BCA蛋白濃度測定試劑盒

1、BCA蛋白濃度測定試劑盒說明23225蛋白質(zhì)化驗試劑盒：為500試管或5000微孔板的檢測提供充足的試劑23227蛋白質(zhì)化驗試劑盒：為250試管或2500微孔板的檢測提供充足的試劑試劑盒組分：BCA試劑A,1000mL（No.23225產(chǎn)品中）或500mL（No.23227產(chǎn)品中），碳酸鈉，碳酸氫鈉，二唾咻甲酸，酒石酸鈉溶于0.1M氫氧化鈉中。BCA試劑B,25mL,包括4%硫酸銅一次性標(biāo)準白蛋白，2mg/mL,10x1mL安甑，包含2mg/mL牛血清白蛋白（BSA）存在于0.9%鹽和0.05%疊氮化鈉中。儲存：以上試劑保持在室溫下儲存和裝運注意：如果試劑A或試劑B在低溫下運輸或長期儲存時出現(xiàn)

2、沉淀現(xiàn)象，可以通過緩慢加溫或輕輕攪拌溶液使沉淀物溶解。當(dāng)試劑變色或確定微生物污染時請丟球試劑盒。目錄介紹.1準備標(biāo)準試劑和工作試劑.2準備試管.3準備微型版.3故障檢修.4有關(guān)美國熱電其他產(chǎn)品.5附加信息.5參考文獻.6介紹美國熱電（Thermo）公司的BCA蛋白濃度測定試劑盒是基于二唾咻甲酸（BCA）通過比色檢測和定量測定總蛋白的洗滌劑兼容配方。該方法通過堿性介質(zhì)中的一種蛋白結(jié)合了Cu2使其顯著減少轉(zhuǎn)變?yōu)镃u1（縮二月尿反應(yīng)）。用一種含二奎琳甲酸的試劑選擇性的比色法高敏感的比色杯中的Cu1.這種測定方法的紫色色反應(yīng)產(chǎn)物是通過BCA的兩個分子和亞銅離子螯合作用形成的。這種水溶性復(fù)合物在562n

3、m處有強吸收峰。在大的活性范圍內(nèi)（20-2000gi/mL）幾乎同蛋白濃度增加呈線性關(guān)系。BCA法不是真正的終點的方法；也就是說，最終顏色繼續(xù)發(fā)展。孵化之后，繼續(xù)的顏色發(fā)展速度是足夠慢以允許一起進行測定大量樣本。大分子結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，肽鍵的數(shù)量和存在的四個特定氨基酸（半胱氨酸，胱氨酸，色氨酸和酪氨酸）據(jù)說是與BCA形成顏色產(chǎn)物的原因。因此，蛋白濃度的測量通常要參照標(biāo)準的一個常見的蛋白質(zhì)如牛血清白蛋白。一系列已知濃度的蛋白質(zhì)稀釋液是為與之相近的未知蛋白質(zhì)濃度測定準備的。因為每一個未知濃度的測定都需要基于標(biāo)準曲線。如果需要將一個未知蛋白精確定量，選擇一個與未知蛋白特性相似的標(biāo)準蛋白是可取的。例如，當(dāng)

4、測定免疫球蛋白時牛血清丙種球蛋白可以被當(dāng)做標(biāo)準蛋白。以下給出了兩種檢測過程：其中，試管程序需要一個較大的體積（0.1毫升）的蛋白質(zhì)樣品。然而，因為它使用了一個樣品比例為1:20的工作試劑（v/v）,所以將干擾物質(zhì)的影響降到最小。在酶處理程序提供了一樣品處理酶，需要體積較小（10-25L）的蛋白質(zhì)樣品。然而，由于使用了樣品比例為1:8的工作試劑（v/v）,所以在克服干擾物質(zhì)濃度時靈活性降低，從而獲得的檢測水平較低。標(biāo)準試劑和工作試劑的準備（試驗程序需要的兩個）A.準備稀釋的BSA標(biāo)準液表1為導(dǎo)向，準備一套蛋白質(zhì)標(biāo)準。稀釋標(biāo)準白內(nèi)容為，將一個盛在安甑管中的標(biāo)準BSA稀釋到幾個潔凈的瓶子中，最好使用

