細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期

1、研究細(xì)胞生命活動的流研究細(xì)胞生命活動的流式解決方案式解決方案 techuniv丁 瑋瑋細(xì)胞凋亡概述細(xì)胞凋亡概述又稱為程序性細(xì)胞死亡又稱為程序性細(xì)胞死亡 (Programmed Cell Death) 是機(jī)體是機(jī)體主動的、高主動的、高度有序度有序地清除無用細(xì)胞的過程。和地清除無用細(xì)胞的過程。和細(xì)胞壞死細(xì)胞壞死 (Necrosis) 相區(qū)別，壞死相區(qū)別，壞死是細(xì)胞受到強(qiáng)烈理化或生物因素作用引起細(xì)胞無序變化的死亡過程是細(xì)胞受到強(qiáng)烈理化或生物因素作用引起細(xì)胞無序變化的死亡過程。薄膜有小泡狀形成薄膜有小泡狀形成細(xì)胞凋亡與疾病的關(guān)系細(xì)胞凋亡與疾病的關(guān)系3細(xì)胞凋亡事件發(fā)生表細(xì)胞凋亡

2、事件發(fā)生表細(xì)胞膜事件線粒體事件Caspase事件細(xì)胞核事件1. 細(xì)胞膜變化的檢測：細(xì)胞膜變化的檢測：Annexin V/PI磷脂酰絲氨酸磷脂酰絲氨酸 (PS) 的檢測：早期凋亡的檢測：早期凋亡早期凋亡早期凋亡PS檢測及結(jié)果判定檢測及結(jié)果判定早期凋亡特征：早期凋亡特征：磷脂膜(PS)外翻，但是細(xì)胞膜保持完整性，因此PI染色為陰性DNA沒有發(fā)生斷裂早期凋亡早期凋亡PS檢測及結(jié)果判定檢測及結(jié)果判定Annexin V-FITCPI細(xì)胞膜變化的檢測：細(xì)胞膜變化的檢測：Annexin V/PI優(yōu)點：優(yōu)點：簡便、快速、準(zhǔn)確區(qū)分活細(xì)胞、凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞樣本設(shè)置：樣本設(shè)置：1. 空白對照：空白對照：輔助判斷管

3、，即不加Annexin V/PI，但用它調(diào)電壓的話，電壓偏高，即根據(jù)它確定的陰陽性界限是偏低的。2. 單陽樣本：單陽樣本：誘導(dǎo)凋亡，Annexin V單染，用來調(diào)補(bǔ)償3. 單陽樣本：單陽樣本：誘導(dǎo)凋亡，PI單染，用來調(diào)補(bǔ)償注意事項：注意事項：1. 細(xì)胞制備或儲存時細(xì)胞膜損傷，造成假陽性2. 貼壁細(xì)胞消化時避免使用EDTA，螯合鈣離子BD Annexin V 流式檢測試劑盒流式檢測試劑盒KitCat no.Annexin V:FITC Apoptosis Detection Kit I556547Annexin V:FITC Apoptosis Detection Kit II-Contains

4、 unlabeled recomb. Annexin V556570Annexin V:PE Apoptosis Detection Kit I559763提供FITC, PE, APC,CY5,CY5.5, BD Horizon V450, BD Horizon V500等多種熒光標(biāo)記的Annexin V以及純凈的Annexin V。Annexin V檢測常見問題檢測常見問題1. 是否 Annexin V Kits 可以檢測小鼠或其他物種? Annexin V試劑盒可以檢測多種屬2. 這個試劑盒是否可用于貼壁細(xì)胞、固定或凍存的細(xì)胞、或組織? No. 上述樣本的細(xì)胞細(xì)胞膜都會或多或少受到損害，

5、這樣的樣本建議用免疫熒光技術(shù) (Cat. No. 550911) 3. 是否與細(xì)胞表面標(biāo)記兼容? CD11B/MAC-1 LY-71 只要Ca離子不影響該表面Marker就可以同時做2. 線粒體水平的檢測線粒體水平的檢測激活Caspase 9激活Caspase 3啟動細(xì)胞凋亡 凋亡與線粒體膜電位的去極化相關(guān) BD Mitoscreen (JC-1) Cat# 551302 25 tests JC-1: 可穿透細(xì)胞膜的親脂性陽離子熒光素 原理：原理： JC-1在正常細(xì)胞中以聚合體形式存在于線粒體基質(zhì)上產(chǎn)生紅色熒光（FL-2 Channel）； 細(xì)胞凋亡時，線粒體膜電位發(fā)生去極化，膜電位降低，JC

