近紅外漫反射光譜法定量分析頭孢拉定膠囊

1、近紅外漫反射光譜法定量分析頭孢拉定膠囊潘穎1 沈漪1 項競佐1 劉全21上海市藥品檢驗所抗生素室， 上海2002332 美國Thermo Nicolet儀器公司上海代表處，上海200031摘要 目的：采用近紅外（NIR）漫反射光譜法對不同生產廠家的頭孢拉定膠囊進行快速定量分析。方法：按頭孢拉定膠囊配方組成配制含主藥頭孢拉定濃度范圍從5.01% 91.24%的30個實驗室樣品，并收集來源于7個廠家的49批工業(yè)樣品，采集其NIR光譜。采用偏最小二乘回歸法建立NIR光譜信息與樣品組成間的定量分析模型，將其用于對驗證樣品進行預測分析，并對該方法的加樣回收率進行考察。結果：定量分析模型對21驗證樣品的的

2、預測均方差RMSEP為1.35%，預測值與真值的相關系數(shù)R為0.9968，加樣平均回收率為99.7%，RSD為0.7%（n=6）。結論：用近紅外漫反射光譜法對頭孢拉定膠囊進行定量分析的方法簡便快速，結果準確可靠，可推廣用于工業(yè)現(xiàn)場的實時在線檢測。關鍵詞 近紅外漫反射光譜法 頭孢拉定膠囊 偏最小二乘回歸 定量分析Quantitative Analysis of Cefradine Capsule by Near-infrared SpectroscopyPan Ying1, Shen Yi1, Xiang Jingzuo1, Liu Quan2(1. Shanghai Institute for

3、 Drug Control, Shanghai 200233)(2. Thermo Nicolet Corporation Shanghai Representative Office, Shanghai 200031)Abstract Objective To determine the principal component in cefradine capsule by near-infrared(NIR) spectroscopy. Method 30 samples with a concentration range from 5.01% to 91.24% for cefradi

4、ne were prepared in laboratory and 49 industry samples from 7 different factories were collected. Then their NIR spectra were collected on an Antaris FT-NIR analyzer. Partial least square regression (PLSR) algorithm was used to build the calibration model between the concentration of 59 calibration

5、samples and their NIR spectra. At last, the model was validated by the other 20 validation samples. The recovery of the method has also been examined. Result The root mean square error of prediction (RMSEP) was 1.35%. The correlation coefficient between the true value and prediction value was 0.9968

6、. The average recovery was 99.7% (RSD 0.67%, n=6). Conclusion The results show that the presented method is convenient, fast and has a good performance and can be applied to on-line detection in industrial process.Key words Near -Infrared Spectroscopy; Cefradine capsules; Partial least square regres

7、sion (PLSR); Quantitative analysis 近紅外（near-infrared，NIR）光譜技術是一種快速、無損分析方法，其光譜波長范圍是7802500nm（110004000cm-1），主要譜峰為有機物分子C-H、N-H和O-H等含氫基團的倍頻與合頻振動吸收所產生，光譜特性穩(wěn)定，非常適合于藥品原輔料及制劑的定性定量分析1-5。近幾年來，得益于化學計量學、電子計算機及軟件的發(fā)展，尤其是基于多變量數(shù)據(jù)分析的化學計量學的發(fā)展，使得NIR光譜中的大量信息能夠被解釋，這一技術因此而得到了廣泛的應用。與傳統(tǒng)的化學分析方法相比，NIR光譜技術具有分析迅速、操作簡便等優(yōu)點，它無需預

8、處理即可測定多種狀態(tài)的樣品，如粉末、完整片劑及膠囊、完整的生物組織、漿液、混懸液等6。 頭孢拉定為第一代頭孢菌素，主要作用于革蘭氏陽性菌包括耐青霉素金葡菌，臨床主要治療敏感細菌所致的呼吸道感染、生殖泌尿系統(tǒng)感染、軟組織感染等7。頭孢拉定膠囊臨床應用廣泛，目前國內也有很多廠家生產。各個生產廠家的產品質量參差不齊，更有不法之徒銷售假藥、劣藥?，F(xiàn)行的中國藥典檢測方法為高效液相色譜法，該方法需進行復雜的樣品制備和預處理工作，分析時間較長，難以適用于工業(yè)現(xiàn)場的實時在線分析。 本文以某一廠家的頭孢拉定膠囊處方組成配制了30個實驗室樣品，并收集了來源于7個廠家的50批工業(yè)樣品，分別采集其NIR漫反射光譜。比

9、較研究分別以主成分回歸（Principle component regression，PCR）法和偏最小二乘回歸（Partial least squares regression，PLSR）法建立定量分析模型，然后將此模型用于對驗證樣品含量進行預測，并考察該方法的加樣回收率。結果證明，該方法結果準確可靠，可大大縮短定量檢測的時間，達到快速分析的效果，可推廣用于工業(yè)現(xiàn)場的實時在線分析。1 實驗1.1 儀器與試藥 Antaris傅立葉變換NIR光譜儀（美國Thermo Nicolet公司），配有積分球漫反射采樣系統(tǒng)，Result操作軟件，TQ Analyst 6.2光譜分析軟件；頭孢拉定原料（純度

