近紅外漫反射光譜法定量分析頭孢拉定膠囊

1、近紅外漫反射光譜法定量分析頭孢拉定膠囊潘穎1 沈漪1 項(xiàng)競佐1 劉全21上海市藥品檢驗(yàn)所抗生素室， 上海2002332 美國Thermo Nicolet儀器公司上海代表處，上海200031摘要 目的：采用近紅外（NIR）漫反射光譜法對不同生產(chǎn)廠家的頭孢拉定膠囊進(jìn)行快速定量分析。方法：按頭孢拉定膠囊配方組成配制含主藥頭孢拉定濃度范圍從5.01% 91.24%的30個(gè)實(shí)驗(yàn)室樣品，并收集來源于7個(gè)廠家的49批工業(yè)樣品，采集其NIR光譜。采用偏最小二乘回歸法建立NIR光譜信息與樣品組成間的定量分析模型，將其用于對驗(yàn)證樣品進(jìn)行預(yù)測分析，并對該方法的加樣回收率進(jìn)行考察。結(jié)果：定量分析模型對21驗(yàn)證樣品的的

2、預(yù)測均方差RMSEP為1.35%，預(yù)測值與真值的相關(guān)系數(shù)R為0.9968，加樣平均回收率為99.7%，RSD為0.7%（n=6）。結(jié)論：用近紅外漫反射光譜法對頭孢拉定膠囊進(jìn)行定量分析的方法簡便快速，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可推廣用于工業(yè)現(xiàn)場的實(shí)時(shí)在線檢測。關(guān)鍵詞 近紅外漫反射光譜法 頭孢拉定膠囊 偏最小二乘回歸 定量分析Quantitative Analysis of Cefradine Capsule by Near-infrared SpectroscopyPan Ying1, Shen Yi1, Xiang Jingzuo1, Liu Quan2(1. Shanghai Institute for

3、 Drug Control, Shanghai 200233)(2. Thermo Nicolet Corporation Shanghai Representative Office, Shanghai 200031)Abstract Objective To determine the principal component in cefradine capsule by near-infrared(NIR) spectroscopy. Method 30 samples with a concentration range from 5.01% to 91.24% for cefradi

4、ne were prepared in laboratory and 49 industry samples from 7 different factories were collected. Then their NIR spectra were collected on an Antaris FT-NIR analyzer. Partial least square regression (PLSR) algorithm was used to build the calibration model between the concentration of 59 calibration

5、samples and their NIR spectra. At last, the model was validated by the other 20 validation samples. The recovery of the method has also been examined. Result The root mean square error of prediction (RMSEP) was 1.35%. The correlation coefficient between the true value and prediction value was 0.9968

6、. The average recovery was 99.7% (RSD 0.67%, n=6). Conclusion The results show that the presented method is convenient, fast and has a good performance and can be applied to on-line detection in industrial process.Key words Near -Infrared Spectroscopy; Cefradine capsules; Partial least square regres

7、sion (PLSR); Quantitative analysis 近紅外（near-infrared，NIR）光譜技術(shù)是一種快速、無損分析方法，其光譜波長范圍是7802500nm（110004000cm-1），主要譜峰為有機(jī)物分子C-H、N-H和O-H等含氫基團(tuán)的倍頻與合頻振動(dòng)吸收所產(chǎn)生，光譜特性穩(wěn)定，非常適合于藥品原輔料及制劑的定性定量分析1-5。近幾年來，得益于化學(xué)計(jì)量學(xué)、電子計(jì)算機(jī)及軟件的發(fā)展，尤其是基于多變量數(shù)據(jù)分析的化學(xué)計(jì)量學(xué)的發(fā)展，使得NIR光譜中的大量信息能夠被解釋，這一技術(shù)因此而得到了廣泛的應(yīng)用。與傳統(tǒng)的化學(xué)分析方法相比，NIR光譜技術(shù)具有分析迅速、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，它無需預(yù)

