兩種不同培養(yǎng)方法對破骨細(xì)胞ATPasea3基因表達(dá)和骨吸收活性的影響

1、兩種不同培養(yǎng)方法對破骨細(xì)胞ATPase a3基因表達(dá)和骨吸收活性的影響作者：杜文喜 肖魯偉 吳承亮 厲駒 童培建【摘要】 目的探討不同方法培養(yǎng)下的大鼠破骨細(xì)胞(osteoclast，OC)骨吸收功能的差異，以及骨吸收關(guān)鍵基因ATPase a3的mRNA表達(dá)水平的差異，為體外實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。方法機(jī)械分離和誘導(dǎo)培養(yǎng)，即從新生24h的大鼠長干骨骨髓腔內(nèi)壁機(jī)械分離成熟OC和1,25(OH)2 D3誘導(dǎo)大鼠骨髓細(xì)胞形成破骨樣細(xì)胞(osteoclast like cell，OLC)，對獲得的OC進(jìn)行形態(tài)和骨吸收功能觀察，并測定OC骨吸收關(guān)鍵基因ATPase a3的mRNA表達(dá)水平的差異。結(jié)果OC和OLC均為

2、抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase，TRAP)染色陽性的多核巨細(xì)胞，與細(xì)胞共培養(yǎng)骨片上可形成骨吸收陷窩；誘導(dǎo)法培養(yǎng)出的OLC數(shù)目多于機(jī)械分離法，但誘導(dǎo)早期陷窩較之小而淺，誘導(dǎo)后期基本接近OC；OC骨吸收關(guān)鍵基因ATPase a3的mRNA，在機(jī)械分離8h與誘導(dǎo)培養(yǎng)6天的細(xì)胞表達(dá)量無顯著差異，但都遠(yuǎn)少于培養(yǎng)8天的表達(dá)量。結(jié)論誘導(dǎo)法可以培育出大量的OLC，優(yōu)于機(jī)械分離法，但早期骨吸收功能較弱，OC骨吸收功能與其核數(shù)相關(guān)。后期的OCL與機(jī)械分離OC接近，可以用于各類實(shí)驗(yàn)。 【關(guān)鍵詞】 破骨細(xì)胞 破骨樣細(xì)胞 骨吸收 ATPase a3破骨細(xì)胞（o

3、steoclast，OC）是骨吸收的執(zhí)行細(xì)胞，OC骨吸收機(jī)制研究對闡明骨組織生理病理機(jī)制和代謝性骨病的防治具有十分重要的意義，然而OC為高代謝的分化終末細(xì)胞，組織含量極少又非常脆弱，自 Chambers首次建立OC體外培養(yǎng)的方法以來，各國學(xué)者不斷完善，李氏等在國內(nèi)首次建立了骨髓細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)法，建立了破骨樣細(xì)胞(osteoclast like cell，OLC)培養(yǎng)體系，發(fā)現(xiàn)OLC和OC是同一種細(xì)胞12。OC的骨吸收功能以及形成的數(shù)目，是其活性的集中體現(xiàn)，同時(shí)，ATPase a3基因是骨吸收功能執(zhí)行的關(guān)鍵基因，該基因的缺乏或突變，是骨吸收障礙發(fā)生骨硬化癥和胚胎致死的關(guān)鍵原因3。本實(shí)驗(yàn)在經(jīng)典的機(jī)械

4、分離法和骨髓細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)法的基礎(chǔ)上加以改進(jìn)，對其形態(tài)、分化及功能進(jìn)行了動(dòng)態(tài)觀察，測定OC骨吸收關(guān)鍵基因ATPase a3的mRNA表達(dá)水平量，探討不同方法培養(yǎng)下的OC骨吸收功能的差異。1 材料1.1 動(dòng)物 新生24h內(nèi)SD大鼠乳鼠，4周齡SD雄性大鼠（SPF級），由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供SCXK（滬）20030003。1.2 主要試劑 M199培養(yǎng)基、MEM培養(yǎng)基、HEPES液（美國Gibco公司），1,25(OH)2D3、萘酚ASBI磷酸鹽（美國Sigma 公司），甲苯胺藍(lán)（瑞士Fluka公司）、胎牛血清(杭州四季青公司)，Trizol、引物合成（美國Invitrogen公司），MM

