Norovirus分子生物學(xué)特征及其亞基疫苗研究進(jìn)展.docx

1、中國(guó)農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào)，2010,12(6);43-48JournalofAgriculturalScienceandTechnologyNorovirus分子生物學(xué)特征及其亞基疫苗研究進(jìn)展宋維，彭會(huì)珍，趙凌俠(上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，植物生物技術(shù)研究中心，上海200240)摘要:NorovirvsCNVs.il?如病毒)是導(dǎo)致人類非細(xì)菌性急性胃、腸炎的主要病原，該病毒可以感染各年齡段人群，全年均可爆發(fā)，特別是嬰幼兒、老年人和免疫系統(tǒng)缺陷病人屬于易感人群。目前臨床防治或控制norovirus疫情爆發(fā)的重要手段之一是使用疫苗。基于此.對(duì)norovirus發(fā)現(xiàn)、流行病學(xué)特征、分子生物學(xué)特征和noro

2、virus疫苗的研究進(jìn)展加以綜述。同時(shí)，在比較norovirus的病毒類似顆粒(virus-likeparticles,VLPs)和P粒子(Pparticles)與人組織血型抗原親合能力的基礎(chǔ)上，對(duì)利用植物系統(tǒng)特別是番茄果實(shí)生產(chǎn)適于口服norovirus的P粒子作為亞基疫苗優(yōu)勢(shì)和存在難點(diǎn)以及本實(shí)驗(yàn)室的研究進(jìn)展進(jìn)行了討論,以期為利用植物系統(tǒng)表達(dá)口服疫苗研究提供些借鑒。關(guān)鍵詞:諾如病毒;亞單位疫苗;病毒類似顆粒;P粒子doi:10.3969/j.issn.10084)864.2010.06.08中圖分類號(hào):R512.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào)：1008-0864(2010)06-0043-06Res

3、earchProgressonMolecularBiologyFeatureofNorovirusesanditsSubunitVaccineSONGWei,PENGHui-zhen,ZHAOLing-xia(AgricultureandBiologyCollege,ShanghaiJiaoTongUniversity,PlantBiotechnologyResearchCenter,Shanghai200240,China)Abstract:Noroviruses(NVs)arerecognizedastheleadingpath(阻encausingnonbacterialacutegas

4、troenteritisepidemics.NVscaninfectpeopleofallagesandbreakoutallyear-round.Infant,children,theelderlyandimmunodeGciencypeoplearemorevulnerable.Atpresent,vaccineisoneofthemosteffectivewaytoprevent(orcontrol)theoutbreakofnorovirusesdiseaseinclinic.Basedonthis,thispaperreviewedthefinding,epidemiological

5、andmolecularbiologicalfeaturesofnorovirusesandtheresearchprogressonitssubunitvaccine.Throu歐comparingtheaffinitytohumanhisto-bloodgroupantigen(HBGAs)betweenvirus-likeparticles(VLPs)andPparticlesofnoroviruses,theadvantagesanddifficultiesofproducingoralPassubunitvaccineagainstnoroviruseswasdiscussedusi

6、ngplantexpressionsystemsespeciallytomato.TheprogressontheexpressingPparticlesbytransformingtomatoinourlaboratorywasintroducedsimply,hopingtoprovidesomereferencesforproducingoralvaccinebyplantexpressionsystems.Keywords:noroviruses；subunitvaccine；virus-likeparticle；Pparticle收稿日期：2010-06-21；修回日期：2010X)

7、7-17基金項(xiàng)目：國(guó)家863計(jì)劃項(xiàng)目(2OO7AA1OO5O3)；國(guó)家轉(zhuǎn)基因重大專項(xiàng)(2008ZX08004SI)資助。作者簡(jiǎn)介:宋維，碩士研究生，研究方向植物基因工程。E-mail：pixartimeyahoo,com。通訊作者:趙凌俠，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事植物星因工程和發(fā)育生物學(xué)研究。E-mail：lxzhao1Norovirus發(fā)現(xiàn)及其流行病學(xué)特征1.1Norovirus發(fā)現(xiàn)Norovirus(NVs,諾如病毒)是1968年10-11月間美國(guó)俄亥俄州Norwalk鎮(zhèn)-所小學(xué)因突發(fā)胃腸炎而被發(fā)現(xiàn)的。直至1972年,Kapikian等通過免疫電鏡(immunoelectronmicro