5、和樣本（s）相同量的稀釋劑。根據(jù)表1的建議：每1毫升的安甑管中加入2毫克/毫升的BSA標(biāo)準液對于準備一系列的標(biāo)準稀釋液是足夠的。每個稀釋標(biāo)準重復(fù)三次也是足夠量的。表一：準備稀釋的BSA標(biāo)準液標(biāo)準試管協(xié)議和微型版程序白稀釋方案（活性范圍=20-2000聞/mL）2口呂勺稀釋液體積（wDBSA來源及體積（pl）BSA終濃度（WI/mL）A0300的原液2000B125375的原液1500C325325的原液1000D175175的B管稀釋液750E325325的C管稀釋液500F325325的E管稀釋液250G325325的F管稀釋液125H400100的G管稀釋液25I40000=空白加強試管協(xié)

6、議的稀釋方案（活性范圍=5-250聞/mL）B:準備BCA的工作試劑（WR2口呂勺稀釋液體積（wDBSA來源及體積（pl）BSA終濃度（WI/mL）A700100的原液250B400400的A管稀釋液125C450300的B管稀釋液50D400400的C管稀釋液25E400100的D管稀釋液5F40000=空白.總共需要的WR的體積可以通過以下公式計算出來：（標(biāo)準液+未知液）X（平行數(shù)目）X（每個樣品中加入的WR體積）=總共所需的WR體積例如：標(biāo)準的試管程序有三個未知液，每個樣品做兩組重復(fù)：（標(biāo)準液9mL+未知液3mL）X（平行數(shù)目2）X（2mL）=總共所需的WR體積48mL注意：試管程序中每

7、個樣品管加2.0mlWR微型版程序中每個樣品中只需要加200ulWR2、WR的制備：（BCA試劑A:B=50:1）,對上述樣品，將50mL試劑A與1mL試劑B混合。注意：當(dāng)試劑B加入到試劑A的開始，濁度觀察表明：混合后迅速消失變成澄清的綠色的WR儲存在處于室溫（RT）的密WR。準備充足的WR是基骨二所測樣品數(shù)量上的。如果將閉容器中，那么幾天之內(nèi)WR是穩(wěn)定的。簡要步驟（試管程序，標(biāo)準方案）試管程序（樣品：WR=1:20）1、用移液管移取每個標(biāo)準品和所測樣品的重復(fù)0.1ml到有標(biāo)簽的對應(yīng)試管中。1 、在每個管中加2.0ml的WR,混勻。3、封口，然后溫育試管（選擇時間和溫度）1）標(biāo)準方案：37C3

8、0min（workingrange=20-2000ug/ml）2） RT方案：RT2h（workingrange=20-2000ug/ml）EnhancedProtocol（加強方案）：60c30min（workingrange=5-250ug/ml）注意：每個實驗中都增加培育時間和溫度，增加562nm的凈吸光度，降低試劑的最低檢測水平和方案的工作范圍；使用水浴加熱管要么是標(biāo)準（37。C培養(yǎng)）或是增強（60。C培養(yǎng)）協(xié)議。使用強制的培養(yǎng)可能會因為熱傳遞不均勻使其在顏色變化上引進明顯的誤差。4、使所有管子冷卻至室溫5、分光光度計設(shè)定在562nm,當(dāng)比色皿中裝的是水時給儀器校零。隨后，確保在10m