5、LV 逆轉(zhuǎn)錄酶（美國promege公司）。1.3 蓋玻片及骨磨片的制備 將10×10mm蓋玻片，經(jīng)硫酸-重鉻酸鉀清洗液中過夜，蒸餾水超聲波清洗，自然晾干，高壓消毒后備用。取新鮮成年牛股骨皮質(zhì)骨，鋸成厚骨片，經(jīng)角磨機(jī)和細(xì)金剛砂紙磨至約15m厚，再剪成5×5mm大小，三蒸水中超聲波清洗后，自然晾干，使用前紫外線雙面照射各4 h。2 方法2.1 大鼠OC機(jī)械分離法培養(yǎng) 參考文獻(xiàn)4方法操作，培養(yǎng)1h后再用培養(yǎng)液沖洗，分別于4、8和10h取出蓋玻片進(jìn)行抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase，TRAP)染色，8h時(shí)抽提OC總RNA，并

6、將與OC共培養(yǎng)24h的骨片甲苯胺藍(lán)染色。2.2 大鼠骨髓細(xì)胞誘導(dǎo)法 選用4周齡SD雄性大鼠，斷頸處死，無菌條件下分離完整股骨、脛骨，暴露髓腔后用MEM培養(yǎng)基（含20%胎牛血清）沖洗骨髓腔數(shù)次至骨干發(fā)白為止。沖洗液200目篩網(wǎng)過濾后，收集液接種于25ml培養(yǎng)瓶，標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)(飽和濕度、5% CO2、37) 1h后收集上層細(xì)胞液(含骨髓單核細(xì)胞)，500 r/min，4離心5 min，棄上清，用完全培養(yǎng)基(含20%胎牛血清、1×10-8mol/L的1,25(OH)2D3、青霉素100U/ml、鏈霉素100g/ml的MEM培養(yǎng)基)稀釋細(xì)胞至1.5×106個(gè)/孔，將細(xì)胞懸液加入預(yù)置蓋玻

7、片或牛骨片的進(jìn)口24孔細(xì)胞培養(yǎng)板。常規(guī)培養(yǎng)，每3 d換液1次，每次換總量的一半。培養(yǎng)全過程中，動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長狀態(tài)，分別于3，6，8，11，14d取出蓋玻片進(jìn)行TRAP染色，抽提6d和8d的OLC總RNA，并將8d、12d與OLC共培養(yǎng)骨片甲苯胺藍(lán)染色。2.3 OC的形態(tài)觀察 分別對不同方法培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行觀察，TRAP染色。將待定培養(yǎng)時(shí)間的細(xì)胞爬片取出，按照文獻(xiàn)4方法與步驟進(jìn)行染色，甘油明膠封片，光鏡觀察。其中誘導(dǎo)培養(yǎng)法中的OLC含2個(gè)胞核以上且呈TRAP染色陽性的細(xì)胞即為OC。在200倍光鏡下進(jìn)行OC計(jì)數(shù)，每個(gè)玻片上隨機(jī)選擇10個(gè)視野，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞均值并做統(tǒng)計(jì)。2.4 骨吸收功能觀察

8、 分別取與上述細(xì)胞共培養(yǎng)的骨片，經(jīng)2.5%戊二醛溶液固定、0.25mol.L-1氫氧化銨中超聲波清洗，系列酒精脫水，自然晾干，1%甲苯胺藍(lán)染色，觀察骨片上骨陷窩形態(tài)并拍照，利用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)計(jì)算整張骨片上骨吸收陷窩面積之和，結(jié)果以陷窩面積/片（mm2/片）表示。通過骨片上吸收陷窩的面積變化情況，進(jìn)一步鑒定兩種OC體外培養(yǎng)體系差異。并將觀察后的骨片用2.5%戊二醛和1%四氧化鋨各固定，酸性二鉀氧基丙烷梯度脫水，丙酮清洗，CO2臨界點(diǎn)干燥，鍍金，制備電子顯微鏡標(biāo)本。2.5 RTPCR半定量分析 Trizol法提取細(xì)胞總RNA，取1g 總RNA采用兩步法RTPCR。ATPase a3基因5與內(nèi)參

