地中海貧血基因檢測和結(jié)果分析

1、地中海貧血基因檢測和結(jié)果分析主要內(nèi)容一、什么是地中海貧血及分布二、地中海貧血的致病機(jī)制三、地中海貧血的基因診斷四、最新的地中海貧血檢測方法五、檢測結(jié)果分析及報(bào)告一、什么是地中海貧血定義：定義：由于珠蛋白基因發(fā)生缺陷，致使珠蛋 白肽鏈合成減少或缺失，導(dǎo)致血紅 蛋白的鏈/非鏈比例失衡，而引起 的一組遺傳性溶血性疾病，亦稱海洋性貧血。 血紅蛋白病血紅蛋白病：由于珠蛋白基因發(fā)生缺陷，致使珠蛋 白分子的一級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而導(dǎo)致血紅 蛋白的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變的一組遺傳性疾病。 地中海貧血是最常見的血紅蛋白病，珠蛋白合成障礙性貧血為國內(nèi)稱呼，國外不用。地中海貧血分類地中海貧血分類1、按照一個(gè)單倍型上的-珠蛋

2、白基因的功能缺陷定義0地貧（也有稱地貧1） ：-珠蛋白基因完全 基因記為-/ 喪失功能。 +地貧（也有稱地貧2）： -珠蛋白基因保 基因記為-/ 留有部分功能。地中海貧血分類 2、按照肽鏈內(nèi)切酶分型缺失型地貧：珠蛋白肽鏈存在片段缺失而造 成功能缺陷非缺失型地貧：珠蛋白肽鏈上不存在缺失，而是 （點(diǎn)突變） 由于基因的點(diǎn)突變造成的肽鏈功能 缺陷地中海貧血分類 3、根據(jù)基因缺失或突變個(gè)數(shù)可分為：靜止型： 缺失1個(gè)基因，基因型記為-/ 1個(gè)基因突變，基因型記為/T輕型： 缺失2個(gè)基因，基因型記為：-/或-/- 2個(gè)基因突變，基因型記為： T/T 中間型： 缺失3個(gè)基因，基因型記為：-/- 缺失與突變混合

3、，基因型為：-/T或純合突變重型： 缺失4個(gè)基因，基因型記為：-/- 缺失與突變混合，基因型為：-/T地中海貧血分類1、根據(jù)肽鏈的功能缺失0地貧 ： 珠蛋白基因功能完全喪失，不能合成肽鏈地貧 ： 珠蛋白基因尚保留部分功能2、根據(jù)臨床癥狀靜止型地貧： 突變雜合子（ N/ +），中國人少見輕型型地貧：突變雜合子（ N/ +、 0/ N）中間型地貧：突變雙重雜合子/突變純合子 （ +/ +、 0/ +）重型地貧： 突變雙重雜合子/突變純合子 （ 0/ 0、 0/ +）中國人中國人HPFHHPFH和和-地貧的基因突變類型及地貧的基因突變類型及表型特征表型特征 世界地中海貧血的流行分布廣西地中海貧血的流

4、行分布853共共57895789例例224例例834例例790例例1033例例1349例例1559例例 Xiong , et al. Clin Genet 2010廣西地中海貧血的流行分布引起珠蛋白表達(dá)降低的常見缺失突變類型分布 MC10kb0kb20kb 30kb 40kb10kb3HVRinterHVR53 2 1 2 1 THAI BRIT FIL MED SEA SPAN HW BlackBelgianIndianMalaysian 2GermanTurkishItalianGantoneseYunnaneseChineseTaiwanese 0kb 50kb 100kb 150kb

5、G A LCR引起地中海貧血常見的基因缺失突變類型分步12 種見于中國人群的 2/ 1珠蛋白基因點(diǎn)突變 CD31CD125 EXON I EXON II EXON IIIIVS IIVS II UTRUTR53CD13CD59 CD122 CD142 CD44CD49CD30 2 1Missense mutationMini deletion or insersionTermination mutationFrameshiftCD78 CD74 CD118 啟動(dòng)子突變啟動(dòng)子突變異常剪接異常剪接起始密碼突變起始密碼突變移碼突變移碼突變無義突變無義突變3UTR突變突變EXON 1IVS 1 EXO

