實時熒光定量PCR20160520

1、劉亭劉亭2016.05.252016.05.25內(nèi)容內(nèi)容常規(guī)常規(guī)PCRPCR：擴增：擴增DNADNA，借助電泳對擴增反應的終產(chǎn)物進行半定量及定性分析，借助電泳對擴增反應的終產(chǎn)物進行半定量及定性分析變性變性退火退火延伸延伸Y0 2 4 8 16 Y0 2n擴增擴增DNADNA，利用熒光信號的變化實時檢測，利用熒光信號的變化實時檢測PCRPCR擴增反應中每一個擴增反應中每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物量的變化，最終精確的對起始模板的定量分析循環(huán)擴增產(chǎn)物量的變化，最終精確的對起始模板的定量分析Y0 2 4 8 16 Y0 2n擴增曲線背景期對數(shù)增長期線性增長期平臺期 熒光嵌合熒光嵌合法（法（非特異性）非特異性）S

2、YBR Green SYBR Green I I 熒光探針熒光探針法（法（特異性特異性）TaqMan probeTaqMan probeCycling probeCycling probeReal Time Real Time PCR PCR 的熒光的熒光化學檢測化學檢測原理原理非特異性的熒光嵌合法非特異性的熒光嵌合法 SYBR Green ISYBR Green I SYBR Green ISYBR Green I是一種能夠結合于所有雙鏈是一種能夠結合于所有雙鏈DNADNA小溝中的熒光染料，小溝中的熒光染料，SYBRSYBR與與PCRPCR合成合成DNADNA雙鏈結雙鏈結合后，發(fā)射熒光信號，

3、而游離的合后，發(fā)射熒光信號，而游離的 SYBR SYBR 不會發(fā)射熒光信號，因此熒光信號的增加與不會發(fā)射熒光信號，因此熒光信號的增加與PCRPCR產(chǎn)物產(chǎn)物的增加完全的增加完全同步同步優(yōu)點：簡單易行，成本優(yōu)點：簡單易行，成本較低較低缺點：與缺點：與非特異性產(chǎn)物結合非特異性產(chǎn)物結合，不能進行多重，不能進行多重PCRPCR適用：不同樣本同一基因適用：不同樣本同一基因相對表達量分析相對表達量分析特異性熒光探針法特異性熒光探針法 TaqMan TaqMan probe probe Taqman 探針是一段與目的基因配對的DNA序列，5端加熒光物質，3端加淬滅物質，完整探針5端的熒光物質被3端淬滅物質抑制

4、，不發(fā)熒光，當PCR合成DNA，退火時探針和DNA配對，延伸時，由于DNA聚合酶也有核酸外切酶活性，將探針分解， 5端熒光物質游離出來，發(fā)出熒光，檢測熒光強度，表征PCR擴增的DNA量。優(yōu)點：特異性強，能進行多重優(yōu)點：特異性強，能進行多重PCRPCR缺點：需設計特異性探針，成本較高缺點：需設計特異性探針，成本較高適用：區(qū)別同源性高的序列，適用：區(qū)別同源性高的序列，SNPSNP解析等多重解析等多重PCRPCR檢測檢測閾值（ Threshold ）：在擴增曲線指數(shù)增長期設定的熒光檢出界限（第315個循環(huán)的熒光信號標準偏差的10倍）C(t)值（Cycle of threshold）：熒光信號（擴增產(chǎn)

5、物）到達閾值時所經(jīng)過的擴增循環(huán)次數(shù)閾值C(tC(t) )值值 18.12 +/- 0.0418.12 +/- 0.0418.12 +/- 0.04C(tC(t) )值值18.12 +/- 0.04Real Time Real Time PCR PCR 的數(shù)學定量的數(shù)學定量原理原理絕對定量相對定量Real Time Real Time PCR PCR 的數(shù)學定量的數(shù)學定量原理原理初始DNA量越多，越早達到閾值，擴增曲線越早起峰，Ct值越小經(jīng)數(shù)學理論證明，初始DNA量的對數(shù)值與循環(huán)數(shù)/Ct呈反比線性關系腫瘤正常絕對絕對定量定量將已知濃度的標準品進行梯度稀釋，進行Real Time PCR,會得到一

6、系列等間隔的擴增曲線。以它們的Ct值作橫坐標，初始DNA量的對數(shù)值為縱坐標，作圖得到標準曲線，未知濃度的樣品進行Real Time PCR,得到Ct值，代入標準曲線，可以樣品的初始DNA量。10410310610510210熒光強度-循環(huán)數(shù)曲線初始DNA量對數(shù)-Ct循環(huán)數(shù)標準曲線絕對定量通過標準曲線確定初始DNA/RNA基因拷貝數(shù)或濃度，通常用于病毒，病原菌的定量檢測即轉基因食品食品的檢測。相對相對定量定量比較不同樣本之間基因表達量的高低變化，需要做相對定量。相對定量引入內(nèi)參基因，即維持細胞基本代謝活動所必需的基因，其表達量在不同的細胞里基本一樣，在擴增目的基因的同時擴增內(nèi)參基因，用不同樣本的