8、處理即可測定多種狀態(tài)的樣品，如粉末、完整片劑及膠囊、完整的生物組織、漿液、混懸液等6。 頭孢拉定為第一代頭孢菌素，主要作用于革蘭氏陽性菌包括耐青霉素金葡菌，臨床主要治療敏感細(xì)菌所致的呼吸道感染、生殖泌尿系統(tǒng)感染、軟組織感染等7。頭孢拉定膠囊臨床應(yīng)用廣泛，目前國內(nèi)也有很多廠家生產(chǎn)。各個(gè)生產(chǎn)廠家的產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊，更有不法之徒銷售假藥、劣藥?，F(xiàn)行的中國藥典檢測方法為高效液相色譜法，該方法需進(jìn)行復(fù)雜的樣品制備和預(yù)處理工作，分析時(shí)間較長，難以適用于工業(yè)現(xiàn)場的實(shí)時(shí)在線分析。 本文以某一廠家的頭孢拉定膠囊處方組成配制了30個(gè)實(shí)驗(yàn)室樣品，并收集了來源于7個(gè)廠家的50批工業(yè)樣品，分別采集其NIR漫反射光譜。比

9、較研究分別以主成分回歸（Principle component regression，PCR）法和偏最小二乘回歸（Partial least squares regression，PLSR）法建立定量分析模型，然后將此模型用于對驗(yàn)證樣品含量進(jìn)行預(yù)測，并考察該方法的加樣回收率。結(jié)果證明，該方法結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可大大縮短定量檢測的時(shí)間，達(dá)到快速分析的效果，可推廣用于工業(yè)現(xiàn)場的實(shí)時(shí)在線分析。1 實(shí)驗(yàn)1.1 儀器與試藥 Antaris傅立葉變換NIR光譜儀（美國Thermo Nicolet公司），配有積分球漫反射采樣系統(tǒng)，Result操作軟件，TQ Analyst 6.2光譜分析軟件；頭孢拉定原料（純度

10、95.6%），輔料硬脂酸鎂、滑石粉、乳糖為藥用規(guī)格。1.2 樣品準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)室樣品配制：按某一廠家頭孢拉定膠囊處方組成配制含主藥頭孢拉定濃度范圍從5.01% 91.24%的30個(gè)實(shí)驗(yàn)室樣品。工業(yè)樣品收集：頭孢拉定膠囊樣品共49批來源于7個(gè)廠家，它們分別是中美上海施貴寶制藥有限公司16批、上海天平藥廠3批、上海衡山藥業(yè)有限公司3批、上海新亞藥業(yè)有限公司15批、上海五洲藥廠3批、上海美優(yōu)制藥廠2批及香港澳美制藥廠7批。1.3 NIR光譜測量上海衡山藥業(yè)有限公司上海天平藥廠實(shí)驗(yàn)室配制樣品上海新亞藥業(yè)有限公司香港澳美制藥廠上海美優(yōu)制藥廠上海五洲藥廠中美上海施貴寶制藥有限公司 5000 6000 7000

11、8000 9000 10000 Wavenumbers (cm-1) 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80Log(1/R)將膠囊粉末倒入同規(guī)格樣品瓶中，利用積分球漫反射采樣系統(tǒng)及Result操作軟件測量其NIR光譜。光譜采集條件：以儀器內(nèi)置背景為參比，波數(shù)范圍100004000 cm-1，掃描次數(shù)40次，分辨率8 cm-1。圖1為7個(gè)不同廠家的樣品及一個(gè)實(shí)驗(yàn)室樣品的原始NIR光譜圖。圖1來源于7個(gè)不同廠家的樣品的原始NIR漫反射光譜圖 Fig. 1 Original NIR spectra of 7 samples from different factorie

12、s2 方法與結(jié)果2.1 光譜預(yù)處理方法NIR光譜采集過程中，由于樣品顆粒大小、均勻性、儀器狀態(tài)等因素的影響，往往會(huì)導(dǎo)致光譜基線產(chǎn)生偏移或漂移，因此建模前原始光譜需經(jīng)過預(yù)處理。最常用的預(yù)處理方法為將原始光譜做導(dǎo)數(shù)處理8。原始光譜經(jīng)導(dǎo)數(shù)處理，一方面可以消除基線偏移，另一方面可放大光譜信號，但是由于此時(shí)噪聲信號也被放大，因此在對原始光譜求導(dǎo)之前，一般需對其進(jìn)行平滑處理。圖2為樣品的原始NIR光譜經(jīng)Norris derivative濾波和二階導(dǎo)數(shù)處理后的光譜圖，從圖中可以看出，原始光譜經(jīng)導(dǎo)數(shù)處理后，可消除基線偏移，扣除本底吸收，從而更能體現(xiàn)樣品的光譜特征。-0.0005-0.0003-0.0001 0

