細(xì)胞工程之種質(zhì)保存技術(shù)

1、細(xì)胞工程之種質(zhì)保存技術(shù)植物種質(zhì)植物種質(zhì)：植物親代通過(guò)生殖細(xì)胞或體細(xì)胞傳遞給后代的遺傳物質(zhì)植物種質(zhì)資源植物種質(zhì)資源：攜帶各種不同遺傳物質(zhì)的植物總稱(chēng)種質(zhì)資源是育種、開(kāi)發(fā)利用以及科學(xué)研究的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，故世界各國(guó)均非常重視植物種質(zhì)資源的考察、收集、保存據(jù)美國(guó)時(shí)代雜志網(wǎng)站報(bào)道，距北極點(diǎn)約1000公里的挪威斯瓦爾巴群島的一處山洞中有一座“世界末日種子庫(kù)”假設(shè)有一天地球上發(fā)生毀滅性的災(zāi)難，那時(shí)幸存的人類(lèi)就可以取出種子庫(kù)中存放的種子植物諾亞方舟據(jù)介紹，挪威政府興建的全球種子庫(kù)有兩個(gè)特點(diǎn) 一是建在凍土地帶的巖石中，幾乎不受氣候變化的影響（-18），且能抵御原子彈爆炸和強(qiáng)烈地震 二是位置高于海平面米左右，即便格

2、陵蘭的冰蓋和南極洲的冰層完全融化，也不會(huì)被淹沒(méi)由6萬(wàn)根蘊(yùn)含植物種子的透明亞克力桿組成所有的種子都來(lái)自千年種子銀行項(xiàng)目植物為人類(lèi)提供了氧氣、食物、藥品和建材，然而到本世紀(jì)末，它們中的2/3卻面臨永遠(yuǎn)地滅絕的危險(xiǎn)。如果氣溫升高兩度，那么15%到40%的植物將滅絕。種子銀行的主要功能是進(jìn)行物種儲(chǔ)存，一旦某個(gè)植物物種滅絕，種子銀行就可隨時(shí)起用其種子，讓這個(gè)物種得以恢復(fù)。在適宜的環(huán)境條件下，貯存植物種質(zhì)，使其保持生命力與遺傳性的技術(shù)一般有2種方式 就地保存：通過(guò)建立自然保護(hù)區(qū)、森林公園等來(lái)實(shí)現(xiàn)種質(zhì)保存的目的 遷地保存：通過(guò)建立植物園、種質(zhì)資源圃、種子庫(kù)、離體保存等方法來(lái)實(shí)現(xiàn)世界第一個(gè)保護(hù)區(qū)、1872年、

3、美國(guó)西安周至金絲猴保護(hù)區(qū) 白河川金絲猴保護(hù)區(qū)沿渡河金絲猴保護(hù)區(qū) 紅拉山滇金絲猴保護(hù)區(qū)巴東縣沿渡河金絲猴自然保護(hù)區(qū) 芒康滇金絲猴國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū) 西安金絲猴自然保護(hù)區(qū) 1.臥龍大熊貓自然保護(hù)區(qū)2.王朗大熊貓自然保護(hù)區(qū)3.佛坪大熊貓自然保護(hù)區(qū)4.勿角大熊貓自然保護(hù)區(qū)5.甘肅隴南文縣白水江大熊貓自然保護(hù)區(qū)6.文縣尖山大熊貓自然保護(hù)區(qū)7.武都裕河大熊貓自然保護(hù)區(qū)8.迭部多兒大熊貓自然保護(hù)區(qū)9.阿夏大熊貓自然保護(hù)區(qū)10.彭州白水河國(guó)家級(jí)大熊貓自然保護(hù)區(qū)11.崇州鞍子河大熊貓自然保護(hù)區(qū)12.都江堰龍溪虹口國(guó)家級(jí)大熊貓自然保護(hù)區(qū)彩林彩林植物植物現(xiàn)有的自然保護(hù)區(qū)中，國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)243個(gè)，占保護(hù)區(qū)總數(shù)的10

