層析技術(shù)的應(yīng)用

1、層析技術(shù)的應(yīng)用一、層析技術(shù)的原理和分類(lèi)（一）層析技術(shù)的原理層析法是目前廣泛應(yīng)用的一種分離技術(shù)。本世紀(jì)初俄國(guó)植物學(xué)家 M.Tswett發(fā)現(xiàn)并使用這一技術(shù)證明了植物的葉子中不僅有葉綠素還含有其它色素?，F(xiàn)在層析法已成為生物化學(xué)、分子生物學(xué)及其它學(xué)科領(lǐng)域有 效的分離分析工具之一。層析法是利用不同物質(zhì)理化性質(zhì)的差異而建立起來(lái)的技術(shù)。所有的層析系統(tǒng)都由兩個(gè)相組成：一是固 定相，它或者是固體物質(zhì)或者是固定于固體物質(zhì)上的成分；另一是流動(dòng)相，即可以流動(dòng)的物質(zhì)，如水和各 種溶媒。當(dāng)待分離的混合物隨溶媒（流動(dòng)相）通過(guò)固定相時(shí)，由于各組份的理化性質(zhì)存在差異，與兩相發(fā) 生相互作用（吸附、溶解、結(jié)合等）的能力不同，在兩相

2、中的分配（含量對(duì)比）不同，而且隨溶媒向前移 動(dòng)，各組份不斷地在兩相中進(jìn)行再分配。與固定相相互作用力越弱的組份，隨流動(dòng)相移動(dòng)時(shí)受到的阻滯作 用小，向前移動(dòng)的速度快。反之，與固定相相互作用越強(qiáng)的組份，向前移動(dòng)速度越慢。分部收集流出液， 可得到樣品中所含的各單一組份，從而達(dá)到將各組份分離的目的。（二）層析法分類(lèi)見(jiàn)表 16-57（三）層析法的特點(diǎn)與應(yīng)用表16-5 按兩相所處狀態(tài)分類(lèi)流動(dòng)相液體氣體層析法是根據(jù)物質(zhì)的理化性質(zhì)不同而建立的分離分析方法。根據(jù)層析峰的位置及峰高或峰面積，可以 定性及定量。層析法與光學(xué)、電學(xué)或電化學(xué)儀器連用，可檢測(cè)出層析后各組份的濃度或質(zhì)量，同時(shí)繪出層 析圖。層析儀與電子計(jì)算機(jī)聯(lián)

3、用，可使操作及數(shù)據(jù)處理自動(dòng)化，大大縮短分析時(shí)間。由于層析法具有分辨 率高、靈敏度高、選擇性好、速度快等特點(diǎn)，因此適用于雜質(zhì)多、含量少的復(fù)雜樣品分析，尤其適用于生 物樣品的分離分析。近年來(lái)，已成為生物化學(xué)及分子生物學(xué)常用的分析方法。在醫(yī)藥衛(wèi)生、環(huán)境化學(xué)、高 分子材料、石油化工等方面也得到了廣泛的應(yīng)用。表16-6 按層析原理分類(lèi)名稱(chēng)分離原理組份在吸附劑表面吸附固定相是固體吸附劑，各能力吸附層析法不同各組份在流動(dòng)相和靜止液相（固相）中的分配系數(shù)不 分配層析法同固定相是離子交換劑，各組份與離子交換劑親和力不 離子交換層析法同固定相是多孔凝膠，各組份的分子大小不同，因而在 凝膠層析法凝膠上受阻滯的程度不

4、同親和層析法固定相只能與一種待分離組份專(zhuān)一結(jié)合，以此和無(wú)親和力的其它組份分離表16-7 按操作形式不同分類(lèi)名稱(chēng)操作形式柱層析法固定相裝于柱內(nèi)，使樣品沿著一個(gè)方向前移而達(dá)分離將適當(dāng)粘度的固定相均勻涂鋪在薄板上，點(diǎn)樣后用流薄層層析法動(dòng)相展開(kāi)，使各組份分離用濾紙作液體的載體，點(diǎn)樣后用流動(dòng)相展開(kāi)，使各組 紙層析法份分離將適當(dāng)?shù)母叻肿佑袡C(jī)吸附劑制成薄膜，以類(lèi)似紙層析薄膜層析法方法進(jìn)行物質(zhì)的分離二、層析法實(shí)驗(yàn)技術(shù)（一）凝膠層析法凝膠層析又稱(chēng)分子篩過(guò)濾、排阻層析等。它的突出優(yōu)點(diǎn)是層析所用的凝膠屬于惰性載體，不帶電荷， 吸附力弱，操作條件比較溫和，可在相當(dāng)廣的溫度范圍下進(jìn)行，不需要有機(jī)溶劑，并且對(duì)分離成分理化