6、-1 以單體形式存在于胞漿內(nèi)，熒光 強(qiáng)度減弱甚至消失 （只能在FL1通道檢測到），故用熒光信號的變化判別凋亡的發(fā)生。p 操作簡單，試劑直接加入細(xì)胞中，操作簡單，試劑直接加入細(xì)胞中，20分鐘后檢測分鐘后檢測2. 線粒體水平的檢測線粒體水平的檢測JC-1檢測結(jié)果流式圖檢測結(jié)果流式圖JC-1 (Fl-1)Jurkat T CellsMouse ThymocytesControl StaurosporineCamptothecinFas mAbR1R2R1R2R1R2R1R2R1R2R1R2Control JC-1 (Fl-2)3. 凋亡相關(guān)酶的檢測凋亡相關(guān)酶的檢測- Caspase 背景知識背景知識

7、 細(xì)胞凋亡過程中，胞內(nèi)主要蛋白通常被降解，調(diào)節(jié)這一過程的蛋白叫做Caspase（半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶） Caspase 3是參與DNA維護(hù)和調(diào)控細(xì)胞的重要組分，即Caspase 3激活=細(xì)胞凋亡 檢測原理：是通過特異性抗體檢測全長或者剪切后的Caspase活性。Jurkat T-Cells 6 M camptothecin for 4 h untreated Caspase-3 data（IHC） Caspase-3 data（FCM） Jurkat T-Cells Mouse ThymocytesFITC Active Caspase-3 Apoptosis KitCat No.FITC

8、 Active Caspase-3 Apoptosis Kit550480PE Active Caspase-3 Apoptosis Kit550914Caspase-3 Kits4. 細(xì)胞核細(xì)胞核DNA檢測檢測 凋亡晚期DNA內(nèi)切酶活性被激活升高，雙鏈DNA在核小體之間切斷形成185bp為基數(shù)的有序片段。檢測方法Tunel流式法:通過在核酸片段末端標(biāo)記計算凋亡百分比末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)細(xì)胞核細(xì)胞核DNA檢測原理：檢測原理：APO-BrdUTdT: 脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶Brd UTP的滲入率顯著高于dUTP，因此檢測靈敏度高TUNEL法法: 流式分析晚期凋亡流式分析晚期凋亡APO-DIREC

9、T KIT 50 tests cat. 556381Part A (store at 4) Part B (store at 20)PI/Rnase staining buffer FITC-dUTPReaction buffer Negative control cellsRising buffer Positive control cellsWash buffer TdT Enzyme實驗用2種染料PI染色總DNA：得到細(xì)胞周期的信息；FITC-dUTP染色凋亡細(xì)胞：檢測凋亡。在流式細(xì)胞儀488nm激發(fā)下，PI發(fā)射約623nm熒光，F(xiàn)ITC發(fā)射520nm熒光。 APO-BrdU KIT 6

10、0 tests cat. 556405Part A (store at 4) Part B (store at 20)FITC-Labeled Anti-BrdU mAb Br-dUTPPI/Rnase staining bufferReaction buffer Negative control cellsRising buffer Positive control cellsWash buffer TdT EnzymePI染色檢測細(xì)胞周期FITC染色檢測凋亡（如果不需要周期信息，則可不做PI染色步驟） TUNEL法法: 流式分析晚期凋亡流式分析晚期凋亡21BD流式系列課堂流式系列課堂-1：研究細(xì)胞生命活動的流研究細(xì)胞生命活動的流式解決方案式解決方案 DNA含量與細(xì)胞周期含量與細(xì)胞周期檢測原理檢測原理利用特殊的熒光染料(PI等)與細(xì)胞內(nèi)DNA堿基結(jié)合，被這些熒光染料染色的細(xì)胞在激光照射下發(fā)射出熒光，熒光強(qiáng)度與DNA含量成正比。流式細(xì)胞儀通過測定細(xì)胞的熒光強(qiáng)度推算出細(xì)胞的DNA含量。PI染色細(xì)胞周期樣本檢測細(xì)胞周期樣本檢測結(jié)果分析結(jié)果分析CellQuest、WinMDI等軟件均可以進(jìn)行分析，但需要手工進(jìn)行參數(shù)統(tǒng)計和計算；推薦使用ModFit分析軟件（分析如下：）1. 打開軟件；2. 在FL2-W/FL2-A散點圖中設(shè)定單個細(xì)胞門（R1），去除聚集細(xì)胞，必要