4、.34%，地方級(jí)保護(hù)區(qū)中省級(jí)自然保護(hù)區(qū)773個(gè)，地市級(jí)保護(hù)區(qū)421個(gè)，縣級(jí)自然保護(hù)區(qū)912個(gè)無(wú)論是就地保存還是建立植物園和苗圃，均會(huì)耗費(fèi)大量的土地以及人力物力還有可能受病蟲(chóng)害及其他自然災(zāi)害的影響使植物種質(zhì)遭受損失在一定范圍內(nèi)，種子的濕度每降低1%，保存時(shí)間翻番；同樣，保存溫度每降低5 ，種子生命活性保持也能倍增基于這樣的研究，種子庫(kù)的濕度一直低于10%，而溫度則維持在零下20 。一般情況下，種子庫(kù)的植物種子在濕度小于10%和零下20的條件下至少能保持10年內(nèi)仍充滿活性。每過(guò)10年，科研人員就會(huì)對(duì)種子進(jìn)行發(fā)芽抽樣測(cè)試，以確保它們?nèi)跃哂猩?，如果效果不好，就立即更換一批。理論上講，種子的最長(zhǎng)保存

5、期可以達(dá)到200年。英國(guó)皇家植物園的生物學(xué)家在2006年成功地在實(shí)驗(yàn)室條件下將200多年前、英王喬治三世時(shí)期（1803年）保留下來(lái)的一些槐樹(shù)種子培育發(fā)芽，創(chuàng)造了擱放時(shí)間最久還能生長(zhǎng)發(fā)育的植物種子的紀(jì)錄。1.對(duì)于壽命短的種子，每隔幾年就得繁殖一次，成本較高2.某些種子干燥時(shí)會(huì)失去活力或受到損傷3.對(duì)于長(zhǎng)壽樹(shù)種，可能會(huì)有很多年不結(jié)種子4.很多植物通過(guò)無(wú)性繁殖繁衍后代，沒(méi)有種子對(duì)于上述植物可通過(guò)離體保存技術(shù)來(lái)長(zhǎng)期保存離體培養(yǎng)的植物細(xì)胞、組織、器官和試管苗等保存于人工環(huán)境下，一般是在低溫或超低溫條件下，抑制其生長(zhǎng)，達(dá)到長(zhǎng)期保存的目的節(jié)約大量土地、人力物力，節(jié)省費(fèi)用種質(zhì)不受病蟲(chóng)害侵染，便于種質(zhì)交流保存的

6、種質(zhì)一旦需要，可迅速通過(guò)組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行快速繁殖，有利于種質(zhì)的利用和推廣1.超低溫冷凍保存技術(shù)2.低溫保存技術(shù)3.常溫保存技術(shù)基本原理：將植物材料加入一定的冷凍防護(hù)劑冷凍防護(hù)劑，再經(jīng)一定的方法處理后，貯存在-80-80（干冰溫度）至-196-196（液氮溫度）的超低溫條件下所用的植物材料 離體培養(yǎng)的原生質(zhì)體、細(xì)胞、組織、器官、小植株 植物的花粉、蕨類(lèi)植物或海藻的孢子等-196 的超低溫條件下，細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)代謝及生命活動(dòng)處于幾乎完全停止的狀態(tài)，遺傳變異也降到最低。理論上植物材料放在液氮中可以無(wú)限期貯存。植物細(xì)胞中含有大量的水分，約占細(xì)胞總重量的6090。細(xì)胞中的水是由游離水和束縛水組成，其中游離

7、水約占90，很容易凍結(jié)。種質(zhì)超低溫保存成功的關(guān)鍵，在于降溫冰凍過(guò)程中避免細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰超低溫保存有三個(gè)重要操作步驟：1. 預(yù)凍2. 在-196C下長(zhǎng)期貯存3. 解凍1.細(xì)胞質(zhì)濃厚的分生細(xì)胞2.處于旺盛的對(duì)數(shù)分裂期的細(xì)胞常選擇細(xì)胞培養(yǎng)物、植物莖尖、幼胚、幼苗等作為冷凍保存的材料注意事項(xiàng) 1 培養(yǎng)代數(shù)過(guò)多，可能會(huì)使細(xì)胞失去再生能力 2 培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)使細(xì)胞液泡化 3 長(zhǎng)期培養(yǎng)的愈傷組織和細(xì)胞在遺傳上容易變異選擇培養(yǎng)代數(shù)低的材料結(jié)構(gòu)緊密的細(xì)胞團(tuán)與愈傷組織要比單個(gè)細(xì)胞及松散的細(xì)胞團(tuán)更耐受冷凍野外生長(zhǎng)的材料 選擇經(jīng)過(guò)冬天低溫鍛煉過(guò)的植株來(lái)自于抗寒植物的材料，其抗凍性較一般植株強(qiáng)在冷凍之前對(duì)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，可