8、scopy,IEM)從感染者糞便中才找到致病的病毒顆粒,最初被稱為Norwalk病毒，隨后被命名為小圓結(jié)構(gòu)病毒(smallroundstructuredviruses,SRSVs)或小圓形病毒。通過對(duì)NVs全基因組測(cè)序和比較發(fā)現(xiàn),NVs與大多數(shù)的SRSVs同源，均屬于杯狀病毒科(Caliciviridae)。杯狀病毒呈對(duì)稱的二十面體、無包膜，基因組為單股正鏈RNA。NVs僅感染人，不能體外培養(yǎng)；不過，最近發(fā)現(xiàn)了可以在小鼠樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中生K的鼠諾如病毒株心。1.2Norovirus流行病學(xué)特征NVs可以感染各年齡段人群，對(duì)嬰兒感染力僅次于輪狀病毒（Wavig,種致嬰兒或新生畜胃腸炎的病毒

9、）；幼兒、老人、免疫缺陷人群及器官移植病人狷高危易感人群;幼兒園、學(xué)校、療養(yǎng)院、醫(yī)院病房、游輪和餐館等公共場(chǎng)所屬于易爆發(fā)場(chǎng)所;一年四季均有爆發(fā)可能，冬季屬于高發(fā)期小七NVs以“糞口”途徑傳播為主，最常見感染途徑是接觸被污染的食物、水和病人：NVs也可以通過空氣傳播.患舌嘔吐物中NW以氣霧狀散開，居于此空間的人被感染幾率很高：與感染者接觸后，該病的發(fā)病率高達(dá)30%，因而容易導(dǎo)致某些密閉場(chǎng)所如游輪、療養(yǎng)院的疫情擴(kuò)大。NVs具有以下.特征使其感染率居高不F：引起感染所需病毒量少（僅需181000個(gè)病毒）；病成消亡所需時(shí)間K.即使癥狀有所緩解，患者也有被二次傳染的風(fēng)險(xiǎn)9；病毒對(duì)溫度耐受范圍廣（060Y

10、）；缺少對(duì)傳染者的隔離措施和難以獲得K期免疫，只要再次接觸病毒隨時(shí)都仃再次被感染的可能;NVs由于基因組易發(fā)生突變而不斷進(jìn)化，使抗原發(fā)生變化，使易感宿主被感染也2Norovirus分子生物學(xué)特征2.1Norovirus基因組結(jié)構(gòu)1990年,Norwalk病毒基因外被成功測(cè)序，對(duì)從分子病毒學(xué)和流行病學(xué)角度了解NVs具有重要意義:NVs基因組測(cè)序和RT-PCR分析結(jié)果表明，該病毒具有.遺傳不穩(wěn)定性和抗原多樣性的特點(diǎn)。依據(jù)RNA聚合醉區(qū)域核昔酸序列多態(tài)性.NVsMf以分為5種遺傳型，其中I型、II型和傳型可以感染人，111型和V型可以分別感染奶牛和小鼠。NVs的I型、II型和IV型又可以分別進(jìn)一步細(xì)

11、分成8個(gè)、17個(gè)和2個(gè)亞型；其中，Norwalk病毒屬于1型的1亞型”Nonvalk病毒基因組由7654個(gè)核甘酸組成.屬于正義單鏈KNA14c病毒蛋白VPg共價(jià)連接到RNA的5味端,RNA的3,末端是polyA尾；基因組RNA作為mRNA有3個(gè)開放閱讀框（openreadingframes,ORFs）;其中,ORFl編碼聚合蛋白.在蛋白酶作用卜.產(chǎn)生6種不同功能的病毒蛋白:p48、核昔三磷酸酶、p22、VPg、Pro酶和Pol（依賴于KNA的RNA聚合酶），均為病毒基因組正鏈RNA復(fù)制負(fù)義鏈RNA所必需的負(fù)鏈R、作為亞基因組復(fù)制模板,復(fù)制合成包含ORF2和ORF3亞基因組的正鏈RNA亞基因組中

