糖及其衍生物可誘導(dǎo)其表達(dá)。乳糖及其衍生物可誘導(dǎo)其表達(dá)。 乳糖既是乳糖既是 lac 操縱子的誘導(dǎo)物，操縱子的誘導(dǎo)物，也是作用的底物。異丙基也是作用的底物。異丙基-D- 硫代半乳糖苷（硫代半乳糖苷（IPTG）是乳糖）是乳糖的衍生物，可作為的衍生物，可作為 lac 操縱子的誘導(dǎo)物，但不能作為反應(yīng)的底操縱子的誘導(dǎo)物，但不能作為反應(yīng)的底物；物； 5-溴

40、溴-4-氯氯-3-吲哚吲哚-D-半乳糖苷（半乳糖苷（X-gal） 可作為可作為 lac 操縱操縱子的底物，但不能作為誘導(dǎo)物。底物子的底物，但不能作為誘導(dǎo)物。底物 X-gal 還可充作生色劑，還可充作生色劑，被被 -半乳糖苷酶分解后可產(chǎn)生蘭色產(chǎn)物，可使菌落或噬菌斑呈半乳糖苷酶分解后可產(chǎn)生蘭色產(chǎn)物，可使菌落或噬菌斑呈蘭色。蘭色。3、正選擇：、正選擇：正向選擇標(biāo)記，表達(dá)一種使某些宿主菌致死的基因產(chǎn)物，而正向選擇標(biāo)記，表達(dá)一種使某些宿主菌致死的基因產(chǎn)物，而含有外源基因片段插入后，該基因便失活。如蔗糖致死基因含有外源基因片段插入后，該基因便失活。如蔗糖致死基因 SacB ，來自淀粉水解芽胞桿菌，來自淀粉

41、水解芽胞桿菌 （Bacillus amyloliquefaciens） ，編碼果聚糖蔗糖酶。在含蔗糖的培養(yǎng)基，編碼果聚糖蔗糖酶。在含蔗糖的培養(yǎng)基上上 sacB 基因的表達(dá)對大腸桿菌來說是致死的，因此該基因可基因的表達(dá)對大腸桿菌來說是致死的，因此該基因可用于插入失活篩選重組子。用于插入失活篩選重組子。4、快速鑒定：菌體、快速鑒定：菌體PCR 菌體裂解直接電泳菌體裂解直接電泳5、抽提質(zhì)粒、酶切電泳檢測、抽提質(zhì)粒、酶切電泳檢測 6、雜交篩選（大量篩選用）、雜交篩選（大量篩選用） 菌落原位雜交菌落原位雜交7、表達(dá)篩選、表達(dá)篩選 單克隆抗體，免疫反應(yīng)單克隆抗體，免疫反應(yīng)十、質(zhì)粒載體的優(yōu)缺點(diǎn)十、質(zhì)粒載體的

42、優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：1、大量抽提操作簡單，轉(zhuǎn)化、大量抽提操作簡單，轉(zhuǎn)化 E.coli容易，重復(fù)性高。容易，重復(fù)性高。2、用途廣：轉(zhuǎn)錄、測序、亞克隆、表達(dá)等、用途廣：轉(zhuǎn)錄、測序、亞克隆、表達(dá)等 缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：1、容量小，插入片段小于、容量小，插入片段小于10kb(15kb)，插入片段過大，導(dǎo)致，插入片段過大，導(dǎo)致重組子擴(kuò)增速度慢，甚至使插入片段丟失。重組子擴(kuò)增速度慢，甚至使插入片段丟失。 2、大量篩選篩選困難。、大量篩選篩選困難。3、氯化鈣法轉(zhuǎn)化效率相對較低、氯化鈣法轉(zhuǎn)化效率相對較低 十一、質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化十一、質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化1、感受態(tài)細(xì)胞的概念、感受態(tài)細(xì)胞的概念 所謂的感受態(tài)，即指受體（或者宿主）最易接受外