8、改善細(xì)胞的抗寒能力，從而提高細(xì)胞冷凍處理后的存活率常用方法 低溫 培養(yǎng)基加入滲透劑、DMSO 脫水處理通常將材料放在0左右處理數(shù)天至數(shù)周對(duì)于低溫敏感的植物材料尤為重要康乃馨無(wú)性系在4培養(yǎng)3天后進(jìn)行超低溫保存，解凍后莖尖存活率較未進(jìn)行預(yù)處理的材料明顯提高滲透劑：甘露醇、山梨醇、蔗糖、脯氨酸等脯氨酸是植物體內(nèi)天然的防護(hù)劑使細(xì)胞的體積降低，提高材料的抗凍性，增加冷凍后的存活率將細(xì)胞脫水到適當(dāng)程度，可大大提高材料冷凍及解凍后的存活率而且含水量低的材料，對(duì)解凍速度的要求更為寬松1.降低冰點(diǎn)，促進(jìn)過(guò)冷卻和玻璃態(tài)化的形成；2.提高溶液的黏滯性，阻止冰晶形成；3.DMSO可以使膜物質(zhì)分子重新分布，增加細(xì)胞膜的

9、透性，在溫度降低時(shí)，加速細(xì)胞內(nèi)的水流往細(xì)胞外結(jié)冰；4.穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)的大分子正常結(jié)構(gòu)，特別是膜結(jié)構(gòu)，阻止低溫對(duì)膜的傷害。甘油、糖、糖醇類(lèi)、DMSO、脯氨酸DMSO二甲基亞砜：預(yù)培養(yǎng)24-48 h，或用二甲基亞砜進(jìn)行預(yù)冷處理，一般時(shí)間為20-60 min，可大大提高存活率但是應(yīng)注意其細(xì)胞毒性，使用濃度不宜超過(guò)5%滲透性冷凍防護(hù)劑多屬于低分子量的中性物質(zhì)，容易與水分子結(jié)合，發(fā)生水合作用，從而增加溶液的黏度，降低溶液冰點(diǎn)，減弱水的結(jié)晶過(guò)程，即冰點(diǎn)中心增長(zhǎng)速度下降，削弱了水的固化程度故在冷凍與解凍過(guò)程中，培養(yǎng)基與細(xì)胞內(nèi)的冰點(diǎn)降低，從而保護(hù)了植物材料乙二醇的含量為68時(shí)，冰點(diǎn)可降低至-68由于冷凍防護(hù)劑的加

10、入，培養(yǎng)基的滲透壓提高，使細(xì)胞產(chǎn)生輕微的質(zhì)壁分離，增加了細(xì)胞的耐寒能力二甲基亞砜等極易滲入細(xì)胞內(nèi)部，從而防止在冷凍及融化過(guò)程中細(xì)胞過(guò)度脫水而受到破壞非滲透性冷凍防護(hù)劑在特定溫度下可降低溶質(zhì)（電解質(zhì)）濃度，從而起到保護(hù)材料的作用大部分冷凍防護(hù)劑具細(xì)胞毒性，處理溫度愈高，毒性愈大，故需在0 下進(jìn)行處理時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，一般不超過(guò)1 h根據(jù)不同的植物材料，選擇不同的冷凍防護(hù)劑若單獨(dú)使用效果不大，往往組合使用可獲得較好的效果冷凍時(shí)，細(xì)胞內(nèi)外主要發(fā)生理化變化 細(xì)胞外的溶液水分子先形成冰晶中心 冰晶中心的形成速度與溶液成分和降溫速度有關(guān) 一般在-20-60 范圍內(nèi)，冰晶中心增長(zhǎng)最快，形成大塊冰晶后速度減慢，到

11、-140 時(shí)完全停止增長(zhǎng)冷凍方法 慢速冷凍法、快速冷凍法、逐步冷凍法、預(yù)冷凍法、干凍法、包埋脫水法、玻璃化法、利用馴化冰箱法將加入冷凍防護(hù)劑的材料，以0.10.11010 /min/min的速度逐漸降低其溫度，待降至-40 或-100 時(shí)，浸入液氮中貯存慢速冷凍過(guò)程中細(xì)胞內(nèi)的水分外滲并轉(zhuǎn)化為冰晶，既對(duì)冷凍細(xì)胞有脫水作用，又防止了細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，避免了冰凍傷害適用于液泡化的成熟細(xì)胞經(jīng)冷凍防護(hù)劑處理的樣品直接轉(zhuǎn)入-196 液氮罐或液氮庫(kù)，冷卻速度達(dá)到1000 /min快速冷凍時(shí)，由于迅速通過(guò)細(xì)胞冰晶生長(zhǎng)的臨界溫度區(qū)域，避免了細(xì)胞內(nèi)形成致死的大冰晶適用于細(xì)胞體積小、胞質(zhì)濃、含水量低的材料（莖尖、生