9、甘油醛3磷酸脫氫酶（glyceraldehyde3phosphate dehydrogenase, GAPDH)引物（見表1）。PCR反應(yīng)條件為：94 30sec，61（GAPDH 60）30sec，72 1min。取擴(kuò)增產(chǎn)物各10l在1.7瓊脂糖凝膠電泳，用Imagepro plus 6.0軟件對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行密度值分析，分別計(jì)為DATPase a3、DGAPDH，DATPase a3 / DGAPDH表示ATP a3 mRNA的相對含量。2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。各組數(shù)據(jù)采用x±s表示，計(jì)量資料比較用單因素方差分析（oneway ANOVA）。以P

10、<0.05為顯著性差異，P<0.01為非常顯著性差異。3 結(jié)果3.1 OC形態(tài)觀察 新生大鼠機(jī)械分離的細(xì)胞數(shù)量較多，均勻平鋪。培養(yǎng)1h后，大部分未貼壁細(xì)胞被M199沖走，此時(shí)可見到玻片上多核OC。4h后細(xì)胞形態(tài)清晰，表面有微絨毛，呈偽足樣運(yùn)動(dòng)，細(xì)胞外形不斷變化，部分細(xì)胞之間纖維樣突出連接（圖1），隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，細(xì)胞充分伸展，體積變大，核仁清晰可見。但培養(yǎng)24h后，大部分OC細(xì)胞壁增厚，核固縮，微絨毛消失。含1,25(OH)2D3誘導(dǎo)劑的大鼠骨髓細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)板后，4h見細(xì)胞均勻分布于培養(yǎng)板底部，呈短梭形貼壁生長。誘導(dǎo)培養(yǎng)6d時(shí)，可見體積較大、多核（310個(gè)

11、）的OLC，呈圓形、多角型等多種形態(tài)，時(shí)有細(xì)胞突起向外延展，胞質(zhì)密度較低，細(xì)胞核或集聚在細(xì)胞中央，或散在細(xì)胞周邊，核內(nèi)可見12個(gè)核仁不等（圖2），周圍的單核細(xì)胞不斷融合在較大的OCL中，細(xì)胞核逐漸增多，與機(jī)械分離培養(yǎng)4h的OC相似。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，OLC數(shù)量遞增，8d時(shí)達(dá)峰值，后期細(xì)胞開始空泡變性，細(xì)胞裂解碎片增加，細(xì)胞核呈現(xiàn)固縮、碎裂，細(xì)胞膜破裂，細(xì)胞死亡。3.2 TRAP 染色 TRAP染色是鑒定OC的特異性酶學(xué)染色方法，TRAP染色陽性（TRAP+）為：細(xì)胞質(zhì)染成紅色或酒紅色，細(xì)胞核不著色。機(jī)械分離的細(xì)胞培養(yǎng)4h后可見到典型的TRAP+的OC，培養(yǎng)8h、10h與4h相比較TRAP+的

12、OC數(shù)量沒有顯著差別（P>0.05）（見表2），但到10h時(shí)OC細(xì)胞萎縮，空泡變性明顯（圖3）。誘導(dǎo)培養(yǎng)第6d開始，可見多核TRAP+細(xì)胞，之后TRAP+的細(xì)胞逐漸增多，出現(xiàn)較大型的多核細(xì)胞，并在第8d數(shù)量達(dá)到高峰（圖4），與其它時(shí)間組差異明顯（P<0.01），11d時(shí)TRAP+細(xì)胞減少，細(xì)胞著色逐漸變淡，顏色轉(zhuǎn)晦暗，第14天TRAP+細(xì)胞完全消失。（見表3） 圖1 機(jī)械分離培養(yǎng) 4h，表面有微絨毛（小箭頭），細(xì)胞之間纖維樣突出連接（大箭頭）。(倒置顯微鏡×200) （略）圖2 誘導(dǎo)培養(yǎng)第6天，單核細(xì)胞之間，出現(xiàn)體積較大、多核OLC（箭頭）。(倒置顯微鏡&