5、性 質(zhì)的保持有獨(dú)到之處。對(duì)于高分子物質(zhì)有很好的分離效果。Sephadex G-251 .凝膠的選擇根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌x擇不同型號(hào)的凝膠。如果實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖菍悠分械拇蠓肿游镔|(zhì)和小分 子物質(zhì)分開(kāi)，由于它們?cè)诜峙湎禂?shù)上有顯著差異，這種分離又稱(chēng)組別分離，一般可選用和G-50 ,對(duì)于小肽和低分子量的物質(zhì)(1000-5000 )的脫鹽可使用 Sephadex G-10 , G-15及Bio-Gel-p-2或4。如果實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖菍悠分幸恍┓肿恿勘容^近似的物質(zhì)進(jìn)行分離，這種分離又叫分級(jí)分離。 一般選用排阻限度略大于樣品中最高分子量物質(zhì)的凝膠，層析過(guò)程中這些物質(zhì)都能不同程度地深入到凝膠內(nèi)部，由 于Kd不同，最后得到

6、分離。2 .柱的直徑與長(zhǎng)度根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，組別分離時(shí)，大多采用 2-30cm長(zhǎng)的層析柱，分級(jí)分離時(shí)，一般需要100cm左右長(zhǎng)的層析柱，其直徑在 1-5cm范圍內(nèi)，小于1cm產(chǎn)生管壁效應(yīng)，大于 5cm則稀釋現(xiàn)象嚴(yán)重。長(zhǎng) 度L與直徑D的比值L/D 一般宜在7-10之間，但對(duì)移動(dòng)慢的物質(zhì)宜在 30-40之間。3 .凝膠柱的制備凝膠型號(hào)選定后，將干膠顆粒懸浮于5-10倍量的蒸儲(chǔ)水或洗脫液中充分溶脹，溶脹之后將極細(xì)的小顆粒傾瀉出去。自然溶脹費(fèi)時(shí)較長(zhǎng)，加熱可使溶脹加速，即在沸水浴中將濕凝膠漿逐漸升溫 至近沸，1-2小時(shí)即可達(dá)到凝膠的充分脹溶。加熱法既可節(jié)省時(shí)間又可消毒。凝膠的裝填：將層析柱與地面垂直固定在架子上

7、，下端流出口用夾子夾緊，柱頂可安裝一個(gè)帶有攪拌 裝置的較大容器，柱內(nèi)充滿洗脫液，將凝膠調(diào)成較稀薄的漿頭液盛于柱頂?shù)娜萜髦?，然后在微微地?cái)嚢柘?使凝膠下沉于柱內(nèi)，這樣凝膠粒水平上升，直到所需高度為止，拆除柱頂裝置，用相應(yīng)的濾紙片輕輕蓋在 凝膠床表面。稍放置一段時(shí)間，再開(kāi)始流動(dòng)平衡，流速應(yīng)低于層析時(shí)所需的流速。在平衡過(guò)程中逐漸增加 到層析的流速，千萬(wàn)不能超過(guò)最終流速。平衡凝膠床過(guò)夜，使用前要檢查層析床是否均勻，有無(wú)紋路”或氣泡，或加一些有色物質(zhì)來(lái)觀察色帶的移動(dòng)，如帶狹窄、均勻平整說(shuō)明層析柱的性能良好，色帶出現(xiàn)歪曲、 散亂、變寬時(shí)必須重新裝柱。1.4 .加樣和洗脫凝膠床經(jīng)過(guò)平衡后，在床頂部留下數(shù)亳升

8、洗脫液使凝膠床飽和，再用滴管加入樣品。一 般樣品體積不大于凝膠總床體積的5 %-10%。樣品濃度與分配系數(shù)無(wú)關(guān)，故樣品濃度可以提高，但分子量 較大的物質(zhì)，溶液的粘度將隨濃度增加而增大，使分子運(yùn)動(dòng)受限，故樣品與洗脫液的相對(duì)粘度不得超過(guò)5-2。樣品加入后打開(kāi)流出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)，當(dāng)樣品液面恰與凝膠床表面相平時(shí)，再加入數(shù)毫升洗 脫液中洗管壁，使其全部進(jìn)入凝膠床后，將層析床與洗脫液貯瓶及收集器相連，預(yù)先設(shè)計(jì)好流速，然后分 部收集洗脫液，并對(duì)每一儲(chǔ)份做定性、定量測(cè)定。5 .凝膠柱的重復(fù)使用、凝膠回收與保存一次裝柱后可以反復(fù)使用，不必特殊處理，并不影響分離效果。為了防止凝膠染菌，可在一次層析后加入0

