ELISA試驗(yàn)基本步驟及材料和試劑

1、.ELISA 基本步驟和主要試劑、材料注意：本步驟為間接ELISA 步驟一 主要步驟1 包被取所要包被的物質(zhì)，提前設(shè)計(jì)好所需濃度，根據(jù)包被孔數(shù)計(jì)算所需包被物的量，用包被液稀釋至所需體積，分加至各孔中。包被條件：兩種選擇：一是將ELISA 板直接置 4 過夜；也可以先置 37孵育 2小時(shí)再轉(zhuǎn)入 4過夜。2 洗滌包被結(jié)束后棄掉包被液，用 PBST 進(jìn)行洗滌，方法為 PBST 加滿每孔，靜置 5-10 min，棄掉洗液，重新加滿，重復(fù)洗滌 3-5 次，最后拍干 ELISA 板等待下一步封閉。3 封閉常用 10%小牛血清，取第2 步的 ELISA 板加封閉液至每孔，體積至少為所加包被液的兩倍。封閉條件

2、也有兩種選擇：直接置于4過夜，或者置于37溫育 2-4h，具體何種條件不同物質(zhì)的ELISA 可能不同。4 洗滌封閉結(jié)束的 ELISA 板進(jìn)行洗滌，方法同步驟2。最后拍干等待加入一抗。5 加入一抗一抗即為你要檢測的物質(zhì)， 一般加之前需要稀釋， 具體稀釋倍數(shù)不同實(shí)驗(yàn) 不同需要自己摸索。一抗樣品一般用包被液稀釋，稀釋到所需濃度后加入到相應(yīng)孔中。反應(yīng)條件為 37孵育 2h。6 洗滌具體同步驟 4。7 加相應(yīng) HRP-標(biāo)記的商品化二抗.加相應(yīng)的商品化HRP-標(biāo)記的二抗（如一抗為鼠源物質(zhì)則對(duì)應(yīng)加抗鼠二抗），一般也用封閉液稀釋，稀釋倍數(shù)參考二抗說明書。將稀釋好的二抗加入各孔，37反應(yīng)1-1.5h。8 洗滌具

3、體同步驟 4。9 顯色常用 OPD 作為顯色底物，但OPD 致癌，也有用TMB 作為底物，這里只介紹前者。顯色需要配置顯色液，具體方法為：在步驟8 進(jìn)行到一半使配置顯色液，為10ml 底物緩沖液加 0.015g OPD 粉末（實(shí)際操作由于OPD 有毒不方便稱量故只需稍微加入一點(diǎn)即可），等待OPD 完全溶解。待步驟8 完成后取 150ul 3%過氧化氫溶液加入之前配置的 10ml 溶液中混勻，立即將此顯色液分加至ELISA 各孔中。然后將ELISA 板置于 37反應(yīng)約 10min。10 終止將 ELISA 板取出，每孔加終止液（ 2mol/L 硫酸溶液）終止反應(yīng)，立即到酶標(biāo)儀上讀數(shù)（ OPD 為

4、底物是讀數(shù)波長為 490nm， TMB 為底物時(shí)波長為 450nm）。二 材料、試劑1 ELISA 板專用于 EILSA 的產(chǎn)品稱為 ELISA 板，國際上標(biāo)準(zhǔn)的微量滴定板為8×12 的 96 孔式，需要購買。常用聚苯乙烯和聚氯乙烯材料。注意：聚苯乙烯材料目前只有進(jìn)口，特點(diǎn)是孔大，加滿約300ul，此時(shí)實(shí)驗(yàn)中所加各試劑（包被液、一抗、二抗、顯色液、終止液等）均為100ul 體積。而聚氯乙烯多為國產(chǎn)，孔較小，加滿約200ul，此時(shí)各試劑只需加 50ul 體積即可。2 各試劑配制1）包被液（ PH6.3 的碳酸鹽緩沖液）無水 Na2CO30.1696gNaHCO30.2856g.SW10

5、0ml完全溶解至 4 ,一周內(nèi)使用2）PBST 配方NaCl8.0gNa2HPO4.12H2O 2.9gKCl0.2gKH2PO40.24gTW-200.5mlSW1000ml3)底物緩沖液Na2HPO43.682g檸檬酸1.02gDW200ml不需滅菌， 4 保存4）3% H2O230%H2O2100mlSW900ml5）顯色劑底物緩沖劑10ml3%H2O2150ulOPD15mg其中 H2O2 最后加6）終止液濃硫酸： SW = 1:8濃硫酸緩慢加入到SW 中，并攪拌散熱三 注意事項(xiàng)1 包被.所謂 37反應(yīng)，一般取一個(gè)37 的水浴鍋，在水面放一較大泡沫板，將ELISA板置于泡沫板上即可，其余步驟的37反應(yīng)操作同此；整個(gè) ELISA 過程中所有需要較長時(shí)間等待的步驟（包被、封閉、加一抗孵育、加二抗孵育）均需要將ELISA 包起來再放入冰箱或水浴鍋中，一般可直接用一次性EP手套套起來即可。2 洗滌最常規(guī)的洗滌步驟是洗滌3 次，每次間隔 5min，具體實(shí)驗(yàn)可能會(huì)微調(diào)，洗滌次數(shù)可以 3-6 次不等，間隔5-10min 不等；每次洗滌后要將ELISA 板盡可能拍干后在進(jìn)行下一步操作，尤其是每個(gè)洗滌步驟的最后一次洗滌要盡可能拍干，拍干可在紗布、吸水紙上進(jìn)行，也可以購買洗板機(jī)。3 顯色配制顯色液時(shí) 3%過氧化氫一定要最后加入， 加入混勻后立