6、N 2EXON 3 IVS 2顯性突變顯性突變53 46 種見于中國南方人群的-珠蛋白基因點(diǎn)突變 中國南方人群最為常見的地貧類型二、地中海貧血的致病機(jī)制胎兒血紅蛋白主要由兩條胎兒血紅蛋白主要由兩條 珠蛋白鏈、兩條珠蛋白鏈、兩條 珠蛋白鏈組成，還含有珠蛋白鏈組成，還含有 鏈、鏈、鏈、鏈、鏈組成鏈組成成年人的血紅蛋白由兩條成年人的血紅蛋白由兩條 珠蛋白鏈和兩條珠蛋白鏈和兩條 珠蛋白鏈組成珠蛋白鏈組成血紅蛋白血紅蛋白紅細(xì)胞紅細(xì)胞 鏈鏈 鏈鏈血紅素血紅素鐵鐵 鏈鏈 鏈鏈二、地中海貧血的致病機(jī)制11p15.3珠蛋白基因簇16p13.3珠蛋白基因簇HbA HSHS 40 40 2 2 1 1 2 2 HS

7、 5 4 3 2 1 HS 5 4 3 2 1 G G A A 二、地中海貧血的致病機(jī)制人體不同發(fā)育時(shí)期的珠蛋白生成變化規(guī)律人體不同發(fā)育時(shí)期的珠蛋白生成變化規(guī)律二、地中海貧血的致病機(jī)制靜態(tài)突變靜態(tài)突變點(diǎn)突變點(diǎn)突變 片段突變片段突變 動(dòng)態(tài)突變動(dòng)態(tài)突變 堿基替換堿基替換移碼突變移碼突變串聯(lián)重復(fù)的三核苷酸序列隨著串聯(lián)重復(fù)的三核苷酸序列隨著世代的傳遞而拷貝數(shù)逐代累加世代的傳遞而拷貝數(shù)逐代累加 缺失缺失重復(fù)重復(fù)重排重排基因突變的分子機(jī)制基因突變的分子機(jī)制基因致病突變是地貧發(fā)生的分子基礎(chǔ)基因致病突變是地貧發(fā)生的分子基礎(chǔ)二、地中海貧血的致病機(jī)制三、地中海貧血基因分析1、Gap-PCR 用于和等缺失型地貧的檢

8、測221111 22111 1 SEA3.74.2A AB BC CD DE EF FG G原理：普通的酶無法擴(kuò)增出長距離的片段，通過設(shè)計(jì)出與缺失序列的兩側(cè)翼序原理：普通的酶無法擴(kuò)增出長距離的片段，通過設(shè)計(jì)出與缺失序列的兩側(cè)翼序列互補(bǔ)的引物，當(dāng)存在缺失時(shí)，由于肽鏈靠近從而擴(kuò)增出片段。列互補(bǔ)的引物，當(dāng)存在缺失時(shí)，由于肽鏈靠近從而擴(kuò)增出片段。三、地中海貧血基因分析2、PCR-RDB 用于檢測和點(diǎn)突變PCR膜條膜條雜交雜交顯色顯色三、地中海貧血基因分析地貧基因檢測的策略：地貧：先檢測常見缺失型，然后檢測非缺失（點(diǎn) 突變），最后是未知的缺失和突變位點(diǎn)。 因?yàn)?0% 地貧為常見的三種缺失型 （-sea,

9、-3.7,-4.2)。地貧：先檢測點(diǎn)突變，然后檢測少見的缺失型。 大部分地貧都是點(diǎn)突變型。 血紅蛋白病的篩查及基因診斷的技術(shù)流程遺傳咨詢遺傳咨詢 產(chǎn)前地貧攜帶者篩查策略產(chǎn)前地貧攜帶者篩查策略同時(shí)正常同時(shí)正常產(chǎn)檢對象（孕婦及其配偶）產(chǎn)檢對象（孕婦及其配偶）地貧分子診斷地貧分子診斷 知情同意選擇知情同意選擇 胎兒產(chǎn)前基因診斷胎兒產(chǎn)前基因診斷血液五分類分析（關(guān)注血液五分類分析（關(guān)注MCV和和MCH）+血紅蛋白電泳（血紅蛋白電泳（Hb A2)雙方某項(xiàng)指標(biāo)雙方某項(xiàng)指標(biāo)均同時(shí)降低均同時(shí)降低一方正常，另一方一方正常，另一方的指標(biāo)的指標(biāo)降低降低地貧全套檢查地貧全套檢查異常的一方做地貧全套檢查異常的一方做地貧全