9、.02 %的疊氮鈉，在下次層析前應(yīng)將抑菌劑除去，以免干擾洗脫液的測(cè)定。如果不再使用可將其回收，一般方法是將凝膠用水沖洗干凈濾干，依次用 70%、90%、95%乙醇脫水 平衡至乙醇濃度達(dá)90 %以上，濾干，再用乙醴洗去乙醇、濾干、干燥保存。濕態(tài)保存方法是凝膠漿中加入 抑菌劑或水沖洗到中性，密封后高壓滅菌保存。6 .凝膠層析的應(yīng)用脫鹽：高分子（如蛋白質(zhì)、核酸、多糖等）溶液中的低分子量雜質(zhì)，可以用凝膠層析法除去，這一操作稱(chēng)為脫鹽。本法脫鹽操作簡(jiǎn)便、快速、蛋白質(zhì)和酶類(lèi)等在脫鹽過(guò)程中不易變性。適用的凝膠為SephadexG-10、15、25或Bio-Gel-p-2 、 4、6。柱長(zhǎng)與直徑之比為 5-15

10、,樣品體積可達(dá)柱床體積的 25%-30%, 為了防止蛋白質(zhì)脫鹽后溶解度降低會(huì)形成沉淀吸附于柱上，一般用醋酸鏤等揮發(fā)性鹽類(lèi)緩沖液使層析柱平 衡，然后加入樣品，再用同樣緩沖液洗脫，收集的洗脫液用冷凍干燥法除去揮發(fā)性鹽類(lèi)。用于分離提純：凝膠層析法已廣泛用于酶、蛋白質(zhì)、氨基酸、多糖、激素、生物堿等物質(zhì)的分離提 純。凝膠對(duì)熱原有較強(qiáng)的吸附力，可用來(lái)去除無(wú)離子水中的致熱原制備注射用水。測(cè)定高分子物質(zhì)的分子量：用一系列已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)品放入同一凝膠柱內(nèi)，在同一條件下層析， 記錄每一分鐘成分的洗脫體積，并以洗脫體積對(duì)分子量的對(duì)數(shù)作圖，在一定分子量范圍內(nèi)可得一直線，即分子量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。測(cè)定未知物質(zhì)的分子量時(shí)，可

11、將此樣品加在測(cè)定了標(biāo)準(zhǔn)曲線的凝膠柱內(nèi)洗腫后，根據(jù) 物質(zhì)的洗脫體積，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出它的分子量。高分子溶液的濃縮：通常將 SephadexG-25或50干膠投入到稀的高分子溶液中，這時(shí)水分和低分 子量的物質(zhì)就會(huì)進(jìn)入凝膠粒子內(nèi)部的孔隙中，而高分子物質(zhì)則排阻在凝膠顆粒之外，再經(jīng)離心或過(guò)濾，將 溶脹的凝膠分離出去，就得到了濃縮的高分子溶液。（二）離子交換層析法離子交換層析法是以具有離子交換性能的物質(zhì)作固定相，利用它與流動(dòng)相中的離子能進(jìn)行可逆的交換 性質(zhì)來(lái)分離離子型化合物的一種方法。1 .離子交換劑預(yù)處理和裝柱對(duì)于離子交換纖維素要用流水洗去少量碎的不易沉淀的顆粒，以保證有較 好的均勻度，對(duì)于已溶脹好的產(chǎn)

12、品則不必經(jīng)這一步驟。溶脹的交換劑使用前要用稀酸或稀堿處理，使之成 為帶H+或OH-的交換劑型。陰離子交換劑常用堿-酸-堿”處理，使最終轉(zhuǎn)為-OH-型或鹽型交換劑；對(duì)于陽(yáng)離子交換劑則用酸-堿-酸”處理，使最終轉(zhuǎn)為-H-型交換劑。洗滌好的纖維素使用前必須平衡至所需的pH和離子強(qiáng)度。已平衡的交換劑在裝柱前還要減壓除氣泡。為了避免顆粒大小不等的交換劑在自然沉降時(shí)分層，要適當(dāng)加壓裝柱，同時(shí)使柱床壓緊，減少死體積，有利于分辨率的提高。柱子裝好后再用起始緩沖液淋洗， 直至達(dá)到充分平衡方可使用。2 .加樣與洗脫加樣：層析所用的樣品應(yīng)與起始緩沖液有相同的pH和離子強(qiáng)度，所選定的pH值應(yīng)落在交換劑與被結(jié)合物有相反

