His-Tag表達(dá)蛋白純化原理

1、His-Tag表達(dá)蛋白純化原理組氨酸標(biāo)簽蛋白的純化His-Tag融合蛋白是目前最常見的表達(dá)方式，而且很成熟，它的優(yōu)點(diǎn)是表達(dá)方便而且基本不影響蛋白的活性，無論是表達(dá)的蛋白是可溶性的或者包涵體都可以用固定金屬離子親和色譜去(IMAC)純化。2.1IMAC(ImmobilizedMetal-ionaffinitychromatography)是Porathetal.1975年用固定IDA作為配基的填料螫合過渡金屬銅、銀、鉆或鋅離子，可以吸附純化表面帶組氨酸、色氨酸或半胱氨酸殘基的蛋白，1987年Smithetal.發(fā)現(xiàn)帶有幾個組氨酸或色氨酸小肽和螫合金屬離子的IDA-sephadexG-25作用力更

2、強(qiáng)，此前在1986年他和他的合作者用Ni2+-IDA-sephadexG-25親和純化在氨基端帶組氨酸和色氨酸的胰島素原。同年1987年Hochulietal.發(fā)現(xiàn)帶有相連組氨酸的多肽和Ni2+-NTA填料作用力更強(qiáng)于普通的肽,1988年他第一次用這樣的方法純化了帶六個組氨酸標(biāo)簽的多肽，無論是在天然還是變性條件下一次親和純化都得到很好效果，此后表達(dá)帶六個組氨酸標(biāo)簽的蛋白配合IMAC變得非常普遍，相對而言，不帶標(biāo)簽的蛋白純化就非常困難，所以表達(dá)帶六個組氨酸標(biāo)簽的蛋白配合IMAC純化變成最常用而且最有效的研究蛋白結(jié)構(gòu)和功能的有力手段。1986年P(guān)orathetal.還發(fā)現(xiàn)Fe3+-IDA-seph

3、adexG-25可以用于磷酸化蛋白的純化，而后發(fā)現(xiàn)Ga3+-IDA也有同樣的效果，這樣螫合這兩種金屬離子的填料就有效用于磷酸化多肽的富集和純化，同時IMAC也可以用于純化各種和金屬離子結(jié)合的多肽，應(yīng)用非常廣泛。市面常見的商品化IMAC用于帶六個組氨酸標(biāo)簽蛋白的配基有以下幾種：2.2影響IMAC純化結(jié)果的因素：2.2.1 填料的種類：不同填料廠家的填料有差別，所以使用過程最好能得到廠家的技術(shù)支持，因?yàn)椴煌膹S家填料不同，此外蛋白純化個性很強(qiáng)，沒有哪一個填料是能適合所有帶六個組氨酸標(biāo)簽蛋白的純化，載量高和特異性好本身就是矛盾。2.2.2 填料的配基種類、密度、金屬離子種類填料最簡單的判斷是螫合好同

4、樣的金屬離子，哪家產(chǎn)品的顏色越深就意味著和蛋白的作用力越強(qiáng)，適用范圍越廣，載量也越高，純化的好壞關(guān)鍵看純化的條件，僅有填料的特異性是不夠的，同樣配基密度下IDA填料的親和力要比NTA的強(qiáng)，所以NTA上不能吸附的樣品可以選擇IDA為配基的填料。螫合金屬離子和蛋白作用強(qiáng)弱為銅和銀離子的強(qiáng)，而鋅和鉆離子的弱。因此如果一個蛋白作用力強(qiáng)，想得到好的特異性可以選擇螫合鈉離子，它還有一個優(yōu)點(diǎn)是不怕還原劑，特別時候有高濃度的還原劑。相同金屬離子，IDA的強(qiáng)于NTA。螫合金屬離子的價位越低和蛋白的作用力越強(qiáng)。同時鎂離子是最常用的，如果有條件可以換不同金屬離子以得到更好的效果，因?yàn)椴煌慕饘匐x子有不同的選擇性。因

5、此要希望填料應(yīng)用范圍廣就選擇銀瓊脂糖凝膠，如果是希望特異性好而且穩(wěn)定就選擇鎮(zhèn)NTA瓊脂糖凝膠.2.2.2蛋白本身的結(jié)構(gòu)和樣品來源IMAC原理已經(jīng)說明只要是帶組氨酸、色氨酸或半胱氨酸殘基的蛋白都可以被吸附，所以要想得到好的純化效果，必須選擇好純化的條件，通常帶組氨酸蛋白都可以在天然情況下被銀瓊脂糖凝膠或銀NTA瓊脂糖凝膠吸附，但是如果標(biāo)簽折疊在蛋白內(nèi)部不容易暴露，這樣就難純化，如果銀瓊脂糖凝膠都不能吸附，可以在樣品和平衡緩沖液中加1-2M月尿，這樣蛋白結(jié)構(gòu)相對松散，也許能吸附而蛋白不會變性，對于本身就是變性的蛋白如果8M月尿不能吸附，改用6M鹽酸服溶解樣品就可以被吸附，因?yàn)辂}酸服可以打開月尿打不