13、#215;400）（略）圖3 機(jī)械分離培養(yǎng) 10h，TRAP染色陽性，OC空泡變性（小箭頭）。(TRAP染色×200) （略）圖4 誘導(dǎo)培養(yǎng)第8天，TRAP染色陽性的多核細(xì)胞（燕尾箭頭），單核細(xì)胞核增多，體積增大（三角箭頭），TRAP+的單核細(xì)胞（白色箭頭）。(TRAP染色×200）（略）表1 各基因引物序列及片段大?。裕┍? 機(jī)械分離法不同時(shí)間TRAP+ 細(xì)胞個(gè)數(shù)（略）不同培養(yǎng)天數(shù)之間比較P>0.05表3 不同誘導(dǎo)天數(shù)TRAP+ 細(xì)胞個(gè)數(shù)（略）不同培養(yǎng)天數(shù)之間比較,P>0.05,P<0.05,P<0.013.3 骨

14、吸收功能觀察 骨片上吸收陷窩是OC骨吸收的直接結(jié)果，其陷窩數(shù)量、大小和深度直接反應(yīng)OC骨吸收的能力。機(jī)械法培養(yǎng)24的骨片甲苯胺藍(lán)染色后，在光鏡下可見吸收陷窩呈藍(lán)紫色圓形、橢圓形、臘腸形等多種形態(tài)(圖5)，邊界清楚，部分出現(xiàn)穿鑿樣改變。而誘導(dǎo)培養(yǎng)8d時(shí)，在骨片上發(fā)現(xiàn)少量呈藍(lán)紫色小陷窩，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長，陷窩的數(shù)量、深度均增加，12d時(shí)可見大量的吸收陷窩(圖6)。經(jīng)掃描電鏡觀察可清楚識別骨吸收陷窩，成熟的OC骨吸收陷窩較OLC深，底面粗糙，可見有纖維樣基底(圖7)，但是相同面積大小的骨片上，誘導(dǎo)12d的骨陷窩數(shù)量明顯多于機(jī)械法。機(jī)械法培養(yǎng)24的骨吸收陷窩比誘導(dǎo)培養(yǎng)8d形成的骨陷窩面積略多，但遠(yuǎn)少

15、于誘導(dǎo)12d形成的骨吸收陷窩面積。同時(shí)機(jī)械法產(chǎn)生的吸收陷窩的個(gè)數(shù)多于誘導(dǎo)8d，遠(yuǎn)少于誘導(dǎo)12d的數(shù)量。（見表4）表4 不同培養(yǎng)條件骨陷窩的個(gè)數(shù)(個(gè))和陷窩面積（略）不同培養(yǎng)時(shí)間之間比較P<0.05、P<0.01。3.4 兩種方法ATPase a3的表達(dá)變化 ATPase a3基因經(jīng)RTPCR擴(kuò)增，1.7瓊脂糖凝膠電泳（圖8），發(fā)現(xiàn)機(jī)械分離8h目的基因擴(kuò)增產(chǎn)物密度值少于誘導(dǎo)培養(yǎng)8d，差異明顯（P<0.01），但與誘導(dǎo)培養(yǎng)6d無差異（P>0.05），而且相對密度值同樣少于誘導(dǎo)培養(yǎng)8d。（見表5）圖5 機(jī)械分離培養(yǎng)24h，與OC共培養(yǎng)的骨片，出

16、現(xiàn)較周圍骨組織深染的骨陷窩，臘腸形骨質(zhì)吸收區(qū)（箭頭）。(甲苯胺藍(lán)染色×150)（略） 圖6 誘導(dǎo)培養(yǎng)12d，與OLC共培養(yǎng)的骨片，出現(xiàn)大量骨陷窩，斑片狀骨質(zhì)吸收區(qū)（箭頭）。(甲苯胺藍(lán)染色×150)（略） 圖7 機(jī)械分離培養(yǎng)24h，與OC共培養(yǎng)的骨片，骨吸收陷窩較深呈現(xiàn)呈不規(guī)則形，邊界清晰、底面粗糙不平(箭頭)。(掃描電鏡×150)（略） 圖8 RTPCR產(chǎn)物，ATPase a3基因mRNA表達(dá)量，誘導(dǎo)法8d較其它時(shí)間段多。（略）表5 不同時(shí)間段RTPCR產(chǎn)物密度值（略）不同組間比較，P>0.05，P<0.05，P<0.01

