實驗三DNA的純化與定量分析

1、授課教師 常祖明 學(xué)生人數(shù) 55 課 題 實驗三 DNA的純化和定量分析 授課類型 新授課 授課方法 講授、演示 教學(xué)用具 多媒體、實驗室設(shè)備 教學(xué)目的 學(xué)會DNA去RNA和雜蛋白純化的方法；學(xué)會用分光光度計對DNA進行定量分析的方法 教學(xué)重點 理解實驗過程中每一步操作的目的及原理 教學(xué)難點 用分光光度計定量分析核酸的原理 教學(xué)過程 一、實驗?zāi)康?.對提取的DNA進行去RNA和雜蛋白的純化；2.學(xué)會用紫外分光光度計法測定DNA濃度和純度的原理和方法。二、實驗原理（一）DNA純化的原理提取的DNA中有RNA和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)的存在，純化的目的就是去除其中的RNA和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。RNA的去除可用核糖核

2、酸酶（Ribonuclease, RNase）。RNase是一類催化RNA降解為小片段的核酸酶。RNase A 對RNA有水解作用，但對DNA則不起作用，可以用來去除DNA制品中的污染RNA。經(jīng)過上次課核酸的提取，已經(jīng)將細胞內(nèi)的核酸-蛋白質(zhì)復(fù)合物分離開，大部分蛋白質(zhì)被變性離心除去，但在提取的核酸中仍不可避免存在少部分的蛋白質(zhì)沒有被變性除去，所以本次實驗加入蛋白質(zhì)變性劑進一步去除蛋白質(zhì)。（二）紫外吸收法測DNA的濃度和純度原理核酸分子的基本結(jié)構(gòu)是 磷酸-五碳糖-含氮堿基，其中含氮堿基有3種嘌呤和2種嘧啶，在這些嘌呤環(huán)和嘧啶環(huán)中含有共軛雙鍵，共軛雙鍵的特性是在260nm有特異的紫外吸收峰，其吸收的

3、強度和核酸的濃度成正比，可以利用這個特性測定核酸溶液的濃度。1.樣品DNA濃度的計算方法規(guī)定雙鏈DNA含量為50 g/ml、單鏈DNA含量為33 g/ml、 單鏈RNA含量為40g/ml時，在波長260nm處的吸光度為1，即 OD260=1。例如：某雙鏈DNA樣品測量結(jié)果OD260=1.5，則該樣品的濃度為：1.5×50 g/ml=75 g/ml2. 樣品DNA純度的測定方法計算樣品DNA在波長260nm與280nm吸光度的比值，即OD260/ OD280純凈的DNA：OD260/ OD280=1.8，純凈的RNA OD260/ OD280=2.0若1.8表明樣品中有RNA污染若1.

4、8說明有蛋白質(zhì)污染三、實驗器材1.水浴鍋2.離心機3.移液槍4.分光光度計四、實驗材料及藥劑實驗材料：上次課提取的菠菜葉片核酸1.Tris飽和酚F 作用：強蛋白質(zhì)變性劑。 F 商品信息：瓶/250ml。F 理化性質(zhì)：為淺黃色透明液體，上層為Tris-HCl溶液，加有抗氧化的0.25% 8-羥基喹啉和0.1%的-巰基乙醇。F 儲存：4避光保存。F 危害：Tris飽和酚有較強的腐蝕性，應(yīng)盡量避免皮膚直接接觸或吸入體內(nèi)。如發(fā)現(xiàn)變?yōu)辄S色或棕色，表明發(fā)生氧化，不能使用。2.氯仿（三氯甲烷）F 作用：蛋白質(zhì)變性劑，加速有機相與液相分層，去除核酸溶液中的跡量酚。F 商品信息：瓶/500ml。F 理

5、化性質(zhì)：無色透明重質(zhì)液體，極易揮發(fā)，有特殊氣味。不溶于水，溶于醇、醚、苯。F 儲存：保存在密封的棕色瓶中。F 危害：麻醉性。有致癌可能性。在光照下遇空氣逐漸被氧化生成劇毒的光氣。3.異戊醇F 作用：減少蛋白質(zhì)變性操作過程中產(chǎn)生的氣泡。異戊醇可以降低表面張力，從而減少氣泡產(chǎn)生。另外，異戊醇有助于分相，使離心后的上層含DNA的水相、中間的變性蛋白相及下層有機溶劑相維持穩(wěn)定。F 商品信息：瓶/500ml。F 理化性質(zhì)：無色液體，有不愉快的氣味。微溶于水，可混溶于醇、醚等有機溶劑。F 儲存：儲存于陰涼、通風(fēng)的庫房。遠離火種、熱源。庫溫不宜超過30。保持容器密封。應(yīng)與氧化劑、酸類等分開存放，切忌混儲。采