43、源所謂的感受態(tài)，即指受體（或者宿主）最易接受外源DNA片段并實(shí)現(xiàn)其轉(zhuǎn)化的一種生理狀態(tài)，它是由受體菌的遺傳性狀片段并實(shí)現(xiàn)其轉(zhuǎn)化的一種生理狀態(tài)，它是由受體菌的遺傳性狀所決定的，同時也受菌齡、外界環(huán)境因子的影響。所決定的，同時也受菌齡、外界環(huán)境因子的影響。 cAMP可以使感受態(tài)水平提高一萬倍，而可以使感受態(tài)水平提高一萬倍，而Ca2+也可大大促也可大大促進(jìn)轉(zhuǎn)化的作用。細(xì)胞的感受態(tài)一般出現(xiàn)在對數(shù)生長期，新鮮幼進(jìn)轉(zhuǎn)化的作用。細(xì)胞的感受態(tài)一般出現(xiàn)在對數(shù)生長期，新鮮幼嫩的細(xì)胞是制備感受態(tài)細(xì)胞和進(jìn)行成功轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵。嫩的細(xì)胞是制備感受態(tài)細(xì)胞和進(jìn)行成功轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵。 制備出的感受態(tài)細(xì)胞暫時不用時，可加入占總體積制備出

44、的感受態(tài)細(xì)胞暫時不用時，可加入占總體積15%的的無菌甘油或無菌甘油或-70保存（有效期保存（有效期6個月）。個月）。 2、轉(zhuǎn)化的概念及原理、轉(zhuǎn)化的概念及原理 ： 在基因克隆技術(shù)中，轉(zhuǎn)化特指將質(zhì)粒在基因克隆技術(shù)中，轉(zhuǎn)化特指將質(zhì)粒DNA或以其為載體構(gòu)或以其為載體構(gòu)建的重組建的重組DNA導(dǎo)入細(xì)菌體內(nèi)，使之獲得新的遺傳特性的一種方導(dǎo)入細(xì)菌體內(nèi)，使之獲得新的遺傳特性的一種方法。它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領(lǐng)域的基本法。它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領(lǐng)域的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)之一。實(shí)驗(yàn)技術(shù)之一。 受體細(xì)胞經(jīng)過一些特殊方法（如：電擊法，受體細(xì)胞經(jīng)過一些特殊方法（如：電擊法，CaCl2等化學(xué)等化

45、學(xué)試劑法）處理后，使細(xì)胞膜的通透性發(fā)生變化，成為能容許外試劑法）處理后，使細(xì)胞膜的通透性發(fā)生變化，成為能容許外源源DNA分子通過的感受態(tài)細(xì)胞。進(jìn)入細(xì)胞的分子通過的感受態(tài)細(xì)胞。進(jìn)入細(xì)胞的DNA分子通過復(fù)制、分子通過復(fù)制、表達(dá)實(shí)現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移，使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。表達(dá)實(shí)現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移，使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。 大腸桿菌的轉(zhuǎn)化常用化學(xué)法（大腸桿菌的轉(zhuǎn)化常用化學(xué)法（CaCl2法），該法最先是由法），該法最先是由Cohen于于1972年發(fā)現(xiàn)的。其原理是細(xì)菌處于年發(fā)現(xiàn)的。其原理是細(xì)菌處于0，CaCl2的低滲的低滲溶液中，菌細(xì)胞膨脹成球形，轉(zhuǎn)化混合物中的溶液中，菌細(xì)胞膨脹成球形，轉(zhuǎn)化混合物中

46、的DNA形成抗形成抗DNase的羥基的羥基-鈣磷酸復(fù)合物粘附于細(xì)胞表面，經(jīng)鈣磷酸復(fù)合物粘附于細(xì)胞表面，經(jīng)42短時間熱短時間熱沖擊處理，促使細(xì)胞吸收沖擊處理，促使細(xì)胞吸收DNA復(fù)合物，在豐富培養(yǎng)基上生長數(shù)復(fù)合物，在豐富培養(yǎng)基上生長數(shù)小時后，球狀細(xì)胞復(fù)原并分裂增值，被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌中，重組子小時后，球狀細(xì)胞復(fù)原并分裂增值，被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌中，重組子中基因得到表達(dá)，在選擇性培養(yǎng)基平板上，可選出所需的轉(zhuǎn)化中基因得到表達(dá)，在選擇性培養(yǎng)基平板上，可選出所需的轉(zhuǎn)化子。子。 Ca2+處理的感受態(tài)細(xì)胞，其轉(zhuǎn)化率一般能達(dá)到處理的感受態(tài)細(xì)胞，其轉(zhuǎn)化率一般能達(dá)到51062107轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)化子/ug質(zhì)粒質(zhì)粒DNA，可以滿足一般的