12、長(zhǎng)點(diǎn)或花粉）又稱(chēng)逐步冷凍法先逐漸冷卻（1 /min）或分步冷卻（約5 /min）至-3050 ，停留約30 min，使材料脫水，然后投入液氮迅速冷卻對(duì)于莖尖和芽的冷凍保存最有效，對(duì)懸浮細(xì)胞也有一定效果經(jīng)脫水處理后投入液氮中冷凍脫水（干燥）預(yù)處理能增強(qiáng)材料的抗凍性適用含水量較高的薄壁細(xì)胞常用的脫水方法 真空干燥法、烘箱、硅膠干燥、在含高濃度滲透性化合物（甘油、糖類(lèi)等）的培養(yǎng)基上培養(yǎng)效果最好培養(yǎng)材料由褐藻酸鹽包埋成球狀顆粒，在含高濃度的蔗糖溶液（0.75 mol/L）中預(yù)培養(yǎng)一段時(shí)間經(jīng)無(wú)菌空氣或硅膠部分脫水后進(jìn)行慢速或快速冷凍用高濃度的蔗糖預(yù)處理材料，可避免DMSO和甘油的化學(xué)毒性，目的在于提高胞

13、質(zhì)濃度，增加抗凍力和抗脫水力適合對(duì)低溫保護(hù)劑敏感的植物培養(yǎng)材料包埋后，避免了其裸露時(shí)可能受到的損傷，使材料所處的環(huán)境更為恒定優(yōu)點(diǎn) 1易于操作 2避免使用DMSO 3免去了程序降溫儀的使用，降溫過(guò)程比較隨意 4可用較大的培養(yǎng)材料玻璃化是將某種物質(zhì)轉(zhuǎn)變成玻璃樣無(wú)定形體（玻璃態(tài)）的過(guò)程，是一種介于液態(tài)與固態(tài)之間的狀態(tài)，在此形態(tài)中沒(méi)有任何的晶體結(jié)構(gòu)存在玻璃化是冷凍生物學(xué)中一項(xiàng)簡(jiǎn)單、快速而有效的保存有生命的細(xì)胞、組織和器官的方法通過(guò)玻璃化法降溫保存細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞內(nèi)外的水都不形成結(jié)晶，細(xì)胞結(jié)構(gòu)不會(huì)受到破壞從而細(xì)胞得以存活任何液體只要有足夠的降溫速度都可以進(jìn)入玻璃態(tài)純水玻璃化：需要的降溫速度是1010 /mi

14、n兩種方法可顯著降低形成玻璃化所需的降溫速度 1.使用高濃度的保護(hù)劑，即玻璃化溶液（VS) 2.增加靜水壓力 隨著保護(hù)劑濃度提高或靜水壓力提高，均一晶核形成溫度下降，玻璃化形成溫度上升貯存期間關(guān)鍵要把冷凍溫度持續(xù)維持在-196 條件下，不發(fā)生溫度的上下波動(dòng)一般認(rèn)為：在-196 液氮溫度下，冰晶不會(huì)增長(zhǎng)及重新形成冰晶在以大豆莖尖為材料做超低溫冷凍實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)：貯存在-86 時(shí)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)材料的活力逐漸喪失，而在-196 時(shí)材料活力幾乎不損失快速解凍法快速解凍法 將材料直接放入35-40 的水浴中解凍，一般約需12min的時(shí)間 可防止組織和細(xì)胞脫水死亡，也使冷凍材料快速通過(guò)使細(xì)胞和組織形成冰晶及