7、目的基因的擴增量與各自內(nèi)參基因的擴增量的比值對目的基因表達量進行均一化后，再比較高低，可以對不同樣本間細胞起始數(shù)，RNA提取效率，基因擴增效率的不同進行矯正。定性分析定性分析: :病毒和病原菌檢測;單核苷酸多態(tài)性（SNP）檢測;物種鑒定定量分析定量分析: :絕對定量:病毒和病原菌定量;基因拷貝數(shù)分析;轉基因定量分析相對定量:基因表達基因表達量分析量分析基因表達的中心法則基因表達的中心法則SYBR green 1 的相對定量法：一、實驗設計，材料處理，取材凍存二、目的和內(nèi)參基因的選擇及引物設計三、準備試劑與耗材，預約儀器四、RNA提取，質量與濃度檢測，反轉錄成cDNA五、按反應體系準備樣品六、上

8、機設定反應條件，運行程序進行反應七、溶解曲線分析熒光信號產(chǎn)生的特異性八、獲得數(shù)據(jù)，計算分析結果并做圖對照組Control處理組Drug112h重復1重復2重復30h3h6h12h重復1重復2重復33h6h一一 實驗設計實驗設計，材料處理，取材凍，材料處理，取材凍存（存（-80-80）對照組對照組處理組處理組0h#1#2#33h#4#5#6#7#8#96h#10#11#12#13#14#1512h#16#17#18#19#20#21二二 目的和內(nèi)參基因的選擇及引物設計目的和內(nèi)參基因的選擇及引物設計目的基因的選擇：目的基因的選擇：根據(jù)實驗目的內(nèi)參基因的選擇：內(nèi)參基因的選擇：維持細胞基本代謝活動所必

9、需的基因，如GAPDH，Actin，18S rRNA等通過查文獻或實驗篩選引物設計注意事項：引物設計注意事項：引物設計軟件 Oligo 7 三三、準備試劑、準備試劑，耗材，預約儀器，耗材，預約儀器試劑：RNA提取試劑盒，cDNA反轉錄試劑盒（21次反應），SYBR mix（ 212次反應）等耗材：槍頭，EP管等（無RNase處理），96/384孔版，透明薄膜，冰及冰盒等儀器：槍，離心機，Nanodrop核酸濃度測定儀，核酸電泳儀，熒光定量PCR儀等四、四、RNARNA提取，質量與濃度檢測，反轉錄成提取，質量與濃度檢測，反轉錄成cDNAcDNA針對樣品選用一款合適的RNA提取試劑盒取相同量的組織

10、或細胞提取總RNA提取的總RNA?；煊谢蚪MDNA，可以通過DNase處理去除或跨內(nèi)含子引物設計避免基因組DNA擴增RNA電泳檢測降解情況Nanodrop測定RNA濃度和純度（OD260/2802，OD260/2302）取相同量的RNA（如1ug）做反轉錄RNA易降解，而cDNA可于-20保存很久五、按反應體系準備樣品五、按反應體系準備樣品上述cDNA需要進行稀釋，稀釋倍數(shù)實驗摸索（使內(nèi)參Ct約20）每個樣品做2個技術重復，事先設計好樣品在96孔板上的排列先把稀釋好的cDNA加到96孔板，再加混好的SYBR mixture,primer,H2O加入96孔板，蓋上透明薄膜，離心后上機反應體系：內(nèi)

11、參42目的42Template cDNA4uL2SYBR mixture10uL420uL420uLForward primer0.5uL21uL21uLReverse primer0.5uL21uL21uLH205uL220uL220uLTotal20uL內(nèi)參目的1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 67 7 8 8 9 9 10 10 11 11 12 1213 13 14 14 15 15 16 16 17 17 18 1819 19 20 20 21 21 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 67 7 8 8 9 9 10 10 11 11 12 1213 13 14 1

12、4 15 15 16 16 17 17 18 1819 19 20 20 21 21 六、上機設定反應條件，運行程序進行反應六、上機設定反應條件，運行程序進行反應參考SYBR green 1 Kit 的說明書預變性：95 ,30s ,20 /s 1 cyclePCR反應：95 ,5s ,20 /s 60 ,20s ,20 /s 40 Cycles溶解曲線分析：95 , 0s, 20 /s 72, 15s, 20 /s 95, 0s, 0.3 /s 七七、從溶解曲線確認、從溶解曲線確認PCRPCR反應的反應的特異性特異性溶解曲線的一次曲線溶解曲線的負一次曲線微分曲線PCR反應結束后，擴增產(chǎn)物呈雙