6、開的結(jié)構(gòu)使得標(biāo)簽?zāi)鼙┞?。?dāng)然如果有二硫鍵最好加1-2mMDTT也可以更好解決吸附的問題。此外也可以把標(biāo)簽換到另外一端。2.2.3 緩沖體系，pH及鹽濃度對于一些作用力弱的蛋白不能選擇帶氮原子的的一些緩沖體系，如Tris-HCl等，適當(dāng)提高緩沖液pH可以增加吸附效果，同樣原理可以降低pH洗脫一些咪嚏洗不去的雜帶。為避免由于電荷作用的干擾，平衡緩沖液中需要加0.1-1M氯化鈉，而在平衡緩沖液添加00.1-0.5%吐溫或者triton可以降低由于疏水相互作用導(dǎo)致的非特異吸附。2.2.4 表面活性劑及其他添加劑添加一些表面活性劑可以增加蛋白的溶解度，降低疏水相互作用，這樣使純化的結(jié)果更好，在實(shí)驗(yàn)表明在

7、平衡緩沖液中加0.5-1%的吐溫可以使電泳的背景更清晰，雜帶減少。對一些難溶解的樣品也可以加乙醇或者甘油。在變性條件下有時會在樣品中添加還原劑如航基乙醇或者二疏基蘇木糖醇，它們?nèi)绻麧舛冗^高或者上樣量過大，會導(dǎo)致銀離子還原甚至脫落，使填料失效，如果要在這樣的環(huán)境下，那最好選擇螫合價位高的填料如鎮(zhèn)NTA瓊脂糖凝膠或降低還原劑的濃度，通常1-2mM是沒問題的。如果一定要選擇高濃度的還原劑，也可以把銀離子還成鉆離子，它不怕還原，把普通的銀瓊脂糖凝膠還成鉆離子即可。以下是破碎及提取、純化操作和常見問題解決方法：破碎方法樣品的處理對純化是很重要的，重要的原則是破碎要溫和,不能使蛋白斷裂或者降解，否則一些片

8、段同樣也帶有標(biāo)簽，這樣增加了純化的難度。需要注意的問題是超聲破碎溫度，強(qiáng)度，時間大腸桿菌的破碎方法：1）收集培養(yǎng)發(fā)醉液，4度7000-8000g離心10分鐘，收集沉淀的菌體（如果不是馬上破碎可以放-70度冷凍，但是最好能保存成小塊或者薄片，這樣好用。）2）取1-2克菌體加10ml破碎緩沖液（pH7.4的50mM磷酸緩沖液含0.5MNaCl,0.5mg/ml溶菌酶，1mMPMSF,1mMMgCl2,1.7units/mlBenzonase,其中的菌酶，1mMPMSF,1.7units/mlBenzonase現(xiàn)加）在冰上混合45分鐘，如果pH不在7-8,需要用0.5MNaOH一邊攪拌一邊滴加.如果

9、溶菌酶10mg/ml混合時間可以縮短到10分鐘.3）把混合菌體在冰水中用超聲探頭破碎20秒種，總共四次,中間間隔要保持2分鐘冷卻破碎液，檢測pH,如果不在7-8,還是用0.5MNaOH一邊攪拌一邊滴加去調(diào).如果菌體的為50-500克，可以高壓破碎的方法，緩沖液同上，體積為1升，破碎三次，壓力為800bar.4）破碎的液4度12000g離心10分鐘，如果要讓溶液更澄清，可以4度50000g離心30分鐘，這時候可以把上清和沉淀分別留樣，跑電泳，如果只沉淀中有目標(biāo)蛋白，那就用變性條件下去提取。5）破碎離心的上清加2M咪嚏溶液0.12ml使終濃度為20mM,樣品的總體積為10ml。過柱子的樣品最好過0

10、.45以m的濾膜，避免堵柱。2 .可溶性蛋白的純化1）平衡緩沖液：pH7.4的50mM磷酸緩沖液含0.5MNaCl,含20mM咪嚏。2）洗脫緩沖液：pH7.4的50mM磷酸緩沖液含0.5MNaCl,含500mM咪嚏。3）取1ml銀瓊脂糖凝膠FF或鎮(zhèn)NTA瓊脂糖凝膠FF預(yù)裝柱，用10ml平衡緩沖液平衡，然后取破碎上清10ml樣品以0.5ml/min上樣，然后2ml/管分管收集。4）用15ml平衡緩沖液洗去未吸附的樣品，流速1-2ml/min,2ml/管收集。5）用5ml洗脫緩沖液洗去未吸附的樣品，流速1-2ml/min,2ml/管收集。6）再用5ml平衡緩沖液平衡柱子，灌滿20%乙醇，封閉，以備