13、電荷的范圍，同時(shí)要注意離子強(qiáng)度應(yīng)低，可用透析、凝膠過(guò)濾或稀釋法達(dá)此目的。1%-5%。樣品中的不溶物應(yīng)在透析后或凝膠過(guò)濾前，以離心法除去。為了達(dá)到滿意的分離效果，上樣量要適當(dāng)，不 要超過(guò)柱的負(fù)荷能力。柱的負(fù)荷能力可用交換容量來(lái)推算，通常上樣量為交換劑交換總量的洗脫：已結(jié)合樣品的離子交換前，可通過(guò)改變?nèi)芤旱膒H或改變離子強(qiáng)度的方法將結(jié)合物洗脫，也可 同時(shí)改變pH與離子強(qiáng)度。為了使復(fù)雜的組份分離完全，往往需要逐步改變 pH或離子強(qiáng)度，其中最簡(jiǎn)單的 方法是階段洗脫法，即分次將不同pH與離子強(qiáng)度的溶液加入，使不同成分逐步洗脫。由于這種洗脫pH與 離子強(qiáng)度的變化大，使許多洗脫體積相近的成分同時(shí)洗脫，純度較

14、差，不適宜精細(xì)的分離。最好的洗脫方法是連續(xù)梯度洗脫，洗脫裝置見(jiàn)圖16-6。兩個(gè)容器放于同一水平上，第一個(gè)容器盛有一定pH的緩沖液，第二個(gè)容器含有高鹽濃度或不同pH的緩沖液，兩容器連通，第一個(gè)容器與柱相連，當(dāng)溶液由第一容器流入柱時(shí)，第二容器中的溶液就會(huì)自動(dòng)來(lái)補(bǔ)充，經(jīng)攪拌與第一容器的溶液相混合，這樣流入柱中的緩沖液的洗脫能力即成梯度變化。第一容器中任何時(shí)間的濃度都可用下式進(jìn)行計(jì)算：C=C2- (C2-C1) (1 V)A2/A1式中Ai、A2分別代表兩容器的截面積：C1、C2分別表示容器中溶液的濃度；V為流出體積對(duì)總體積之比。當(dāng)A1 = A2時(shí)為線性梯度，當(dāng) A1>A2時(shí)為凹形梯度，A1&g

15、t;A2時(shí)為凸形梯度。洗脫時(shí)應(yīng)滿足以下要求：洗脫液體積應(yīng)足夠大，一般要幾十倍于床體積，從而使分離的各峰不致于太擁擠。梯度的上限要足夠高，使緊密吸附的物質(zhì)能被洗脫下來(lái)。梯度不要上升太快，要恰好使移動(dòng) 的區(qū)帶在快到柱末端時(shí)達(dá)到解吸狀態(tài)。目的物的過(guò)早解吸，會(huì)引起區(qū)帶擴(kuò)散；而目的物的過(guò)晚解吸會(huì)使峰 形過(guò)寬。圖16-6 梯度洗脫示意圖3 .洗脫儲(chǔ)份的分析 按一定體積（5-10ml/管）收集的洗脫液可逐管進(jìn)行測(cè)定，得到層析圖譜。依實(shí)驗(yàn) 目的的不同，可采用適宜的檢測(cè)方法（生物活性測(cè)定、免疫學(xué)測(cè)定等）確定圖譜中目的物的位置，并回收 目的物。4 .離子交換劑的再生與保存離子交換劑可在柱上再生。如離子交換纖維素可

16、用 2mol/:NaCl淋洗柱，若有強(qiáng)吸附物則可用0.1mol/l NaOH洗柱；若有脂溶性物質(zhì)則可用非離子型去污劑洗柱后再生，也可用乙醇 洗滌，其順序?yàn)椋?.5mol/l NaOH-水-乙醇-水-20 % NaOH-水。保存離子交換劑時(shí)要加防腐劑。對(duì)陰離子交 換劑宜用0.002 %氯已定（洗必泰），陽(yáng)離子交換劑可用乙基硫柳汞（0.005 %）。有些產(chǎn)品建立用 0.02%疊氮鈉。5 .離子交換層析的應(yīng)用離子交換層析技術(shù)已廣泛用于各學(xué)科領(lǐng)域。在生物化學(xué)及臨床生化檢驗(yàn)中主要 用于分離氨基酸、多肽及蛋白質(zhì)，也可用于分離核酸、核甘酸及其它帶電荷的生物分子。（三）高效液相層析法高效液相層析法（HPLC