12、ORF2編碼病毒主要結(jié)構(gòu)蛋白VPRORF3編碼病毒微小結(jié)構(gòu)$1-1VP2,42.2Norovirus衣殼蛋白Nonvalk病毒是Norminis的一種.其衣殼為正二f-面體，由90個(gè)衣殼蛋白分子（capsidiralprotein1,VP1）的二聚體組成。每個(gè)二聚體由、-端框架區(qū)S和C-端突出區(qū)P組成,S區(qū)和P區(qū)由8敏基酸短肽連接：s|xill裝成衣殼，參與二聚體的形成。P區(qū)乂分為P】區(qū)和P2區(qū),P1區(qū)包含大量P折疊和一個(gè)螺旋;P2區(qū)插入P1區(qū)形成6股B桶的結(jié)構(gòu)，包含高度可變的序列，位于衣殼的k面“解析Nonvalk病毒代殼蛋白.聚體X射線晶體結(jié)構(gòu)（見圖1）發(fā)現(xiàn),組織血型抗原（histo-bl

13、oodgroupantigen,HBGA）受體位點(diǎn)位于P2區(qū)（圖1中虛線部分）；因而，P2區(qū)在宿主免疫和受體反應(yīng)中擔(dān)當(dāng)者重要角色,并決定著Nonvalk病毒對(duì)人HBGA的識(shí)別，當(dāng)發(fā)生NVs感染時(shí).P2可作為抗體受體和宿主易感性因子NVs只能寄生于活的宿主細(xì)胞內(nèi)，無法在體外培養(yǎng)，不過NVs的VP1可以自聚集成VLPs（vims-VP1的二級(jí)結(jié)構(gòu)SecondarystructureofVP1d4BNTPmcji22VPrPROPOLVPg-RNA,VP1.VP2ORF2ORF3版基因組RNA(-2.8kb)Vfgpi*jvSubgcnomicRNA(-2.8kb)_L_某因組RNA(-7.7kb)

14、GenomicRNA(7.7kb)VLRsVLRsORF1ORF2ORF3圖INonsalk病毒衣殼和基因組結(jié)構(gòu))Fig.1StructureofNorwalkviruscapsidandgenome15.likeparticles）161oVPLs在形態(tài)、結(jié)構(gòu)和抗原特性方面與野生型病毒類似，目前對(duì)人類Norwalk病毒的認(rèn)識(shí)大多源于VLPs【。VLPs能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生抗血清，可以用于NVs侵染診斷;VLPs還具有高度的免疫原性，可以引起B(yǎng)細(xì)胞和T細(xì)胞反應(yīng)g;因而,VLPs作為亞單位疫苗用于防治NVs感染具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。2.3P粒子具有作為Norovirus亞基疫苗的優(yōu)勢(shì)VLPs經(jīng)胰蛋白酶處理

15、,S區(qū)可以被完全降解而P區(qū)卻保持完好無損,9：；PK蛋白經(jīng)聚合形成二聚體（Pdimer）,并進(jìn)一步聚合成P顆粒網(wǎng)。2005年,Tan等經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，P粒子是由12個(gè)P區(qū)蛋白的二聚體聚合而成,P區(qū)蛋白的二聚體和P粒子均其有與HBGA受體結(jié)合的能力。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，無S區(qū)的VLPs與HBGA受體結(jié)合能力要強(qiáng)于含有S區(qū)的VLPs（2，1o因此，基于NVs亞單位疫苗的高效性考慮,P顆粒要優(yōu)于VLPs。HBGA是人體內(nèi)一類與糖蛋白結(jié)合的碳水化合物抗原，具有作為細(xì)胞表而受體、信杪傳導(dǎo)因了或離子轉(zhuǎn)運(yùn)通道的功能。廣泛分布于人體的上皮細(xì)胞和紅細(xì)胞表面、腺上皮組織及其分泌物中，包括ABO血型系統(tǒng)（包括A、B

16、和H抗原）、Lewis血型系統(tǒng)（包括LeLebJI等抗原）和腺體3個(gè)家族，均參與NVs感染后的識(shí)別。因而，人類HBGA遺傳多樣性是導(dǎo)致NVs感染性差異的原因之一。不同NVs宙株與人HBGA的結(jié)合存在差異。2002年,Hutson等對(duì)8種NVs毒株（I型的NV、C59和VA115；II型的VA207、VA387、GrV、MxV和MOH）研究發(fā)現(xiàn),MOH不能識(shí)別Q血型的HBCA,NV不能識(shí)別B血型的HBGA,而VA387可以識(shí)別腺體和ABO血型的所有HBGAO由于VA387具有識(shí)別HBGA的廣泛性,VA387的P顆粒是作為NVs亞單位疫苗的-個(gè)較理想的候選者，有可能成為今后NVs亞基疫苗研制的重:

