雙分子熒光互補技術(BiFC)

1、精選文檔雙分子熒光互補技術（BiFC）一、技術簡介BiFC是由Hu 等在2002 年最先報道的一種直觀、快速地推斷目標蛋白在活細胞中的定位和相互作用的新技術1. 有報道在GFP 的兩個片層之間的環(huán)結構（loop）上有很多特異位點可以插入外源蛋白而不影響GFP的熒光活性，BiFC技術正是利用該熒光蛋白家族的這一特性，將熒光蛋白分割成兩個不具有熒光活性的分子片段，再分別與目標蛋白連接。假如兩個目標蛋白由于有相互作用而接近，就使得熒光蛋白的兩個分子片段在空間上相互靠近，重新形成活性的熒光基因而發(fā)出熒光。在熒光顯微鏡下，就能直接觀看到兩目標蛋白是否具有相互作用，并且在最接近活細胞生理狀態(tài)的條件下觀看到

2、其相互作用發(fā)生的時間、位置、強弱、所形成蛋白復合物的穩(wěn)定性，以及細胞信號分子對其相互作用的影響等，這些信息對爭辯蛋白質(zhì)相互作用有重要意義。其后進展出的多色熒光互補技(multicolor BiFC)，不僅能同時檢測到多種蛋白質(zhì)復合體的形成，還能夠?qū)Σ煌鞍踪|(zhì)間產(chǎn)生相互作用的強弱進行比較.這項技術不需要特殊的設備，相互作用的蛋白也不需要特殊的理論配比。因此，BiFC技術已被國際上眾多試驗室接受，在活細胞內(nèi)證明蛋白質(zhì)的相互作用。本試驗室成功應用該技術爭辯轉(zhuǎn)錄因子c-Jun、ATF2和c-Fos在原代神經(jīng)元中的競爭性相互作用2。BiFC技術以下幾個特點使其對于爭辯蛋白質(zhì)相互作用具有獨特的優(yōu)勢：1、能

3、在顯微鏡下直接觀看到蛋白相互作用而且不依靠于其它次級效應；2、該相互作用可以在活細胞中進行觀看，排解了由于細胞裂解或固定可能帶來的假陽性結果；3、蛋白質(zhì)在近似生理條件的環(huán)境下表達，表達水平及特性如翻譯后修飾極大地接近于內(nèi)源蛋白；4、不需要蛋白質(zhì)有特殊的理論配比，能檢測到不同亞群蛋白質(zhì)間的相互作用；5、多色BiFC技術不僅能同時檢測到多種蛋白質(zhì)復合體的形成，還能夠?qū)Σ煌鞍踪|(zhì)間產(chǎn)生相互作用的強弱進行比較；6、BiFC技術除了熒光倒置顯微鏡外，不要求特殊的設備。試驗簡潔、快捷、直觀，并適用于原核、真菌、植物、動物等多種組織、細胞. 該技術的完善與進展必定會為蛋白質(zhì)組學、蛋白質(zhì)相互作用連鎖圖的建立帶

4、來福音. 但是，該技術與大多檢測蛋白質(zhì)相互作用的技術一樣，也存在著假陰性和假陽性的問題，需要在試驗中認真驗證。二、試驗步驟：1. 將目的基因插入到含有N片段或C片段的載體中，構建成融合蛋白表達載體2. 轉(zhuǎn)染細胞，熒光顯微鏡下觀看是否有相互作用。三、應用實例：Fig1: Potassium deprivation increases BiFC signals formed by JunVN173 and ATF2VC155. CGNs were transfected with plasmids encoding JunVN173 (JunVN) and ATF2VC155 (ATF2VC) t

5、ogether with ECFP. JunL3VN were served as a control. After 16 hr, CGNs were switched to 25K, 5K media for 1h. Photos were taken on a fluorescence microscope at a magnification of 200×. The white arrows indicated the BiFC signals (Venus fluorescence). The transfected cells were lysed for Western

6、 blotting by anti-Flag and anti-ATF2 (20F1 CST). CFP were reprobed for normalizing the tranfection efficiency. The percentage of CFP-positive cells exhibiting Venus fluorescence was scored. Data were presented as means ± S.E., n=3, Students t test, p<0.052.1.Hu, C.D., Y. Chinenov, and T.K. Kerppola, Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Mol Cell, 2002. 9(4): p. 789-98.2.Yuan, Z., et al., Opposin