13、.0001 0.0003 0.0005Log(1/R)-0.0007 5000 6000 7000 8000 9000 10000 Wavenumbers (cm-1)圖2 來源于7個(gè)不同廠家的樣品的二階導(dǎo)數(shù)光譜Fig. 1 Second derivative spectra of 7 samples from different factories2.2 7個(gè)廠家樣品NIR光譜的主成分分析 實(shí)驗(yàn)中所用到的7個(gè)廠家樣品的原始光譜經(jīng)前述預(yù)處理后，對其進(jìn)行主成分分析（Principal Component Analysis，PCA），其中前兩個(gè)主成分反映了94.48%的信息。以第二主成分得分對第一

14、主成分得分作圖，如圖3所示?？傮w看來，8個(gè)廠家的樣品NIR信息在主成分空間上的分布具有比較明顯的差異，基于此，我們可以建立定性判別模型，以對各廠家樣品進(jìn)行判別分析。由于本實(shí)驗(yàn)中樣品數(shù)量較少，因此，沒有進(jìn)行這一工作，但是，基于NIR光譜的定性分析方法卻具有良好的應(yīng)用前景。圖3樣品在前兩個(gè)主成分中的得分分布構(gòu)成的主成分空間中的分布中美上海施貴寶制藥有限公司；香港澳美制藥廠；上海五洲藥廠；上海新亞藥業(yè)有限公司；上海衡山藥業(yè)有限公司；上海天平藥廠；上海美優(yōu)制藥廠Fig.3 Plot of scores for the first and second PC of the 50 samples from

15、 7 different factories2.3 定量分析模型的建立 分別從30個(gè)實(shí)驗(yàn)室樣品和50個(gè)工業(yè)樣品中隨機(jī)選取21個(gè)和39個(gè)樣品組成校正集，用于建立定量分析模型，其余20個(gè)樣品當(dāng)作驗(yàn)證樣品組成驗(yàn)證集，用于驗(yàn)證模型的預(yù)測效果。以校正集樣品的交叉驗(yàn)證均方差(RMSECV)及其相對偏差（RSECV）為指標(biāo)優(yōu)化建模參數(shù)，以對驗(yàn)證集樣品的預(yù)測均方差（RMSEP）及其相對偏差(RSEP)考察模型的預(yù)測準(zhǔn)確性，RMSECV、RSECV、RMSEP和RSEP的計(jì)算方法分別如下式：式中：是標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)方法測得的值，是NIR預(yù)測值，是平均值，是校正集樣品數(shù)，m為驗(yàn)證集樣品數(shù)。本文中所有的數(shù)據(jù)處理均在TQ A

16、nalyst6.2軟件中進(jìn)行。2.3.1 建模方法的比較目前，NIR光譜定量分析中，最為常用的兩種建模方法是PCR和PLSR。PCR法是先對光譜數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行正交分解，提取主成分信息，然后在樣品的濃度矩陣與主成分得分矩陣間建立回歸模型。與PCR不同的是，PLSR在對光譜數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行正交分解時(shí)，引入了樣品濃度的信息，因此，它所提取出來的主成分信息與樣品濃度間具有更好的相關(guān)性，因此PLSR較PCR建立的模型的性能一般會(huì)更好。本文以軟件推薦使用的波數(shù)范圍（6173.34068.9cm-1）和二階導(dǎo)數(shù)光譜，分別以PLSR和PCR法建立了校正模型，結(jié)果如表1。表1 PLSR和PCR法建立的校正模型的比較T

17、able 1 Comparison of the calibration model established by PLSR and PCR建模方法RMSECVRSECVRMSEPRSEPPLSR2.853.721.321.74PCR4.696.134.055.35 由表1可以看出，用PLSR所建的模型得到的各個(gè)參數(shù)均優(yōu)于用PCR所建的模型。因此本文選定以PLSR建立最終的定量分析模型。 光譜范圍的選擇在確定了采用PLSR方法建立定量分析模型后，本文根據(jù)二階導(dǎo)數(shù)光譜圖不同譜區(qū)的光譜信息，選擇了波數(shù)范圍分別6173.3-4068.9cm-1、7541.6-4068.9 cm-1、9032.9-4