13、鏈，具有較高的熒光信號強度，此時，將PCR反應液的溫度漸漸升高，DNA雙鏈漸漸打開，嵌入DNA雙鏈中的SYBR Green 數(shù)量減少，熒光信號強度漸漸降低，當雙鏈DNA解鏈一半時，熒光信號強度急劇下降，此時的溫度即溶解溫度（Tm值），對于某一特定的PCR擴增產(chǎn)物，其值是固定的。八、八、獲得數(shù)據(jù)，計算分析結果并做圖獲得數(shù)據(jù)，計算分析結果并做圖樣品樣品內(nèi)參內(nèi)參Ct目的目的Ct相對表達量相對表達量120.15120.12220.13220.14319.88319.99420.45420.21519.45519.70Power(內(nèi)參Ct-目的Ct，2)謝謝關注，歡迎交流討論！謝謝關注，歡迎交流討論！常

14、規(guī)常規(guī)PCRPCR：擴增：擴增DNADNA，借助電泳對擴增反應的終產(chǎn)物進行半定量及定性分析，借助電泳對擴增反應的終產(chǎn)物進行半定量及定性分析常規(guī)常規(guī)PKPK實時實時PCRPCR 實時熒光定量PCR 常規(guī)PCR能進行定量或定性分析靈敏度高，精確度高不需要電泳分析，省時，安全，不易污染需要熒光定量PCR儀，熒光染料等，成本較高只能進行半定量或定性分析靈敏度低，精確度低需要電泳分析，費時，不安全，易污染只需要普通PCR儀與PCR試劑，成本較低各種熒光檢測方法比較SYBR greentaqmanCycling 優(yōu)點缺點適用范圍Real Time Real Time PCRPCR定量定量的數(shù)學原理的數(shù)學原

15、理理想的理想的PCRPCR反應：反應：Y Yn n = Y= Y0 02 2n n非理想非理想的的PCRPCR反應：反應：Y Yn n = Y= Y0 0(1+Ex)(1+Ex)n n方程式兩邊同時取對數(shù)得方程式兩邊同時取對數(shù)得: : logYlogYn n = log= logY Y0 0(1+Ex)(1+Ex)n n整理整理方程式得方程式得: :logYlogY0 0 = =-log(1+Ex)-log(1+Ex)n n + logY + logYn n將將CtCt和和Y YC Ct t帶入帶入上式得：上式得：logYlogY0 0 = =-log(1+Ex)-log(1+Ex)Ct Ct

16、 + logY+ logYCtCtn：擴增反應的循環(huán)次數(shù)Yn：第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量Y0：初始DNA量Ex：擴增效率初始初始DNADNA量量的對數(shù)值與循環(huán)數(shù)的對數(shù)值與循環(huán)數(shù)/Ct/Ct呈反比線性關系呈反比線性關系定性分析定量分析絕對定量相對定量病毒和病原菌檢測病毒和病原菌檢測單核苷酸多態(tài)性單核苷酸多態(tài)性/SNP/SNP檢測檢測物種鑒定物種鑒定病毒和病毒和病原菌定量病原菌定量基因拷貝基因拷貝數(shù)分析數(shù)分析轉基因定量分析轉基因定量分析mRNAmRNA表達量分析表達量分析Cycling probeCycling probe利用Cycleave法的SNP解析原理利用Cycleave法的SNP解析原理對照組

17、Control處理組Drug112h重復1重復2重復30h3h6h12h重復1重復2重復33h6h0h-1, 0h-2, 0h-3 (1-3)C-3h-1, C-3h-2, C-3h-3 (4-6)C-6h-1, C-6h-2, C-6h-3 (7-9)C-12h-1, C-12h-2, C-12h-3 (10-12)D-3h-1, D-3h-2, D-3h-3 (13-15)D-6h-1, D-6h-2, D-6h-3 (15-18)D-12h-1, D-12h-2, D-12h-3 (19-21)一一 實驗設計實驗設計，材料處理，取材凍，材料處理，取材凍存（存（-80-80）標準曲線相對定

18、量法用目標基因和內(nèi)標基因的標準品分別獲得標準曲線用目標基因和內(nèi)標基因的標準品分別獲得標準曲線處理與未處理樣品同時擴增目標基因和內(nèi)標基因，獲得處理與未處理樣品同時擴增目標基因和內(nèi)標基因，獲得C(t)C(t)值值用內(nèi)標基因對目標基因均一化用內(nèi)標基因對目標基因均一化處理樣本與未處理樣本目標基因處理樣本與未處理樣本目標基因C(t)C(t)值經(jīng)內(nèi)參基因均一化后相除，即值經(jīng)內(nèi)參基因均一化后相除，即可得出處理樣本與未處理樣本的表達差異可得出處理樣本與未處理樣本的表達差異2-c(t) 法公式推導公式推導 M:M:目標基因，目標基因，N N：內(nèi)標基因：內(nèi)標基因 X XC(t)MC(t)M=X=X0M0M* *2 2C(t)MC(t)M=A(=A(域值域值) (1) (1) X XC(t)NC(t)N=X=X0N0N* *2 2C(t)NC(t)N=A(=A(域值域值) (2) (2) 均一化均一化 (1)/(2):(1)/(2): X X0M0M/X/X0N0