10、套檢查-地貧特征地貧特征-地貧特征地貧特征ID雙方均為雙方均為-地貧特征地貧特征一方為一方為-地貧特征，另一地貧特征，另一方為方為ID或或-地貧特征地貧特征+-單純性單純性ID或單或單純性純性-地貧地貧雙方均為雙方均為-地貧特征地貧特征ID或或-地貧特征的一方地貧特征的一方做做地貧分子診斷地貧分子診斷 夫婦雙方基因診斷夫婦雙方基因診斷血血R正常的正常的一方做一方做地地貧分子診斷貧分子診斷 -單純性單純性ID或單或單純性純性-地貧地貧-+僅異常血紅蛋白必要時(shí)測序或選擇其中一種地貧檢測四、最新的地中海貧血檢測方法1、融鏈曲線分析法 用于檢測或缺失和點(diǎn)突變Thongperm, et al. Jour

11、nal of Molecular Diagnostics .2010Xiong F, et al. J Mol Diagn. 2011Christina V，et al. Clinical Chemistry. 2003原理：根據(jù)每條肽鏈都有自己的Tm值，從而可以通過溫度差來判斷四、最新的地中海貧血檢測方法2、MLPA（多重連接探針擴(kuò)增） 用于尋找未知缺失斷裂點(diǎn)Xiao-Feng Wei，et al. Ann Hematol. 2011四、最新的地中海貧血檢測方法3、毛細(xì)管電泳 可以檢測非缺失CS（Hb CS)和 E地貧Hb AHb EHb A2Can Liao, et al. Europea

12、n Journal of Haematology. 2010 四、最新的地中海貧血檢測方法4、DHPLC（變性高效液相色譜） 用于缺失型和突變型地貧都可以李倩，南方醫(yī)科大學(xué)論文，2010四、最新的地中海貧血檢測方法5、基因序列測定（PCR+毛細(xì)管電泳） 用于未知突變位點(diǎn)或確定缺失片段的位置 由于儀器比較貴重，技術(shù)要求高，目前尚未在臨床一線 推廣，只在科研實(shí)驗(yàn)室里開展。Azam Amirian MSc， et al. Archives of Iranian Medicine. 2011四、最新的地中海貧血檢測方法6、母體血漿中胎兒游離核酸的測定嚴(yán)提珍，國際輸血及血液學(xué)雜志，2009嚴(yán)提珍，國際輸

13、血及血液學(xué)雜志，2009五、檢測結(jié)果分析及報(bào)告（一）地貧基因診斷1 1、 - - -SEA SEA / /2 2、 / /3 3、 / / 4 4、- - -SEA SEA /-/- 5 5、- - -SEA SEA /-/- 6 6、- - -SEA SEA /-/- 7 7、 / /8 8、 - - -SEA SEA / /9 9、 DNA MarkerDNA Marker缺失型地貧電泳結(jié)果 1 2 3 4 5 6 7 8 9非缺失雜交結(jié)果非缺失雜交結(jié)果CS純合WS雜合未檢測到6種突變（注意不是正常） 28/N IVS-II-654 /N CD17/N CD4142/ N 28/ 28CD17/IVS-II-654ABCDEF地中海貧血點(diǎn)突變分析結(jié)果血涂片染色（包涵體）Cornelis L H，Orphanet Journal of Rare Diseases， 2010五、檢測結(jié)果分析及報(bào)告（三）基因診斷報(bào)告單1、臨床地貧基因報(bào)告 主要是常規(guī)試劑可以檢測到的類