6、用防爆型照明、通風(fēng)設(shè)施。禁止使用易產(chǎn)生火花的機械設(shè)備和工具。儲區(qū)應(yīng)備有泄漏應(yīng)急處理設(shè)備和合適的收容材料。F 危害：吸入、口服或經(jīng)皮膚吸收有麻醉作用。其蒸氣或霧對眼睛、皮膚、粘膜和呼吸道有刺激作用，可引起神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂，長時間接觸有麻醉作用。易燃，其蒸氣與空氣可形成爆炸性混合物，遇明火、高熱能引起燃燒爆炸。4.無水乙醇F 作用：DNA沉淀劑、洗滌劑。F 商品信息：瓶/500ml，分析純AR。F 理化性質(zhì)：無色澄清液體。有灼燒味。易流動。極易從空氣中吸收水分，能與水和氯仿、乙醚等多種有機溶劑以任意比例互溶。F 儲存：儲存于陰涼、通風(fēng)的庫房。遠離火種、熱源。庫溫不宜超過30。保持容器密封。應(yīng)與氧化

7、劑、酸類、堿金屬、胺類等分開存放，切忌混儲。采用防爆型照明、通風(fēng)設(shè)施。禁止使用易產(chǎn)生火花的機械設(shè)備和工具。F 危害：易燃，具刺激性。蒸氣與空氣能形成爆炸性混合物，爆炸極限3.5%18.0%（體積）。5.核糖核酸酶A（RNase A）F 作用：去除DNA制品中的RNA。F 商品信息：小瓶/25mg。F 理化性質(zhì)：類白色結(jié)晶或凍干粉。F 儲存：-20保存。F 危害：6.三羥甲基氨基甲烷（Tris）F 作用：生物緩沖劑，用于緩沖液的制備，保護核酸。F 商品信息：白色塑料瓶/500g，試驗試劑LR 。 F 理化性質(zhì)：白色結(jié)晶或結(jié)晶性粉末。25時溶解度(mg/ml)：水550、無水乙醇14.6。水溶液在

8、空氣中不吸收二氧化碳。對銅、鋁有腐蝕作用。F 儲存： 常溫密封避光保存F 危害： 有刺激性五、實驗試劑1.RNA酶（10mg/ml）：1mlRNase A 10mg + 2MTris-HCl（PH7.5）5l +5MNaCl溶液3l +992l水 1mlRNA酶 100沸水浴中20分鐘（除去DNA酶） 冷卻后-4保存（長期保存-20）Ø 【2MTris-HCl（PH7.5）緩沖液】配制：10mlTris 2.42g + 水5ml 用HCl調(diào)PH7.5 定容至10ml Ø 【5M NaCl溶液】配制：100mlNaCl 29.22g + 水90ml 加熱到80溶解冷卻后 定容

9、至100ml 高壓滅菌備用2.氯仿-異戊醇（24:1）100ml-20ml=80ml氯仿 96ml + 異戊醇 4ml = 100ml，4保存3.酚-氯仿-異戊醇（25:24:1）40ml氯仿-異戊醇（24:1）20ml + Tris飽和酚20ml = 40ml，4保存4.70%乙醇：10ml無水乙醇7ml +水3ml 70%乙醇10ml5.TE緩沖液 PH8.0 50ml10mM Tris-HCl（PH8.0）緩沖液 0.5ml + 0.5M EDTA（PH8.0）0.1ml 定容到50ml 高壓滅菌后冷卻4保存Ø 【0.5M EDTA（PH8.0）】的配制：100ml蒸餾水 80