47、基因克隆，可以滿足一般的基因克隆試驗(yàn)。如在試驗(yàn)。如在Ca2+的基礎(chǔ)上，聯(lián)合其它的二價金屬離子（如的基礎(chǔ)上，聯(lián)合其它的二價金屬離子（如Mn2+、Co2+）、）、DMSO或還原劑等物質(zhì)處理細(xì)菌，則可使轉(zhuǎn)或還原劑等物質(zhì)處理細(xì)菌，則可使轉(zhuǎn)化率提高化率提高1001000倍。倍。 化學(xué)法簡單、快速、穩(wěn)定、重復(fù)性好，菌株適用范圍廣，化學(xué)法簡單、快速、穩(wěn)定、重復(fù)性好，菌株適用范圍廣，感受態(tài)細(xì)菌可以在感受態(tài)細(xì)菌可以在-70保存，因此被廣泛用于外源基因的轉(zhuǎn)保存，因此被廣泛用于外源基因的轉(zhuǎn)化?；?除化學(xué)法轉(zhuǎn)化細(xì)菌外，還有電擊轉(zhuǎn)化法，電擊法不需要預(yù)先除化學(xué)法轉(zhuǎn)化細(xì)菌外，還有電擊轉(zhuǎn)化法，電擊法不需要預(yù)先誘導(dǎo)細(xì)菌的感受

48、態(tài)，依靠短暫的電擊，促使誘導(dǎo)細(xì)菌的感受態(tài)，依靠短暫的電擊，促使DNA進(jìn)入細(xì)菌，轉(zhuǎn)化進(jìn)入細(xì)菌，轉(zhuǎn)化率最高能達(dá)到率最高能達(dá)到1091010轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)化子/ug閉環(huán)閉環(huán)DNA。因操作簡便，愈來愈。因操作簡便，愈來愈為人們所接受。為人們所接受。 原理是以高電壓原理是以高電壓(數(shù)千伏數(shù)千伏 )在很短時間在很短時間(微秒時間微秒時間)內(nèi)脈沖電擊內(nèi)脈沖電擊細(xì)菌細(xì)胞，使細(xì)胞膜產(chǎn)生許多小孔，質(zhì)粒細(xì)菌細(xì)胞，使細(xì)胞膜產(chǎn)生許多小孔，質(zhì)粒DNA通過這些小通過這些小 孔進(jìn)入孔進(jìn)入菌體而轉(zhuǎn)化。針對不同的菌株，需要優(yōu)化各種參數(shù)，包括電場強(qiáng)菌體而轉(zhuǎn)化。針對不同的菌株，需要優(yōu)化各種參數(shù)，包括電場強(qiáng)度、脈沖長度、脈沖度、脈沖長度、脈

49、沖 次數(shù)、電極與樣品的距離以及細(xì)菌和次數(shù)、電極與樣品的距離以及細(xì)菌和DNA濃濃度等。更高的電壓、更長的脈沖時間雖然能提度等。更高的電壓、更長的脈沖時間雖然能提 高轉(zhuǎn)化率，但細(xì)菌高轉(zhuǎn)化率，但細(xì)菌的存活率降低。的存活率降低。 電穿孔法操作簡單，制備用于電穿孔的細(xì)菌比制備感受態(tài)電穿孔法操作簡單，制備用于電穿孔的細(xì)菌比制備感受態(tài) 菌容易。細(xì)菌生長到對數(shù)中期后加以冷卻，離心，然后用低菌容易。細(xì)菌生長到對數(shù)中期后加以冷卻，離心，然后用低鹽緩沖液充分清洗以降低細(xì)菌懸鹽緩沖液充分清洗以降低細(xì)菌懸 液的離子強(qiáng)度液的離子強(qiáng)度,但不必形成原但不必形成原生質(zhì)體。然后用生質(zhì)體。然后用10%甘油重懸細(xì)菌，使其濃度為甘油重