17、點(diǎn)。3Norovirus疫苗研究進(jìn)展3.1疫苗對(duì)norovirus的防治全球每年死亡的5700萬(wàn)人中，25%（約1500萬(wàn)）以上被認(rèn)為與傳染病有直接關(guān)系，疫苗被認(rèn)為是目前干預(yù)傳染病最有效和經(jīng)濟(jì)的手段】。在發(fā)展中國(guó)家,NVs是導(dǎo)致嚴(yán)重腹瀉的常見病原，僅次于痢疾居于第二位。據(jù)文獻(xiàn)記載，印度和秘魯兒童腹瀉分別有15%和31%是由NVs引起,全球每年約有160萬(wàn)兒童因感染NVs而死亡3】。由于NVs的高感染率和突發(fā)疫情難以控制，嚴(yán)重威脅若兒童和中老年人群的健康；目前，用NVs特別是VLPs疫苗是預(yù)防NVs傳染最有效的途徑之一。為了防止NVs大范圍傳染和流行，許多研究者最近將注意力轉(zhuǎn)向了利用基因工程手段

18、制備NVs疫苗或亞單位疫苗。3.2 Norovirus基因工程疫苗用桿狀病毒表達(dá)Norwalk病毒的VP1,所形成的VPLs在形態(tài)、結(jié)構(gòu)和抗原特性方面均與野生型病毒類似;桿狀病毒表達(dá)的VLPs（腸外、口服或鼻腔注射給藥）對(duì)小鼠均具有較高的免疫原性酵性具有快速繁殖和易于規(guī)?；囵B(yǎng)的特點(diǎn)，是目前生物制藥業(yè)廣泛使用的口服疫苗（藥用蛋白）表達(dá)系統(tǒng)網(wǎng)，小鼠通過肌肉注射或喂飼酵母源的VA387（norovirus的一個(gè)毒株）的VLPs,可以產(chǎn)生免疫應(yīng)答；未經(jīng)純化的酵母提取物即使在沒有佐劑的情況下，也可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生免疫反應(yīng)3）。昆蟲細(xì)胞也是目前藥用蛋白的重要表達(dá)系統(tǒng)之一叫，用昆蟲細(xì)胞表達(dá)重組Norualk（

19、rNVs）的VLPs,可以誘導(dǎo)小鼠體液和黏膜免疫，產(chǎn)生血清免疫蛋白IgC和腸免疫球蛋白IgAt32;口服昆蟲源的VLPs在人體內(nèi)也可以誘導(dǎo)免疫可。盡管口服酵母和昆蟲源VLPs通過人體黏膜免疫可以達(dá)到預(yù)防NVs的目的，不過從心理接受程度上仍不及植物（蔬菜或水果）源的VLPs,尤其是針對(duì)嬰幼兒;因而，最近許多研究者已開始研發(fā)包括VLPs在內(nèi)的植物口服疫苗。3.3 Norovirus植物疫苗前景植物細(xì)胞無需昂貴的發(fā)酵、純化、冷貯、運(yùn)輸和滅菌給藥，是疫苗或生物藥生產(chǎn)的理想反應(yīng)器，特別適于口服給藥：231o1990年，自從Curtis和Cardineau用轉(zhuǎn)基因煙草（NicotianatabacumL.

20、）表達(dá)變異鏈球菌（Streptococcusmutans）表面蛋白抗原A（surfaceproteinantigenA,SpaA）防治解齒的第一例植物疫苗問世以來，近20年間用植物表達(dá)抗原蛋白（疫苗）的研究已有大量報(bào)道。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì),截止目前針對(duì)艾滋?。╤umanimmunodeficiencyvirus,HIV)列、肝炎(hepatitisvi-rus)(36.ffi亂(cholera)1371、狂犬病(rabies)等44種疾病，用包括煙草列、水稻(OryzasativaL.)阿)、番茄(SolanumlycopersicumL.)、苜蓿(MedicagosativaL.)421、馬鈴J?