11、下次使用。7）此方法是通用的方法，但是未必能得到適合自己蛋白的滿意效果，所以優(yōu)化的辦法是洗脫可以用50mM,100mM,300mM,500mM分階段洗脫，各洗脫5個柱體積，這樣配合電泳檢測，得到適合自己的蛋白的條件。8）收集的部分可以用紫外分光光度法、BCA法或用考瑪斯亮藍(lán)法測定蛋白的濃度，再取有蛋白的部分電泳檢測純度O.常見問題及解決方法1）蛋白不溶解或沉淀在柱子上：要留意緩沖液體的pH,此外在樣品中添加一些表面活性劑甚至乙醇等有機(jī)溶劑可以增加疏水性蛋白的溶解度，避免沉淀。2）蛋白不吸附：這是最常見的，通常的原因有1是標(biāo)簽不暴露，被折疊在蛋白的結(jié)構(gòu)內(nèi)，可以在變性的條件下去純化，2可以選擇作用

12、力更強(qiáng)，配基密度更高的填料，通常銀瓊脂糖凝膠作用力最強(qiáng)，如果蛋白分子量大可以選擇手臂長的填料，如銀NTA瓊脂糖凝膠，填料的好壞可以看填料的顏色，顏色越深那配基密度越高，作用力也相應(yīng)要強(qiáng)。3樣品的pH過低或者沉淀導(dǎo)致不能吸附，所以樣品和緩沖液的pH要盡量一致，避免沉淀，通常再偏堿性條件下吸附更好。3）難洗脫：如果穿透中目標(biāo)蛋白明顯減少，而洗脫又沒有，取點(diǎn)填料加電泳緩沖液煮后離心跑電泳還是有目標(biāo)蛋白，可以用更強(qiáng)的洗脫條件如500mM咪嚏，如果還不能洗脫，可以直接用500mM咪嚏加到6M鹽酸月瓜去洗脫。4)電泳雜帶多：因?yàn)檫@種親和畢竟特異性要差點(diǎn)，原因在蛋白中帶組氨酸，色氨酸，半胱氨酸等很常見，特別

13、是蛋白折疊會導(dǎo)致幾個這樣的氨基酸殘基臨近，這樣也會使它們和銀柱的作用力增加，因此可以用不同濃度的咪嚏階段洗脫，此外在咪嚏洗脫前增加一步0.5MpH5的醋酸緩沖液洗脫，在平衡緩沖液中添加0.5%吐溫或Triton可以避免因?yàn)槭杷嗷プ饔脤?dǎo)致非特異吸附，這樣可以電泳的雜帶明顯減少，但是如果用這樣的方法還是雜帶多，那就地回頭去看看破碎的條件是不是太劇烈或者溫度控制不好導(dǎo)致蛋白短裂或者分解導(dǎo)致一些蛋白片段帶標(biāo)簽，或者因?yàn)闃悠烽L時間保存導(dǎo)致水解等，總之純化的好壞決定于每一個步驟，不僅僅是純化的問題。還有一個不容忽略的問題是有時候因?yàn)榈鞍紫嗷プ饔没蛘咭驗(yàn)樾纬删酆象w導(dǎo)致雜帶增加，而由于疏水相互作用或者因?yàn)殡x

14、子作用可以通過添加表面活性劑或者增加離子強(qiáng)度得到改善，對于因?yàn)樾纬删酆象w的可以在緩沖液和樣品中加1-2mM航基乙醇避免，如果這樣的情況下最好是選擇銀NTA瓊脂糖凝膠，因?yàn)樗谶€原劑下更穩(wěn)定。包涵體蛋白的純化及復(fù)性包涵體破碎1、大腸桿菌的破碎方法：1）收集培養(yǎng)發(fā)醉液，4度7000-8000g離心10分鐘，收集沉淀的菌體（如果不是馬上破碎可以放-70度冷凍，但是最好能保存成小塊或者薄片，這樣好用。2 ）取1-2克菌體加10ml破碎緩沖液（pH8.550mMTris-HCl,2mMEDTA,100mMNaCl,0.5%TritonX-100,1mg/ml溶菌酶。）在冰上混合45分鐘。3 ）把混合菌體