17、）是近二十年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新穎快速的分離技術(shù)。它是在經(jīng)典液相層析法基礎(chǔ)上，引進(jìn)了氣相層析的理論具有氣相層析的全部?jī)?yōu)點(diǎn)。由于HPLC分離能力強(qiáng)、測(cè)定靈敏度高，可在室溫下進(jìn)行，應(yīng)用范圍極廣，無(wú)論是極性還是非極性，小分子還是大分子，熱穩(wěn)定還是不穩(wěn)定的化合物 均可用此法測(cè)定。對(duì)蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸、生物堿、類(lèi)固醇和類(lèi)脂等尤為有利。高效液相層析法的基本概念和分離理論與經(jīng)典的液相色譜法及氣相色譜法一致，因而其塔板理論及動(dòng) 力學(xué)理論等都可用于高效液相層析。L高效液相層析儀典型的高效液相層析儀包括輸液系統(tǒng)、層析柱與檢測(cè)系統(tǒng)三部分。流動(dòng)相用一高壓 泵輸入。這種高壓泵應(yīng)滿足以下條件：流量恒定，無(wú)脈動(dòng)，并有較大的

18、調(diào)節(jié)范圍。能抗溶劑腐蝕。 有較高的輸出壓力，一般要達(dá)到15300kg/c ,也有的高達(dá)800kg/c。泵的死體積要小。 梯度洗脫裝置必 須具備兩臺(tái)高壓泵，一臺(tái)輸送強(qiáng)溶劑，一臺(tái)輸送弱溶劑，兩泵運(yùn)轉(zhuǎn)速度用電腦控制，并可按一定的要求改 變流動(dòng)相的組成，以改善分離效果。一般用微量注射器直接進(jìn)樣，也可采用六通閥門(mén)進(jìn)樣。HPLC中所用的檢測(cè)器最多應(yīng)用的是紫外吸收檢測(cè)，靈敏度可達(dá)ng水平。止匕外，還有熒光檢測(cè)器、示差析光檢測(cè)器、電化學(xué)檢測(cè)器等。2. HPLC的類(lèi)型與應(yīng)用液-固吸附層析：固定相是具有吸附活性的吸附劑，常用的有硅膠、氧化鋁、高分子有機(jī)酸或聚酰胺 凝膠等。液-固吸附層析中的流動(dòng)相依其所起的作用不同

19、，分為底劑”和洗脫劑兩類(lèi)，底劑起決定基本色譜的分離作用，洗脫劑起調(diào)節(jié)試樣組份的滯留時(shí)間長(zhǎng)短，并對(duì)試樣中某幾個(gè)組份具有選擇性作用。流動(dòng)相中 底劑與洗脫劑成分的組合和選擇，直接影響色譜的分離情況，一般底劑為極性較低的溶劑，如正已烷、環(huán) 已烷、戊烷、石油醴等，洗脫劑則根據(jù)試樣性質(zhì)選用針對(duì)性溶劑，如醴、酯、酮、醇和酸等。本法可用于 分離異構(gòu)體、抗氧化劑與維生素等。液-液分配層析：固定相為單體固定液構(gòu)成。將固定液的官能團(tuán)結(jié)合在薄殼或多孔型硅膠上，經(jīng)酸洗、 中和、干燥活化、使表面保持一定的硅羥基。這種以化學(xué)鍵合相為固定相的液-液層析稱(chēng)為化學(xué)鍵合相層析。 另一種利用離子對(duì)原理的液-液分配層析為離子對(duì)層析?；?/p>

20、學(xué)鍵合層析分：極性鍵合相層析：固定相為極 性基團(tuán)，氟基、氨基及雙羥基三種。流動(dòng)相為非極性或極性較小的溶劑。極性小的組份先出峰，極性大的 后出峰，這稱(chēng)為正相層析法，適用于分離極性化合物。非極性鍵合相層析：固定相為非極性基團(tuán)，如十 八烷基（C18）、辛烷基（C8）、甲基與苯基等，流動(dòng)相用強(qiáng)極性溶劑，如水、醇、乙睛或無(wú)機(jī)鹽緩沖液。最常用的是不同比例的水和甲醇配制的混合溶劑，水不僅起洗脫作用還可掩蓋載體表面的硅羥基，防止因 吸附而至的拖尾現(xiàn)象。極性大的組份先出峰，極性小的組份后出峰，恰好與正相法相反，故稱(chēng)反相層析。本法適用于小分子物質(zhì)的分離，如肽、核甘酸、糖類(lèi)、氨基酸的衍生物等。離子對(duì)分配層析分：正相