9、in內(nèi)測完所有樣品的吸光度。注意：因為BCA測定不是真正的終點，即使冷卻到室溫顏色還會繼續(xù)變化。然而，由于在室溫下顏色變化速度比較慢，所以如果在10min內(nèi)測完所有試管的吸光度就不會引進明顯的誤差。6、所有的單個標(biāo)準品與所測的樣品重復(fù)在562nm測得的吸光度都要減去在562nm測得的所有空白標(biāo)準品的吸光度平均值。working微型板程序（樣品：WR=1:8）1、用移液管移取25ul的WR到每一個標(biāo)準品與未知樣品所在的微型板中（range=20-2000ug/ml）注意：如果樣品大小被限制為：每個未知樣品和標(biāo)準品只能使用10ul（sampletoWRratio=1:20）.然而，被測量的work

10、ingrange在這種情況下將被限制為125-2000ug/ml。2、每個孔中加200ul的WR,用plateshaker混30s,使其徹底混勻3、封口，溫育37C30min4、 冷卻到室溫5、用酶標(biāo)儀測量在562nm或接近562nm的讀數(shù)注意：1）這種方法中波長在540-590nm的范圍內(nèi)都能被成功的測量2）因為讀板器使用的光線長度比分光光度計的比色皿要短，所以微型板程序需要使用樣品比例比較大的工作試劑去獲得與標(biāo)準試管程序相同的靈敏度。如果需要高于562nm的測量，要將培養(yǎng)時間增加到2h.3）增加培養(yǎng)時間或樣品工作試劑的體積比率，增加每個well在562nm的凈測量值，降低實際的最低測量水平

11、和測量的workingrange。只要每個標(biāo)準樣與未知樣都被同等對待，這樣的修改也是有益的。6、所有的單個標(biāo)準品與所測的樣品重復(fù)在562nm測得的吸光度都要減去在562nm測得的所有空白標(biāo)準品的吸光度平均值。7、準備一個標(biāo)準曲線通過繪制每一個標(biāo)準BSA在562nm測量的相對于空白對照的吸光度平均值。它ug/ml的濃度。使用標(biāo)曲去測量每一個未知樣品的蛋白質(zhì)濃度。注意：如果聯(lián)系微型板讀數(shù)器使用擬合的曲線算法，一個有四個參數(shù)的或最合適的曲線將提供比純線性狀態(tài)更精確的結(jié)果。如果用手繪制這個結(jié)果，一個點-分曲線將比線性更加適合標(biāo)準點。A:干擾物質(zhì)問題可能原因解決方案在任何管中都無顏色樣品包含銅螯合劑透析

12、，脫鹽，或稀釋樣品。增加工作試劑中銅濃度（例如，使用，試劑A:B50:2）使用的產(chǎn)品23215從樣品去除干擾物質(zhì)空白吸收是可以的，但是標(biāo)準和樣本比預(yù)期的顯示更少顏色強酸性或堿性緩沖液改變了工作試劑的PH透析，脫鹽，或稀釋樣品。顏色在錯誤波長下被測量確定在562nm波長下測吸光度樣品的顏色比預(yù)期的深蛋白濃度太高稀釋樣品樣品包含脂質(zhì)或脂蛋白添加以減少脂質(zhì)干擾使用的產(chǎn)品23215從樣品去除干擾物質(zhì)所有試管（包括空白）都是暗紫色緩沖液中含有還原劑透析或稀釋樣品。使用的產(chǎn)品23215從樣品去除干擾物質(zhì)緩沖液中含有航基緩沖含有生物胺（兒茶酚胺）需要在不同波長下測量顏色分光光度計或酶標(biāo)儀沒有562nm濾光器

13、從540nm到590nm顏色可以在任何波長下被測量，雖然標(biāo)準曲線的斜率和整體測量的靈敏度將減少某些物質(zhì)干擾BCA檢測是已知的，包括潛在的還原劑，螯合劑，強酸或強堿。因為他們可以干擾估算蛋白質(zhì)每分鐘濃度，作為樣品緩沖液的組份應(yīng)避免下列物質(zhì)：抗壞血酸EGTA鐵不純的蔗糖兒茶酚胺不純的甘油脂質(zhì)色氨酸肌酸酊過氧化氫蜜二糖酪氨酸半胱氨酸酰腫類苯酚磺Mt尿酸其他物質(zhì)對BCA法檢測蛋白量有較少程度的干擾。并且這些在原來的樣本中低于一定濃度只有很小的影響（可以容忍）。許多物質(zhì)的最大兼容的濃度在標(biāo)準測試管協(xié)議中被列出。表2（見說明的最后一頁）。物質(zhì)是兼容與標(biāo)準測試管協(xié)議中指定的濃度，如果蛋白濃度的估計的誤差是由