50、懸細(xì)菌，使其濃度為31010細(xì)菌細(xì)菌ml，在干冰上速凍后置，在干冰上速凍后置貯存。這樣，每小份細(xì)菌貯存。這樣，每小份細(xì)菌融解后即可用于轉(zhuǎn)化，融解后即可用于轉(zhuǎn)化， 其有效期至少為其有效期至少為6個月。電穿孔在低溫個月。電穿孔在低溫下下(04)進(jìn)行，如果在室溫下操作，轉(zhuǎn)化效率可能進(jìn)行，如果在室溫下操作，轉(zhuǎn)化效率可能 會降低百會降低百倍。倍。 3、感受態(tài)細(xì)胞制備及轉(zhuǎn)化中的影響因素：、感受態(tài)細(xì)胞制備及轉(zhuǎn)化中的影響因素： 、細(xì)胞的生長狀態(tài)和密度、細(xì)胞的生長狀態(tài)和密度 最好從最好從-70或或-20甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細(xì)胞的菌液。不要用已經(jīng)過多次轉(zhuǎn)接，及貯存

51、在感受態(tài)細(xì)胞的菌液。不要用已經(jīng)過多次轉(zhuǎn)接，及貯存在4的培的培養(yǎng)菌液。細(xì)胞生長密度以每毫升培養(yǎng)液中的細(xì)胞數(shù)在養(yǎng)菌液。細(xì)胞生長密度以每毫升培養(yǎng)液中的細(xì)胞數(shù)在5107個個左右為佳。即應(yīng)用對數(shù)期或?qū)?shù)生長前期的細(xì)菌，可通過測定左右為佳。即應(yīng)用對數(shù)期或?qū)?shù)生長前期的細(xì)菌，可通過測定培養(yǎng)液的培養(yǎng)液的OD600控制。控制。 （應(yīng)注意（應(yīng)注意OD600值與細(xì)胞數(shù)之間的關(guān)系值與細(xì)胞數(shù)之間的關(guān)系隨菌株的不同而不同）。密度過高或不足均會使轉(zhuǎn)化率下降。隨菌株的不同而不同）。密度過高或不足均會使轉(zhuǎn)化率下降。 此外，受體細(xì)胞一般應(yīng)是限制此外，受體細(xì)胞一般應(yīng)是限制-修飾系統(tǒng)缺陷的突變株，即修飾系統(tǒng)缺陷的突變株，即不含限制性

52、內(nèi)切酶和甲基化酶的突變株。并且受體細(xì)胞還應(yīng)與不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變株。并且受體細(xì)胞還應(yīng)與所轉(zhuǎn)化的載體性質(zhì)相匹配。所轉(zhuǎn)化的載體性質(zhì)相匹配。、質(zhì)粒、質(zhì)粒DNA的質(zhì)量和濃度的質(zhì)量和濃度 用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA應(yīng)主要是超螺旋態(tài)的，轉(zhuǎn)化率與外源應(yīng)主要是超螺旋態(tài)的，轉(zhuǎn)化率與外源DNA的濃度在一定范圍內(nèi)成正比，但當(dāng)加入的外源的濃度在一定范圍內(nèi)成正比，但當(dāng)加入的外源DNA的量過的量過多或體積過大時，則會使轉(zhuǎn)化率下降。一般地，多或體積過大時，則會使轉(zhuǎn)化率下降。一般地，DNA溶液的體溶液的體積不應(yīng)超過感受態(tài)細(xì)胞體積的積不應(yīng)超過感受態(tài)細(xì)胞體積的5%，1ng的的cccDNA即可使即可使50ul的