15、冰晶增長(zhǎng)的危險(xiǎn)溫度區(qū)域，從而避免冰晶對(duì)細(xì)胞和組織的傷害 一旦冰完全融化，應(yīng)迅速移開(kāi)材料，防止熱傷害及高溫下保護(hù)劑的毒害慢速解凍法慢速解凍法 在0 、23 或室溫下進(jìn)行解凍，這種方法易使細(xì)胞內(nèi)重新形成冰晶，故應(yīng)用較少 若冷凍前把細(xì)胞的含水量降到一個(gè)適當(dāng)?shù)乃剑瑒t可減低慢速解凍的不利影響，所以該方法多用于脫水處理材料的解凍由于冷凍保護(hù)劑對(duì)植物細(xì)胞有毒害作用，故在培養(yǎng)冷凍材料前，需對(duì)冷凍保護(hù)劑進(jìn)行數(shù)次洗脫，一般用液體培養(yǎng)液進(jìn)行清洗對(duì)于冷凍前進(jìn)行脫水處理的材料，為了避免質(zhì)壁分離的細(xì)胞復(fù)原時(shí)產(chǎn)生傷害，一般對(duì)冷凍防護(hù)劑逐漸進(jìn)行稀釋冷凍后復(fù)原的材料進(jìn)行重新培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)條件有可能和冷凍前有一定的變化如：經(jīng)超低

16、溫冷凍的番茄幼苗莖尖必須在培養(yǎng)基中加入GA3才能使材料直接發(fā)育成小苗，否則形成愈傷組織較常用，適于保存中短期種質(zhì)定義：將種質(zhì)用離體培養(yǎng)的方式貯存在非凍結(jié)程度的低溫下（1-9），但熱帶亞熱帶植物在10-20 之間也能延緩生長(zhǎng)，也稱(chēng)中低溫調(diào)控生長(zhǎng)保存在1-9 溫度下，植物材料的生長(zhǎng)速度減緩，但不會(huì)完全停止，因此仍須對(duì)材料進(jìn)行繼代，只是間隔時(shí)間可以延長(zhǎng)至幾個(gè)月到幾年低溫保存種質(zhì)不僅方法簡(jiǎn)單，而且存活率也很高一旦需要利用這些材料，只需在常溫下繼代培養(yǎng)便可迅速恢復(fù)生長(zhǎng)到目前為止，該方法已在眾多的果樹(shù)和草本植物中得到應(yīng)用，如葡萄、草莓、柑橘、蘋(píng)果、馬鈴薯等1969年，Galzy最早利用葡萄分生組織培養(yǎng)的小

17、植株，在9 條件下進(jìn)行保存，每年繼代一次，保存長(zhǎng)達(dá)15年之久用此法保存800個(gè)葡萄品種資源，每個(gè)樣品重復(fù)6個(gè)，用地面積僅占2 m2；但若在田間保存同樣數(shù)量的種質(zhì)，則需占地1萬(wàn)m2在4 條件下保存無(wú)病毒的草莓植株，每3個(gè)月加幾滴新鮮的培養(yǎng)液，可保存6年之久將四季橘試管苗培養(yǎng)在20 左右、12h光照條件下，不轉(zhuǎn)換新鮮培養(yǎng)基，可保存達(dá)8年之久化學(xué)方法 加入生長(zhǎng)抑制劑（脫落酸、多效唑、二甲銨基琥珀酸酰胺） 提高培養(yǎng)基滲透壓（高濃度蔗糖），使材料的生長(zhǎng)受到抑制，從而延長(zhǎng)繼代培養(yǎng)間隔時(shí)間物理方法 低氣壓和低氧壓都可抑制植物生長(zhǎng)并保持培養(yǎng)物表型一致 通過(guò)降低大氣壓或加入惰性氣體減少氧分壓 低光照也能抑制植物

18、的新陳代謝，特別對(duì)海藻種質(zhì)保存有效在常溫（205）條件下，應(yīng)用化學(xué)或物理方法，改變培養(yǎng)基的成分或環(huán)境條件，延緩培養(yǎng)物生長(zhǎng)，達(dá)到保存種質(zhì)的目的 1培養(yǎng)基中添加生長(zhǎng)抑制劑 2提高培養(yǎng)基滲透壓 3降低培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的氧分壓 4培養(yǎng)物干燥保存脫落酸：具有抗赤霉素的作用，抑制DNA合成、抑制外植體生長(zhǎng)活動(dòng)在每升培養(yǎng)基中加入5-10mg的ABA，可使外植體繼代培養(yǎng)間隔期延長(zhǎng)至一年以上，還可使試管苗葉色濃綠、矮壯、易生根一般使用蔗糖，濃度為10 %也可使用甘露醇，因?yàn)槠錇槎栊晕镔|(zhì)，不易被外植體吸收，其抑制時(shí)間更長(zhǎng)在木薯培養(yǎng)中，把蔗糖濃度提高到4 %，溫度降至20 ，繼代培養(yǎng)間隔期可延長(zhǎng)至15個(gè)月在對(duì)煙草的莖尖和愈傷組織離體保存時(shí)，把可利用的氧降到60%，