21、(SolanumtuberosumL.)331等17種植物已成功表達(dá)了81種疫苗或抗原最近，用植物系統(tǒng)表達(dá)NV的VLPs也有許多成功報(bào)道132441o1996年，Mason等心用馬鈴薯表達(dá)NV的VLPs喂飼小鼠，無論是否有粘膜佐劑很亂毒素的存在，均可以產(chǎn)生血清免疫蛋白IgG和腸免疫球蛋白IgA。2006年,Zhang等用表達(dá)NV的VLPs轉(zhuǎn)基因番茄冷凍干粉喂飼小鼠，成功誘導(dǎo)了Ig(；和IgA產(chǎn)生。基于疫苗生產(chǎn)成本和給藥方式考慮，近年來對(duì)植物口服疫苗研發(fā)引起了廣泛關(guān)注。番茄(So/agmycopersicumL.)作為一種世界性經(jīng)濟(jì)作物,其可食用性和成熟的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)優(yōu)于生菜(/U以asaliv

22、aL.)、菠于(Spirwciaoler-aceaL.)、香蕉(防心asapiemumL.)、蘋果(MalusdomesticaBorkh)和菊萄(VilisviniferaL.)等植物，是理想的植物口服疫苗表達(dá)系統(tǒng)。截至目前，用番茄果實(shí)表達(dá)包括人類免疫缺陷病毒*、肝炎病素如、霍亂毒索(choleratoxin)網(wǎng)制、輪狀病毒(rotavirus)叫、Norwalk病毒、嚴(yán)重急性呼吸綜合癥(severeacuterespiratorysyndrome,SARS)、炭疽病(anthrax)(521和狂犬病毒(rabiesvirus)138在內(nèi)的口服疫苗(抗原蛋白)至少有23種。此前NVs亞單位疫

23、苗多選用完整的VLPs,而最近的研究結(jié)果顯示，P顆粒在分子最和HBGA親和性方面均具有優(yōu)勢(shì)見，用番茄表達(dá)VA387的P顆粒,對(duì)提高NVs預(yù)防效果和在發(fā)展中國(guó)家或經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)地應(yīng)用具有重要意義。4討論NVs嚴(yán)重威脅著人類健康，特別是對(duì)幼兒、老人和免疫缺陷人群;NVs易于在幼兒園、學(xué)校、療養(yǎng)院、游輪和餐館等公共場(chǎng)所暴發(fā)；預(yù)防NVs以疫苗最為有效，可用桿狀病毒、酶母和昆蟲細(xì)胞表達(dá)亞單位疫苗VLPs,最近用植物系統(tǒng)中表達(dá)NVs亞基疫苗特別是口服疫苗倍受關(guān)注。盡管用植物包括番茄表達(dá)NVs亞基疫苗有許多優(yōu)點(diǎn),不過仍存在許多尚待解決的問題。目前，對(duì)有關(guān)重組類病毒顆粒的免疫保護(hù)機(jī)制還知之甚少，誘導(dǎo)腸膜免疫和體液

24、免疫能力也有待探明,所介導(dǎo)的系統(tǒng)免疫持續(xù)的時(shí)間也不甚清楚，特別是NVs不斷進(jìn)化和變異,甚至每年都會(huì)有新的毒株出現(xiàn)，再加之對(duì)NVs疫苗研究也剛剛起步，使詼研究更加復(fù)雜上述問題的解決均有賴于NVs分子病毒學(xué)、免疫學(xué)和流行病學(xué)研究的新突破。同時(shí),用轉(zhuǎn)基因植物(如番茄)表達(dá)NVs的亞單位疫苗也存在表達(dá)檢和生物安全等方面的問題，特別是不同轉(zhuǎn)基因株系、甚至不同世代、生長(zhǎng)期和果實(shí)成熟度都將影響到靶蛋白的表達(dá)危，增加了臨床應(yīng)用的難度。轉(zhuǎn)基因番茄的生物安全性可以通過無選擇標(biāo)記(markerfree)載體構(gòu)建和在可控環(huán)境中(如保護(hù)地)栽培策略加以控制，再加之番茄屬于自交受粉植物，不必?fù)?dān)心因其花粉漂流而帶來生物安全

25、問題，這是利用番茄作為表達(dá)系統(tǒng)-個(gè)有利方面。盡管用植物系統(tǒng)(番茄)表達(dá)NVs的P顆粒存在上述一些亟待解決的問題，不過這對(duì)于預(yù)防NVs感染和流行將是一種有益的嘗試，甚至對(duì)利用植物系統(tǒng)生產(chǎn)口服疫苗也有一定的借鑒意義。參考文獻(xiàn)IAdlerJL,ZicklR.WintervomitingdiseaseJJ.Infect.Dis.t1969.119(6):668-673.：2KapikianAZ,WyattRG.DoiinH,etal.Visualizationbyimmuneelectronmicroscopyofa27-nmparticleassociatedwithacuteinfectiousn

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