浙江漢族DEL表型基因分型方法的建立

1、浙江漢族DEL表型基因分型方法的建立 08-03-07 14:12:00 編輯：studa20 作者：吳俊杰，洪小珍，馬開榮，許先國，傅啟華，嚴(yán)力行【摘要】 為了快速鑒定DEL表型，建立浙江漢族DEL表型的基因分型方法，根據(jù)RHD 1227A等位基因序列設(shè)計(jì)等位基因特異性-聚合酶鏈反應(yīng)(allele specific - polymerase chain reaction, AS-PCR)，用于DEL表型的基因分型。用已知RHD 1227A多態(tài)性的樣本和已知DEL表型的樣本評(píng)價(jià)基因分型方法的靈敏度和特異性。結(jié)果表明：在50例RHD 1227A陽性和50例RHD 1227A陰性的Rh陰性樣本中基

2、因分型方法的靈敏度和特異性都是100；在33例DEL陽性樣本和89例DEL陰性的樣本中，基因分型方法的靈敏度為100，有2例樣本血清學(xué)結(jié)果為陰性而基因分型結(jié)果為陽性，重新用血清學(xué)方法和序列分析方法復(fù)核這2例樣本，發(fā)現(xiàn)2例都是血清學(xué)漏檢，因而基因分型方法的特異性是100。 結(jié)論： 設(shè)計(jì)的基因分型方法可以有效地鑒定浙江漢族Rh陰性人群中的DEL表型。 【關(guān)鍵詞】 DEL表型； RHD 1227A等位基因； 基因分型Establishment of Genotyping Method for DEL Phenotype in Zhejiang Han PopulationAbstract In or

3、der to establish a genotyping method for DEL phenotype in Zhejiang Han population, an AS-PCR method was developed according to the RHD 1227A allele sequence. Its specificity and sensitivity were assessed in two Rh negative populations whose RHD 1227A or DEL phenotype status was known. The results sh

4、owed that in evaluation of the method by detecting 50 RHD 1227A positive and 50 RHD 1227A negative individuals, the genotyping method displayed a sensitivity of 100% and a specificity of 100%; in evaluation of the method by detecting 33 DEL positive and 89 DEL negative individuals, the sensitivity w

5、as 100%, however, there were two serologically negative samples which were confirmed as positive using genotyping method. After re-testing these two samples with serological method and sequence analysis, it was found that original serological method gave false negative results and genotyping method

6、still showed 100% specificity. The minimal target DNA concentration of this genotyping method is 8.13 ng/l. In conclusion, designed genotyping method can be used to identify DEL phenotype efficiently in Zhejiang Han Rh negative population.Key wordsDEL phenotype; RHD 1227A allele; GenotypingRh血型中D抗原在

7、輸血醫(yī)學(xué)和產(chǎn)科學(xué)中意義最為顯著。最近的研究發(fā)現(xiàn)，DEL表型（一種極弱表達(dá)的D抗原，只有通過吸收釋放的方法才能檢測到，稱為DEL抗原）的血液輸注給Rh陰性患者仍會(huì)產(chǎn)生抗D免疫反應(yīng)1，因此，對(duì)DEL抗原的免疫原性應(yīng)予以重視2-4。目前常用的血清學(xué)DEL表型鑒定方法由于步驟繁瑣而不適合臨床大規(guī)模應(yīng)用，如何快速有效的鑒定DEL表型已成為一個(gè)具有重要臨床意義的課題。我們的研究發(fā)現(xiàn)，浙江漢族DEL表型和RHD 1227A相關(guān)（未發(fā)表研究結(jié)果）。根據(jù)RHD 1227A等位基因序列，我們?cè)O(shè)計(jì)了1種AS-PCR方法，通過檢測100例RHD 1227A多態(tài)性已知的Rh陰性樣本和122例DEL表型已知的樣本，對(duì)該方

8、法用于浙江漢族Rh陰性人群中DEL表型基因分型的適用性進(jìn)行評(píng)價(jià)。材料和方法對(duì)象在浙江省居住或者工作的無親緣關(guān)系Rh陰性漢族獻(xiàn)血員222例，包括50例RHD 1227A陽性和50例RHD 1227A陰性（參照參考文獻(xiàn)5，序列分析確定RHD 1227A位點(diǎn)的多態(tài)性）、33例DEL陽性和89例DEL陰性(DEL表型采用氯仿釋放的方法鑒定，見參考文獻(xiàn)6)。Rh表型血清學(xué)鑒定RhD表型鑒定采用常規(guī)鹽水平板法，使用加拿大Dominion公司的IgM和IgG混合的抗D試劑。RhC、Rhc、RhE和Rhe鑒定采用鹽水試管法，試劑為Dominion公司的相應(yīng)單克隆抗體。基因分型根據(jù)RHD基因和RHD 1227A

9、等位基因相關(guān)序列設(shè)計(jì)一組特異擴(kuò)增RHD 1227A等位基因的引物：RHDEL-s: 5-GACCAAGTTTTCTGGAAA-3 （位置對(duì)應(yīng)于AJ299028的68-85）、RHDEL-a: 5-CGAGAG-AATTTTGAGCAC-3 （位置對(duì)應(yīng)于AB035185的849-832）。1對(duì)特異擴(kuò)增人生長激素基因429 bp的引物作為內(nèi)對(duì)照，HGH-s： 5-GCCTTCCCAACCATTCCCTTA-3; HGH-a： 5-TCACGGATTTCTGTTGTGTTT-3。反應(yīng)總體積10 l，含模板DNA 0.2 l（約含DNA 50-60 ng），特異性引物終濃度250 nmol/L，內(nèi)對(duì)照

10、引物終濃度50 nmol/L，MgCl2 終濃度1.5 mmol/L，dNTP終濃度 200 mol/L，Taq酶0.2 U（TaKaRa公司產(chǎn)品）。PCR擴(kuò)增條件： 95預(yù)變性5分鐘，然后94 變性30秒、58 退火30秒和72 延伸50秒，循環(huán)30次，最后72延伸5分鐘。產(chǎn)物通過2瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像儀（Syngene公司產(chǎn)品，英國）觀察結(jié)果。基因分型方法DNA濃度檢測下限評(píng)估將RHD 1227A陽性的DNA用BioPhotometer（Eppendorf公司產(chǎn)品，德國）測得濃度，用RHD 1227A陰性的DNA作為稀釋液，倍比稀釋RHD 1227A陽性樣本。稀釋后DNA的PCR產(chǎn)物通過2瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像儀（Syngene公司產(chǎn)品，英國）觀察結(jié)果。結(jié)果RHD 1227A多態(tài)性已知的Rh陰性人群在100例Rh陰性