53、的感受態(tài)細(xì)胞達(dá)到飽和。感受態(tài)細(xì)胞達(dá)到飽和。 對于以質(zhì)粒為載體的重組分子而言，分子量大的轉(zhuǎn)化效率對于以質(zhì)粒為載體的重組分子而言，分子量大的轉(zhuǎn)化效率低，實(shí)驗(yàn)證明，大于低，實(shí)驗(yàn)證明，大于30kb的重組質(zhì)粒將很難進(jìn)行轉(zhuǎn)化。此外，的重組質(zhì)粒將很難進(jìn)行轉(zhuǎn)化。此外，重組重組DNA分子的構(gòu)型與轉(zhuǎn)化效率也密切相關(guān)，環(huán)狀重組質(zhì)粒的分子的構(gòu)型與轉(zhuǎn)化效率也密切相關(guān)，環(huán)狀重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化率較分子量相同的線性重組質(zhì)粒高轉(zhuǎn)化率較分子量相同的線性重組質(zhì)粒高10100倍，因此重組倍，因此重組DNA大都構(gòu)成環(huán)狀雙螺旋分子。大都構(gòu)成環(huán)狀雙螺旋分子。、試劑的質(zhì)量、試劑的質(zhì)量所用的所用的CaCl2等試劑均需是最高純度的，并用最純凈的水配

54、制，等試劑均需是最高純度的，并用最純凈的水配制，最好分裝保存于最好分裝保存于4。、防止雜菌和雜、防止雜菌和雜DNA的污染的污染整個操作過程均應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行，所用器皿，如離心管，整個操作過程均應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行，所用器皿，如離心管，移液槍頭等最好是新的，并經(jīng)高壓滅菌處理。所有的試劑都要移液槍頭等最好是新的，并經(jīng)高壓滅菌處理。所有的試劑都要滅菌，且注意防止被其它試劑、滅菌，且注意防止被其它試劑、DNA酶或雜酶或雜DNA所污染，否則所污染，否則均會影響轉(zhuǎn)化效率或雜均會影響轉(zhuǎn)化效率或雜DNA的轉(zhuǎn)入。的轉(zhuǎn)入。、整個操作均需在冰上進(jìn)行，不能離開冰浴，、整個操作均需在冰上進(jìn)行，不能離開冰浴，否則細(xì)胞轉(zhuǎn)化

55、率將會降低。否則細(xì)胞轉(zhuǎn)化率將會降低。 第二節(jié)第二節(jié) 噬菌體載體噬菌體載體 噬菌體是一類細(xì)菌病毒（噬菌體是一類細(xì)菌病毒（Bacteriophage）。）。一、噬菌體的一般特性一、噬菌體的一般特性結(jié)構(gòu)：結(jié)構(gòu)：蛋白質(zhì)外殼內(nèi)包裹蛋白質(zhì)外殼內(nèi)包裹著著DNA（雙鏈、單（雙鏈、單鏈、線性、環(huán)狀鏈、線性、環(huán)狀等）。等）。single linear DNA (about 182,000 bp)T2 Genomic DNAT4 Bacteriophage分為兩種：分為兩種：1. 溶菌周期：溶菌周期：二、噬菌體的生活周期二、噬菌體的生活周期感染細(xì)菌后立即在菌體內(nèi)復(fù)制和合成蛋感染細(xì)菌后立即在菌體內(nèi)復(fù)制和合成蛋白質(zhì)外殼

56、，重新組裝成噬菌體顆粒，并白質(zhì)外殼，重新組裝成噬菌體顆粒，并導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞解體，釋放出大量子代噬導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞解體，釋放出大量子代噬菌體。菌體。烈性噬菌體（烈性噬菌體（virulent phage)2. 溶原周期：溶原周期：感染細(xì)菌后，將自己的感染細(xì)菌后，將自己的DNA整合到細(xì)菌整合到細(xì)菌的染色體的染色體DNA中。形成這一過程稱為溶中。形成這一過程稱為溶源化（源化（lysogenization)。整合到細(xì)菌染色體的噬菌體整合到細(xì)菌染色體的噬菌體DNA稱為稱為原原噬菌體噬菌體，隨細(xì)菌的染色體復(fù)制而復(fù)制。，隨細(xì)菌的染色體復(fù)制而復(fù)制。溫和噬菌體（溫和噬菌體（temperate phage)原噬菌體（原噬