15、在冰水中用超聲探頭破碎20秒種，總共四次,中間間隔要保持2分鐘冷卻破碎液，檢測pH,如果不在8.5，還是用1MTris溶液一邊攪拌一邊滴加去調(diào).如果菌體的為50-500克，可以高壓破碎的方法，緩沖液同上，體積為1升，破碎三次，壓力為800bar.4）破碎的液4度12000g離心10分鐘，如果要讓溶液更澄清，可以4度50000g離心30分鐘，這時候可以把上清和沉淀分別留樣，跑電泳，如果只沉淀中有目標(biāo)蛋白，那就用變性條件下去提取。5）破碎離心的沉淀用4M清洗包涵體，再離心得沉淀加（pH7.4的50mM磷酸緩沖液含0.5MNaCl,8M月尿，20mM咪口坐）。過柱子的樣品最好過0.45以m的濾膜，避

16、免堵柱。4.包涵體蛋白的純化1）平衡緩沖液：pH7.4的50mM磷酸緩沖液含0.5MNaCl,8M月尿，20mM咪嚏。2）洗脫緩沖液：pH7.4的50mM磷酸緩沖液含0.5MNaCl,8M月尿，含500mM咪嚏。3）取1ml銀瓊脂糖凝膠FF或鎮(zhèn)NTA瓊脂糖凝膠FF預(yù)裝柱，用10ml平衡緩沖液平衡，然后取破碎上清10ml樣品以0.5ml/min上樣，然后2ml/管分管收集。4）用15ml平衡緩沖液洗去未吸附的樣品，流速1-2ml/min,2ml/管收集。5）用5ml洗脫緩沖液洗去未吸附的樣品，流速1-2ml/min,2ml/管收集。6）再用5ml平衡緩沖液平衡柱子，灌滿20%乙醇，封閉，以備下次

17、使用。7）此方法是通用的方法，但是未必能得到適合自己蛋白的滿意效果，所以優(yōu)化的辦法是洗脫可以用50mM,100mM,300mM,500mM分階段洗脫，各洗脫5個柱體積，這樣配合電泳檢測，得到適合自己的蛋白的條件。8）收集的部分可以用紫外分光光度法、BCA法或用考瑪斯亮藍(lán)法測定蛋白的濃度，再取有蛋白的部分電泳檢測純度。9）其問題和解決方法可以參考可溶性蛋白的純化的相關(guān)內(nèi)容。復(fù)性十分復(fù)雜，所以建議參考文獻(xiàn)和一些專門的論述。常見問題及解決方法1）不溶解或沉淀在柱子上：要留意緩沖液體的pH,此外在樣品中添加一些表面活性劑甚至乙醇等有機(jī)溶劑可以增加疏水性蛋白的溶解度，對于帶半胱氨酸多的蛋白很容易氧化聚集

18、沉淀，所以需要加2-5mM航基乙醇避免沉淀。2）白不吸附：這是最常見的，通常的原因有1是標(biāo)簽不暴露，被折疊在蛋白的結(jié)構(gòu)內(nèi)，可以在變性的條件下去純化，如果用月尿變性吸附不好，可以改用鹽酸服，個人經(jīng)驗(yàn)是這樣通常可以使吸附不上的蛋白得到改善，順利純化。2可以選擇作用力更強(qiáng)，配基密度更高的填料，通常銀瓊脂糖凝膠作用力最強(qiáng)，如果蛋白分子量大可以選擇手臂長的填料，如銀NTA瓊脂糖凝膠，填料的好壞可以看填料的顏色，顏色越深那配基密度越高，作用力也相應(yīng)要強(qiáng)。3樣品的pH過低或者沉淀導(dǎo)致不能吸附，所以樣品和緩沖液的pH要盡量一致，避免沉淀，通常再偏堿性條件下吸附更好。3）難洗脫：如果穿透中目標(biāo)蛋白明顯減少，而洗脫又沒有，取點(diǎn)填料加電泳緩沖液煮后離心跑電泳還是有目標(biāo)蛋白，可以用更強(qiáng)的洗脫條件如500mM咪嚏，如果還不能洗脫，可以直接用500mM咪嚏加到6M鹽酸月瓜去洗脫。4)電泳雜帶多：因?yàn)檫@種親和畢竟特異性要差點(diǎn)，原因在蛋白中帶組氨酸，色氨酸，半胱氨酸等很常見，特別是蛋白折疊會導(dǎo)致幾個這樣的氨基酸殘基臨近，這樣也會使它們和銀柱的作用力增加，因此可以用不同濃度的咪嚏階段洗脫，此外在咪嚏洗脫前增加一步0.5MpH5的醋酸緩沖液洗脫，在平衡緩沖液中添加0.5%吐溫或