18、068.9 cm-1的3個(gè)不同譜區(qū)，對比了這三個(gè)譜區(qū)與儀器推薦使用的譜區(qū)（4180.9- 4084.5，4377.6- 4223.3，4805.7- 4713.2），結(jié)果見表2。表2光譜范圍對分析模型的影響Table 2 Influence of NIR spectra wavenumber ranges on calibration model序號光譜范圍（cm-1）RMSECVRSECVRMSEPRSEP12.853.721.321.7422.853.721.522.0132.733.571.511.9944180.9- 4084.5,4377.6- 4223.3,4805.7- 4713

19、.25.166.734.836.37從表2可以看出，綜合各項(xiàng)指標(biāo)，本文擬選定6173.3 - 4068.9 cm-1波段為建模光譜范圍。2.4 驗(yàn)證樣品的預(yù)測分析用前面所建立的定量校正模型對驗(yàn)證集中20個(gè)樣品進(jìn)行預(yù)測，預(yù)測值與真值的相關(guān)圖譜見圖4。從圖中可見，20個(gè)驗(yàn)證樣品的NIR預(yù)測值能夠很好地逼近實(shí)際值，相關(guān)系數(shù)R達(dá)到了0.9968，RMSEP、RSEP分別為1.35%、1.74%。RMSEP=1.35 RSEP=1.74%R=0.9968圖5 校正集樣品與驗(yàn)證樣品真實(shí)值與預(yù)測值相關(guān)圖Fig.5 Scatter plots showing correlation between actua

20、l value and predicted value on the calibrated model表3中列出了驗(yàn)證集中分別來源于7個(gè)廠家的12個(gè)樣品主藥含量的NIR預(yù)測值與真值及其偏差。從中可以看出，各個(gè)廠家的真實(shí)值與預(yù)測值都比較接近，其相對偏差最大的為1.93%，最小的為0.20%，均小于定量分析允許的誤差。由此可見，所建的模型能夠準(zhǔn)確地測定這7個(gè)廠家的樣品。表3 7個(gè)廠家12個(gè)頭孢拉定膠囊樣品中主藥含量真實(shí)值與預(yù)測值的比較Table 3 Comparison between actual value and predicted value on the calibrated model

21、 樣品來源真實(shí)值預(yù)測值相對偏差（%）樣品來源真實(shí)值預(yù)測值相對偏差（%）上海新亞藥業(yè)有限公司84.1886.270.64中美上海施貴寶制藥有限公司82.7082.360.2086.0484.950.6481.6082.450.5284.1186.191.2283.7082.140.94香港澳美制藥廠70.7573.531.93上海衡山藥業(yè)89.7889.400.2170.1571.040.62上海五洲藥廠78.9978.520.30上海天平藥廠83.1282.130.60上海美優(yōu)制藥廠83.6881.131.552.5 加樣回收率測定任意選取中美上海施貴寶制藥有限公司提供的一批樣品，加入頭孢拉定

22、原料適量，混合均勻后采集其近紅外光譜。用前述的模型對其含量進(jìn)行預(yù)測分析，以測試加樣回收率，所得的結(jié)果如表4。加樣回收率范圍為98.58% 100.34%，平均回收率為99.7%，RSD為0.7%。表4 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Result of recovery test編號樣品濃度（%）測得濃度（）回收率（）189.5689.58100.02289.5989.5799.98389.6988.4298.58489.5889.88100.34589.6489.75100.12689.5088.5998.98平均99.7RSD（n=6）0.73 結(jié)論本文建立了快速測定頭孢拉定膠囊中主藥含

23、量的NIR漫反射光譜分析方法，結(jié)果表明，該方法準(zhǔn)確可靠，加樣回收率也良好。NIR光譜分析是一種二次分析方法，它的適用性和推廣能力與校正集中樣品的代表性具有很大關(guān)系。因此，定量分析模型的建立對校正集樣品化學(xué)組成的分布范圍有一定要求，但實(shí)際上，工業(yè)上收集到的制劑樣品化學(xué)組成范圍往往都很小，為此，本文采用了工業(yè)樣品和實(shí)驗(yàn)室配置樣品相結(jié)合的方法，以擴(kuò)大校正集樣品化學(xué)組成的分布范圍，取得了良好效果。在本文的實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，NIR光譜分析技術(shù)除了可用于對樣品進(jìn)行快速、無損地定量分析外，它在定性分析方面也具有良好的應(yīng)用前景。參考文獻(xiàn)1 John D.Kirsch，James K. Drennen. Deter

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