10、ml + EDTA-2Na.2H2O 18.61g 用NaOH（約2g）調(diào)至PH8.0 定容至100ml 分裝后高壓滅菌備用。注：需加入NaOH調(diào)至PH8.0才能完全溶解。Ø 【10mM Tris-HCl（PH8.0）緩沖液】的配制：10ml1M Tris-HCl PH8.0緩沖液100l + 水9.9ml 定容至10ml 10mM Tris-HCl（PH8.0）緩沖液六、實驗步驟（一）實驗前準備：DNA樣品（課前取出放至室溫）1.實驗儀器：水浴鍋（37）、移液槍（2ml、5l、100µl、250µl、300µl、500µl）、離心機（1000

11、0、12000r/m） 2.實驗試劑：TE緩沖液75ml（每管2ml+500l）、RNA酶150l（每管5l）、酚-氯仿-異戊醇3ml（每管100l）、氯仿-異戊醇3ml（每管100l）、無水乙醇7.5ml（每管250l）、70%乙醇9ml（每管300l）（二）DNA的純化1.將DNA樣品放至室溫加入2ml TE緩沖液；Ø 目的：保護DNA。2.加入5l RNA酶，37水浴30分鐘 ；Ø 目的：去除DNA制品中的RNA。3.加100µl酚-氯仿-異戊醇，顛倒混勻，10分鐘，10000r/m離心10分鐘，取上清液（含DNA）到一新的10ml離心管中；Ø 目

12、的：使蛋白質(zhì)變性，溶液分相。經(jīng)過離心溶液分成三層，上-中-下層：DNA溶液-變性蛋白-有機溶劑。4.加100µl氯仿-異戊醇, 顛倒混勻，10分鐘，10000r/m離心10分鐘，取上清液（含DNA）到一新的10ml離心管中；Ø 目的：進一步去掉變性蛋白，去掉多余的酚。5.加250µl的無水乙醇， 12000 r/m離心10分鐘，棄乙醇。 Ø 目的：無水乙醇沉淀DNA。6.加300µl 70%乙醇洗滌DNA，10000 r/m，離心5分鐘，棄乙醇。 Ø 目的：70%乙醇洗滌脫鹽。提取DNA時會加入高濃度的NaCl鹽溶液，Na離子會與DN

13、A結(jié)合形成DNA-陽離子鹽溶于溶液中,再用無水乙醇可以將DNA-陽離子鹽沉淀下來,但這樣一來,DNA中就含有較多的鹽離子,這勢必會影響下一步實驗的進行,所以要用70%乙醇洗滌DNA沉淀(因為在70%乙醇里DNA是不溶的,而鹽離子卻可溶),用無水乙醇則達不到這個目的!7.晾干，加500µl TE溶解DNA，-20保存。Ø 目的：一般長期保存DNA，貯存在TE緩沖液中比較好。TE為含EDTA的Tris-HCl(PH 8.0)緩沖液：其中比較關(guān)鍵的成分是EDTA，日常環(huán)境中不可避免的存在DNase，而DNase的活性依賴于鈣離子，并能被鎂離子或二價錳離子激活。鎂離子存在條件下，D

14、Nase I可隨機剪切雙鏈DNA的任意位點；二價錳離子存在條件下，DNase I可在同一位點剪切DNA雙鏈，形成平末端，或1-2個核苷酸突出的粘末端。TE中含有的EDTA可以螯合金屬離子，從而使DNase失活。而Tris-HCl的作用主要是維持一定堿性PH值，有助于DNA的溶解和穩(wěn)定。不加EDTA也是可以的，而且EDTA會影響下游酶切，連接反應(yīng)以及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進細胞的效率，如果接下來要做這些實驗是應(yīng)該避免使用含EDTA的緩沖液的。短期儲存DNA也可以使用ddH2O，有助于DNA連接等效果。（二）紫外吸收法測DNA的濃度和純度1.開機。接通電源，打開開關(guān)，預(yù)熱及自檢20分鐘左右2.稀釋。用TE緩沖液把待測DNA樣品稀釋50倍3.調(diào)零。將做對照的TE緩沖液和待測DNA樣品分別注入到不同的比色皿中，體積為3/4。將比色皿放入樣品槽，關(guān)閉蓋板。點擊歸零鍵，儀器自動校正零點4.測量。點擊相關(guān)按鈕，分別測量樣品DNA在260nm和280nm處的光密度值（即OD值），待讀數(shù)穩(wěn)定后，每個樣品測量3次，取平均值5.關(guān)機。打開蓋板，取出比