17、4 討論 OC是高度分化的多核巨細(xì)胞，直接參與骨吸收，是骨組織吸收的主要功能細(xì)胞。目前，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為OC來源于單核/巨噬細(xì)胞前體細(xì)胞67，到目前為止尚缺乏成熟的OC細(xì)胞株，因此機(jī)械分離法是最直接最有效獲得成熟OC的方法。根據(jù)OC體形巨大、能迅速粘附于基質(zhì)的特點(diǎn)，本研究在原機(jī)械分離方法上改進(jìn)，培養(yǎng)1h后再用培養(yǎng)液沖洗，以除去大量未貼壁的細(xì)胞，達(dá)到相對純化的目的。24h動(dòng)態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，810h最典型，胞核清晰，細(xì)胞飽滿，絲狀足密集，呈偽足樣運(yùn)動(dòng)、TRAP陽性等特點(diǎn)，12h細(xì)胞開始凋亡，24h典型細(xì)胞形態(tài)完全消失，機(jī)械分離法培養(yǎng)的OC含量少又非常脆弱，成為其生化學(xué)和分子生物學(xué)研究的嚴(yán)重限制因素。 由骨

18、髓和其它組織誘導(dǎo)培養(yǎng)形成的細(xì)胞與成熟的OC來源不同，稱為OLC2。課題組用1,25(OH)2 D3成功地在體外誘導(dǎo)SD大鼠骨髓細(xì)胞分化形成OLC，發(fā)現(xiàn)在1×10-8mol.L-1 1,25(OH)2 D3的作用下，骨髓細(xì)胞可形成大量的TRAP+、在骨片上形成陷窩的多核巨細(xì)胞，與文獻(xiàn)報(bào)道一致1。1,25(OH)2D3為VitD生物活性最強(qiáng)的代謝產(chǎn)物，與成骨細(xì)胞（osteoblast, OB）的1,25(OH)2D3受體結(jié)合，上調(diào)破骨細(xì)胞分化因子（receptor activator of NFB Ligand, RANKL），直接刺激多核OC的分化成熟，同時(shí)可促使OB分泌粒細(xì)胞集落刺激

19、因子（MCSF），間接促進(jìn)OC形成8。骨髓中的破骨前體細(xì)胞在誘導(dǎo)因子的作用下逐漸向OC分化，實(shí)驗(yàn)顯示OCL骨吸收數(shù)目、面積逐漸增多，活力逐漸增強(qiáng)。1,25(OH)2 D3誘導(dǎo)出的OLC數(shù)量明顯多于機(jī)械分離的方法，且OCL周圍的單核細(xì)胞逐漸不斷融合，形成更大的OCL，細(xì)胞核逐漸增多，早期細(xì)胞核多于5個(gè)的OLC數(shù)量總體上少于機(jī)械分離OC的數(shù)量，但晚期多核OCL明顯增多，且存活時(shí)間遠(yuǎn)長于機(jī)械分離的成熟OC。機(jī)械法骨吸收陷窩邊界清楚，部分出現(xiàn)穿鑿樣改變，而誘導(dǎo)法從出現(xiàn)少量小陷窩到陷窩的數(shù)量、深度逐漸增加。雖然誘導(dǎo)培養(yǎng)OLC依賴骨髓細(xì)胞中的OB和OC前體細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)的，很難分離到純的OC，還有待于進(jìn)一步改