10、95.6%），輔料硬脂酸鎂、滑石粉、乳糖為藥用規(guī)格。1.2 樣品準備實驗室樣品配制：按某一廠家頭孢拉定膠囊處方組成配制含主藥頭孢拉定濃度范圍從5.01% 91.24%的30個實驗室樣品。工業(yè)樣品收集：頭孢拉定膠囊樣品共49批來源于7個廠家，它們分別是中美上海施貴寶制藥有限公司16批、上海天平藥廠3批、上海衡山藥業(yè)有限公司3批、上海新亞藥業(yè)有限公司15批、上海五洲藥廠3批、上海美優(yōu)制藥廠2批及香港澳美制藥廠7批。1.3 NIR光譜測量上海衡山藥業(yè)有限公司上海天平藥廠實驗室配制樣品上海新亞藥業(yè)有限公司香港澳美制藥廠上海美優(yōu)制藥廠上海五洲藥廠中美上海施貴寶制藥有限公司 5000 6000 7000

11、8000 9000 10000 Wavenumbers (cm-1) 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80Log(1/R)將膠囊粉末倒入同規(guī)格樣品瓶中，利用積分球漫反射采樣系統(tǒng)及Result操作軟件測量其NIR光譜。光譜采集條件：以儀器內置背景為參比，波數(shù)范圍100004000 cm-1，掃描次數(shù)40次，分辨率8 cm-1。圖1為7個不同廠家的樣品及一個實驗室樣品的原始NIR光譜圖。圖1來源于7個不同廠家的樣品的原始NIR漫反射光譜圖 Fig. 1 Original NIR spectra of 7 samples from different factorie

12、s2 方法與結果2.1 光譜預處理方法NIR光譜采集過程中，由于樣品顆粒大小、均勻性、儀器狀態(tài)等因素的影響，往往會導致光譜基線產生偏移或漂移，因此建模前原始光譜需經過預處理。最常用的預處理方法為將原始光譜做導數(shù)處理8。原始光譜經導數(shù)處理，一方面可以消除基線偏移，另一方面可放大光譜信號，但是由于此時噪聲信號也被放大，因此在對原始光譜求導之前，一般需對其進行平滑處理。圖2為樣品的原始NIR光譜經Norris derivative濾波和二階導數(shù)處理后的光譜圖，從圖中可以看出，原始光譜經導數(shù)處理后，可消除基線偏移，扣除本底吸收，從而更能體現(xiàn)樣品的光譜特征。-0.0005-0.0003-0.0001 0

13、.0001 0.0003 0.0005Log(1/R)-0.0007 5000 6000 7000 8000 9000 10000 Wavenumbers (cm-1)圖2 來源于7個不同廠家的樣品的二階導數(shù)光譜Fig. 1 Second derivative spectra of 7 samples from different factories2.2 7個廠家樣品NIR光譜的主成分分析 實驗中所用到的7個廠家樣品的原始光譜經前述預處理后，對其進行主成分分析（Principal Component Analysis，PCA），其中前兩個主成分反映了94.48%的信息。以第二主成分得分對第一

14、主成分得分作圖，如圖3所示?？傮w看來，8個廠家的樣品NIR信息在主成分空間上的分布具有比較明顯的差異，基于此，我們可以建立定性判別模型，以對各廠家樣品進行判別分析。由于本實驗中樣品數(shù)量較少，因此，沒有進行這一工作，但是，基于NIR光譜的定性分析方法卻具有良好的應用前景。圖3樣品在前兩個主成分中的得分分布構成的主成分空間中的分布中美上海施貴寶制藥有限公司；香港澳美制藥廠；上海五洲藥廠；上海新亞藥業(yè)有限公司；上海衡山藥業(yè)有限公司；上海天平藥廠；上海美優(yōu)制藥廠Fig.3 Plot of scores for the first and second PC of the 50 samples from

15、 7 different factories2.3 定量分析模型的建立 分別從30個實驗室樣品和50個工業(yè)樣品中隨機選取21個和39個樣品組成校正集，用于建立定量分析模型，其余20個樣品當作驗證樣品組成驗證集，用于驗證模型的預測效果。以校正集樣品的交叉驗證均方差(RMSECV)及其相對偏差（RSECV）為指標優(yōu)化建模參數(shù)，以對驗證集樣品的預測均方差（RMSEP）及其相對偏差(RSEP)考察模型的預測準確性，RMSECV、RSECV、RMSEP和RSEP的計算方法分別如下式：式中：是標準化學方法測得的值，是NIR預測值，是平均值，是校正集樣品數(shù)，m為驗證集樣品數(shù)。本文中所有的數(shù)據(jù)處理均在TQ A