21、離子對(duì)層析：此法常以水吸附在硅膠上作為固定相，把與分離組份帶相反電荷的配對(duì)離子以一定濃度溶于水或緩沖液涂漬在硅膠上。流動(dòng)相為極性較低的有機(jī)溶劑。在層析過(guò)程中，待分離的離子與水相中配對(duì)離子形成中性離子對(duì)，在水相和有機(jī)相中進(jìn)行分配，而達(dá)到分離。本法優(yōu)點(diǎn)是流動(dòng)相選擇余地大，缺點(diǎn)是固定相易流失。反向離子對(duì)層析：固定相是疏水性鍵合硅膠，如C18鍵合相，待分離離子和帶相反電荷的配對(duì)離子同時(shí)存在于強(qiáng)極性的流動(dòng)相中，生成的中性離子對(duì)在流動(dòng)相和鍵合相之間進(jìn)行分配，而得到分離。本法優(yōu)點(diǎn)是固定相不存在流失問(wèn)題、流動(dòng)相含水或緩沖液更適用于電離性化合物的分離。離子交換層析：原理與普通離子交換相同。在離子交換HPLC中，

22、固定相多用離子性鍵合相，故本法又稱(chēng)離子性鍵合相層析。流動(dòng)相主要是水溶液，pH值最好在被分離酸、堿的 pK值附近。（四）親和層析法親和層析是利用待分離物質(zhì)和它的特異性配體間具有特異的親和力，從而達(dá)到分離目的的一類(lèi)特殊層 析技術(shù)。具有專(zhuān)一親和力的生物分子對(duì)主要有：抗原與抗體、DNA與互補(bǔ)DNA或RNA、酶與它的底物或競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑、激素（或藥物）與它們的受體、維生素和它的特異結(jié)合蛋白、糖蛋白與它相應(yīng)的植物凝集素等?？捎H和的一對(duì)分子中的一方以共價(jià)鍵形式與不溶性載體相連作為固定相吸附劑，當(dāng)含有混合組份的樣品通 過(guò)此固定相時(shí)，只有和固定相分子有特異親和力的物質(zhì)，才能被固定相吸附結(jié)合，其它沒(méi)有親和力的無(wú)關(guān)

23、組份就隨流動(dòng)相流出，然后改變流動(dòng)組成份，將結(jié)合的親和物洗脫下來(lái)。親和層析中所用的載體稱(chēng)為基質(zhì)， 與基質(zhì)共價(jià)連接的化合物稱(chēng)配基。親和層析純化過(guò)程簡(jiǎn)單、迅速，且分離效率高。對(duì)分離含量極少又不穩(wěn)定的活性物質(zhì)尤為有效。但本 法必須針對(duì)某一分離對(duì)象，制備專(zhuān)一的配基和尋求層析的穩(wěn)定條件，因此親和層析的應(yīng)用范圍受到了一定 的限制。親和層析可用于純化生物大分子：稀溶液的濃縮；不穩(wěn)定蛋白質(zhì)的貯藏；從純化的分子中除去殘余的 污染物；用免疫吸附劑吸附純化對(duì)此尚無(wú)互補(bǔ)配體的生物大分子；分離核酸是親和層析應(yīng)用的一個(gè)重要方 面。應(yīng)用實(shí)例：2-胰凝乳蛋白酶的提純1 .親和吸附劑（才氨基-N-乙酰-D-色氨酸）的制備取一定體積的Sepharose4B力口 100mgCNBr 。攪拌混合物，滴加2-8mol/l NaOH ,使溶液pH維持在11.0。20 c左右，8-12分鐘完成反應(yīng)。在布氏漏斗中抽 濾活化的瓊脂糖，然后用 20倍體積冷的0.1mol/l NaHCO 3 （ pH9.0 ）溶液洗滌。將上述活化的 Sepharos e4B與等體積0.1mol/l NaHCO 3 （ pH9.0并在冰箱中預(yù)冷）溶液混合，接著迅速加入體胰蛋白酶抑制劑（N -氨基-N-乙酰-色氨酸甲酯）。抑制劑的最大用量為每毫升Sepharose 4