57、菌體（prophage)：三、單鏈?zhǔn)删w載體三、單鏈?zhǔn)删w載體單鏈環(huán)狀單鏈環(huán)狀DNA的絲狀大腸桿菌噬菌體：的絲狀大腸桿菌噬菌體：（2）復(fù)制型（）復(fù)制型（RF）是雙鏈環(huán)狀）是雙鏈環(huán)狀DNA。1. 單鏈單鏈DNA噬菌體的特點(diǎn)噬菌體的特點(diǎn)（3）RF DNA和和ssDNA都能轉(zhuǎn)染感受態(tài)都能轉(zhuǎn)染感受態(tài) 大腸桿菌。并產(chǎn)生噬菌斑。大腸桿菌。并產(chǎn)生噬菌斑。（5）可產(chǎn)生大量的含有外源）可產(chǎn)生大量的含有外源DNA插入片插入片 斷的斷的單鏈分子單鏈分子，便于作探針或測序。，便于作探針或測序。（1）+DNA。（。（ssDNA）（4）不存在包裝限制。）不存在包裝限制。2. M13 噬菌體噬菌體RF dsDNA在寄主細(xì)胞

58、內(nèi)以高拷貝形式在寄主細(xì)胞內(nèi)以高拷貝形式存在。存在。成熟的噬菌體里只包裝有成熟的噬菌體里只包裝有 + DNA，也，也容易提取。容易提取。M13噬菌體只感染噬菌體只感染雄性雄性大腸桿菌。大腸桿菌。但但M13 DNA可以轉(zhuǎn)染雌性大腸桿菌?？梢赞D(zhuǎn)染雌性大腸桿菌。6407 bp。（2）DNA長度長度（3）DNA提純提純（1）寄主）寄主M13序序列列（4）M13的生活周期的生活周期雖然不導(dǎo)致溶菌，但使菌斑混濁（細(xì)菌生雖然不導(dǎo)致溶菌，但使菌斑混濁（細(xì)菌生長變慢，約為正常的長變慢，約為正常的1/21/23/43/4）M13通過雄性細(xì)菌的通過雄性細(xì)菌的F性須性須注入其注入其+DNA+DNA合成合成DNA，形成，

59、形成RF dsDNADNA轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄mRNA、合成、合成+DNA、翻譯形、翻譯形成噬菌體蛋白成噬菌體蛋白組裝成新的噬菌體組裝成新的噬菌體M13，擠出寄主細(xì)胞擠出寄主細(xì)胞+DNA-DNAmRNAM13外殼蛋白外殼蛋白組裝成子代組裝成子代M13+DNA注入大腸桿菌注入大腸桿菌復(fù)制復(fù)制轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄翻譯翻譯+DNA指導(dǎo)合成指導(dǎo)合成+DNA200個個 RF DNA每個細(xì)胞可以放出約每個細(xì)胞可以放出約10001000個個M13M13顆粒！顆粒！M13的包裝過程：的包裝過程：RF dsDNA指導(dǎo)合指導(dǎo)合成的成的+DNAM13基因基因V編碼單編碼單鏈鏈DNA結(jié)合蛋白結(jié)合蛋白DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物蛋白質(zhì)復(fù)合物轉(zhuǎn)移到寄主

60、的細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移到寄主的細(xì)胞膜M13外殼蛋白外殼蛋白基因基因V蛋白脫落蛋白脫落+DNA溢出細(xì)胞膜溢出細(xì)胞膜包裝包裝（5）沒有包裝限制）沒有包裝限制3. M13載體的構(gòu)建：載體的構(gòu)建：M13基因組中只有基因基因組中只有基因II與基因與基因IV之間之間存在一段存在一段507bp的基因間隔區(qū)。的基因間隔區(qū)。（1）克隆區(qū)域的選定）克隆區(qū)域的選定 基因間隔區(qū)（基因間隔區(qū)（intergenic region, IG區(qū)）區(qū)）IG區(qū)內(nèi)只有一個區(qū)內(nèi)只有一個 BsuI 切點(diǎn)。切點(diǎn)。其余其余9個個BsuI限制性位點(diǎn)分布在其它部位。限制性位點(diǎn)分布在其它部位。 酶切位點(diǎn)酶切位點(diǎn)M13J. Messing證明，證明，IG區(qū)存