16、nalyst6.2軟件中進行。2.3.1 建模方法的比較目前，NIR光譜定量分析中，最為常用的兩種建模方法是PCR和PLSR。PCR法是先對光譜數(shù)據(jù)矩陣進行正交分解，提取主成分信息，然后在樣品的濃度矩陣與主成分得分矩陣間建立回歸模型。與PCR不同的是，PLSR在對光譜數(shù)據(jù)矩陣進行正交分解時，引入了樣品濃度的信息，因此，它所提取出來的主成分信息與樣品濃度間具有更好的相關性，因此PLSR較PCR建立的模型的性能一般會更好。本文以軟件推薦使用的波數(shù)范圍（6173.34068.9cm-1）和二階導數(shù)光譜，分別以PLSR和PCR法建立了校正模型，結果如表1。表1 PLSR和PCR法建立的校正模型的比較T

17、able 1 Comparison of the calibration model established by PLSR and PCR建模方法RMSECVRSECVRMSEPRSEPPLSR2.853.721.321.74PCR4.696.134.055.35 由表1可以看出，用PLSR所建的模型得到的各個參數(shù)均優(yōu)于用PCR所建的模型。因此本文選定以PLSR建立最終的定量分析模型。 光譜范圍的選擇在確定了采用PLSR方法建立定量分析模型后，本文根據(jù)二階導數(shù)光譜圖不同譜區(qū)的光譜信息，選擇了波數(shù)范圍分別6173.3-4068.9cm-1、7541.6-4068.9 cm-1、9032.9-4

18、068.9 cm-1的3個不同譜區(qū)，對比了這三個譜區(qū)與儀器推薦使用的譜區(qū)（4180.9- 4084.5，4377.6- 4223.3，4805.7- 4713.2），結果見表2。表2光譜范圍對分析模型的影響Table 2 Influence of NIR spectra wavenumber ranges on calibration model序號光譜范圍（cm-1）RMSECVRSECVRMSEPRSEP12.853.721.321.7422.853.721.522.0132.733.571.511.9944180.9- 4084.5,4377.6- 4223.3,4805.7- 4713

19、.25.166.734.836.37從表2可以看出，綜合各項指標，本文擬選定6173.3 - 4068.9 cm-1波段為建模光譜范圍。2.4 驗證樣品的預測分析用前面所建立的定量校正模型對驗證集中20個樣品進行預測，預測值與真值的相關圖譜見圖4。從圖中可見，20個驗證樣品的NIR預測值能夠很好地逼近實際值，相關系數(shù)R達到了0.9968，RMSEP、RSEP分別為1.35%、1.74%。RMSEP=1.35 RSEP=1.74%R=0.9968圖5 校正集樣品與驗證樣品真實值與預測值相關圖Fig.5 Scatter plots showing correlation between actua

20、l value and predicted value on the calibrated model表3中列出了驗證集中分別來源于7個廠家的12個樣品主藥含量的NIR預測值與真值及其偏差。從中可以看出，各個廠家的真實值與預測值都比較接近，其相對偏差最大的為1.93%，最小的為0.20%，均小于定量分析允許的誤差。由此可見，所建的模型能夠準確地測定這7個廠家的樣品。表3 7個廠家12個頭孢拉定膠囊樣品中主藥含量真實值與預測值的比較Table 3 Comparison between actual value and predicted value on the calibrated model

21、 樣品來源真實值預測值相對偏差（%）樣品來源真實值預測值相對偏差（%）上海新亞藥業(yè)有限公司84.1886.270.64中美上海施貴寶制藥有限公司82.7082.360.2086.0484.950.6481.6082.450.5284.1186.191.2283.7082.140.94香港澳美制藥廠70.7573.531.93上海衡山藥業(yè)89.7889.400.2170.1571.040.62上海五洲藥廠78.9978.520.30上海天平藥廠83.1282.130.60上海美優(yōu)制藥廠83.6881.131.552.5 加樣回收率測定任意選取中美上海施貴寶制藥有限公司提供的一批樣品，加入頭孢拉定

22、原料適量，混合均勻后采集其近紅外光譜。用前述的模型對其含量進行預測分析，以測試加樣回收率，所得的結果如表4。加樣回收率范圍為98.58% 100.34%，平均回收率為99.7%，RSD為0.7%。表4 加樣回收率實驗結果Table 4 Result of recovery test編號樣品濃度（%）測得濃度（）回收率（）189.5689.58100.02289.5989.5799.98389.6988.4298.58489.5889.88100.34589.6489.75100.12689.5088.5998.98平均99.7RSD（n=6）0.73 結論本文建立了快速測定頭孢拉定膠囊中主藥含

23、量的NIR漫反射光譜分析方法，結果表明，該方法準確可靠，加樣回收率也良好。NIR光譜分析是一種二次分析方法，它的適用性和推廣能力與校正集中樣品的代表性具有很大關系。因此，定量分析模型的建立對校正集樣品化學組成的分布范圍有一定要求，但實際上，工業(yè)上收集到的制劑樣品化學組成范圍往往都很小，為此，本文采用了工業(yè)樣品和實驗室配置樣品相結合的方法，以擴大校正集樣品化學組成的分布范圍，取得了良好效果。在本文的實驗中還發(fā)現(xiàn)，NIR光譜分析技術除了可用于對樣品進行快速、無損地定量分析外，它在定性分析方面也具有良好的應用前景。參考文獻1 John D.Kirsch，James K. Drennen. Deter

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