14、物質(zhì)的存在所造成將會小于或等于10%。在每一個實驗之前，這些物質(zhì)都會用現(xiàn)配的WR進行測試?？瞻仔Ｕ脑?62nm的吸光度測量值（1000dg/mL白蛋白標(biāo)準品+物質(zhì)）將會同0.9%生理鹽水中精確配制的標(biāo)準品在562nm出的凈吸光度進行比較。樣品：WR為1:8（v/v）的微孔板過程中最大兼容濃度將比較低。B.消除或減少干擾物質(zhì)影響的，策略BCA蛋白含量測定中干擾物的影響可以用以下幾個方法消除或克服。通過透析或凝膠過濾去除干擾物質(zhì)。稀釋本品，直到不再有干擾。這種策略只在起始蛋白質(zhì)濃度足夠多余稀釋后仍在檢測活性范圍之內(nèi)是有效的。用丙酮酸或三氯乙酸（TCA）沉淀樣品中蛋白質(zhì)。液體包含干擾物質(zhì)將被丟棄，

15、蛋白沉淀很容易在超純水中溶解或直接用堿性BCAWR溶解。這一方案的詳細流程可從我們網(wǎng)站獲得。另外，23215號產(chǎn)品將被使用（見相關(guān)Pierce產(chǎn)品）。適當(dāng)?shù)脑黾覹R中銅的量（準備WR試劑A:B為50:2或50:3、）,這將減少銅螯合劑的干擾注意：為了最大限度的精確度，蛋白質(zhì)標(biāo)準品必須和樣品（s）同樣處理。有關(guān)美國熱電其他產(chǎn)品1504196孔板100/pkg15075試劑水庫200/pkg.1503696孑L板密封帶100/pkg.23209標(biāo)準白蛋白安甑2mg/mL10x1毫升安甑，包含牛血清白蛋白23208預(yù)稀釋的蛋白質(zhì)檢測標(biāo)準品：牛血清白蛋白集合，7X3.5mL23212牛伽瑪球蛋白標(biāo)準品

16、2mg/mL,10X1mL安甑23235微型BCA蛋白檢測試劑盒工作范圍為0.5-20g/mL23236考馬斯亮藍檢測試劑盒，工作范圍的1-1500g/mL23215Compat-Able?蛋白檢測試劑組23250BCA蛋白檢測試劑盒-兼容還原劑附加信息A.請訪問我們的網(wǎng)站了解更多的信息，包括下列事項：常見問答技術(shù)指導(dǎo)：消除樣品中干擾物質(zhì)對蛋白質(zhì)檢測的影響B(tài).替代總蛋白檢測試劑如果不能克服樣品中還原物或金屬螯合物的干擾。由一個減少物質(zhì)或metal-chelating物質(zhì)包含在，試試美國熱電公司的23236號考馬斯亮藍檢測試劑盒，它對這些物質(zhì)較不敏感。C.玻璃器皿的清潔和重利用小心謹慎使用玻璃器皿。所有的玻璃器皿必須清洗和最后的超純水沖洗。D、不同的蛋白質(zhì)的反應(yīng)特征常用的總蛋白含量測定方法某種程度上顯示了不同蛋白的不同反應(yīng)。小心謹慎使用玻璃器皿。所有的玻璃器皿必須清洗和最后的超純水沖洗。D、不同的蛋白質(zhì)的反應(yīng)特征常用的總蛋白含量測定方法某種程度上顯示