20、善方法提高其純度，但是誘導(dǎo)法培養(yǎng)法明顯優(yōu)于機(jī)械分離法。 Atpase a3基因產(chǎn)物為分子量116 KDa的蛋白(a3)，是OC空泡型質(zhì)子泵(空泡型氫離子三磷酸腺苷轉(zhuǎn)運(yùn)酶Vacuolar H+translocatiing，ATPase，簡稱VATPase) 跨膜部分之一，VATPase活化后將H+分泌到細(xì)胞外而完成骨吸收功能。李亦平等9克隆了小鼠該基因，并制備出該基因缺失的小鼠，該小鼠的OC數(shù)目正常，可附著在骨上，但不能形成吸收陷窩；破骨樣多核細(xì)胞不能形成細(xì)胞外酸化腔，也不能使骨去礦物化；OC失去細(xì)胞外酸化功能，使小鼠出現(xiàn)嚴(yán)重的骨質(zhì)硬化。同時(shí)Niikura3也表明ATPase a3對OC發(fā)揮骨吸

21、收功能是必需的，該基因的突變是嬰兒惡性骨硬化病發(fā)生及胚胎致死的關(guān)鍵原因10。利用OC噬骨形成吸收陷窩特性，觀察陷窩的形態(tài)和測量陷窩的數(shù)量、大小、深度，以及Atpase a3基因表達(dá)量是檢測OC骨吸收功能的可靠指標(biāo)。 RTPCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)，經(jīng)機(jī)械分離培養(yǎng)后，相對數(shù)量少的成熟的OC骨吸收關(guān)鍵基因ATPase a3表達(dá)量較誘導(dǎo)早期（6d）OLC多，而少于8d的OLC，由此可知細(xì)胞核數(shù)與OC骨吸收功能直接相關(guān)，與Manolson11報(bào)道一致，其研究發(fā)現(xiàn)a3亞基的表達(dá)隨破骨細(xì)胞核數(shù)(25,69和10)的增多而逐漸增加，a3 mRNA在大破骨細(xì)胞中比在小破骨細(xì)胞中高2.5倍，而a3是VATPase的關(guān)鍵性亞

22、基，由ATPase a3基因調(diào)控，是功能性破骨細(xì)胞的必需成分，可見誘導(dǎo)培養(yǎng)的早期OLC可能并未達(dá)到完全分化且胞核數(shù)少，因而在骨片上形成的吸收陷窩較小，后期多核OCL逐漸增多，陷窩的數(shù)量、深度逐漸增加，基本接近成熟的OC。由此可知：機(jī)械分離培養(yǎng)法，可簡單有效的獲得骨吸收功能較活躍的OC，但存活時(shí)間短不利于進(jìn)行長期生化和分子生物研究，且需要犧牲大量的動(dòng)物；而1,25(OH)2D3誘導(dǎo)法可以獲得數(shù)量多且生存時(shí)間較長的OCL，因此更適合用于OC分化發(fā)育過程的研究以及關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)基因篩選應(yīng)用。同時(shí)OC的骨吸收功能與其核數(shù)直接相關(guān)，機(jī)械分離下來的細(xì)胞為胞核多的成熟OC，骨吸收功能強(qiáng)于胞核較少的早期OLC，

23、單核細(xì)胞逐漸不斷融合，形成更多、更大的OCL，誘導(dǎo)晚期的OCL數(shù)量和功能上完全可以替代成熟OC進(jìn)行各類實(shí)驗(yàn)。 OC功能異常導(dǎo)致骨改建平衡失調(diào)，是多種代謝性骨病的病理基礎(chǔ)，1,25(OH)2D3誘導(dǎo)法成功的建立OCL培養(yǎng)體系，替代機(jī)械分離成熟OC方法，建立較為穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)平臺，為利用分子生物方法高效特異的抑制OC的骨吸收功能奠定基礎(chǔ)，能有效的糾正絕對或者相對旺盛的骨吸收功能狀態(tài)，達(dá)到恢復(fù)骨吸收、重建動(dòng)態(tài)平衡，就可以有效防治如骨質(zhì)疏松癥、Pagets病、激素性股骨頭壞死、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腫瘤、牙周病等疾病，因此具有廣闊的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用前景。【參考文獻(xiàn)】 1 李鐵軍,于世鳳,王曉敏.1,25二羥基維

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