固相萃取高效液相色譜法測(cè)定環(huán)境水樣中的幾種芳胺

1、固相萃取-高效液相色譜法測(cè)定環(huán)境水樣中的幾種芳胺摘 要:研究了用固相萃取富集和高效液相色譜法測(cè)定環(huán)境水樣中的幾種芳胺(苯胺、對(duì)甲基苯胺、2,4-二甲基苯胺、1-萘胺、2-萘胺和4-氨基聯(lián)苯)的方法，環(huán)境水樣中的芳胺用1-萘酚衍生生成偶氮染料，偶氮染料用Waters Sep-Pak-C18 固相萃取小柱固相萃取富集，然后以Waters XterraTMRP18(3.9×150mm, 5m)色譜柱為固定相，82%的甲醇(內(nèi)含0.01mol/L pH=8 的四氫吡咯-醋酸緩沖鹽)為流動(dòng)相分離，二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè)測(cè)定；苯胺、對(duì)甲基苯胺、2,4-二甲基苯胺、4-氨基聯(lián)苯、1-萘胺和2-萘胺的

2、檢測(cè)限分別為0.8、0.6、0.6、0.6、0.4 和0.4 g/L。幾種芳胺的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.1%2.6%之間，標(biāo)準(zhǔn)回收率在93%106%之間，方法用于環(huán)境水樣中幾種芳胺的測(cè)定，結(jié)果令人滿(mǎn)意。關(guān)鍵詞 高效液相色譜法 固相萃取 芳胺 芳胺是一類(lèi)重要的環(huán)境污染物，是環(huán)保衛(wèi)生部門(mén)的重要檢測(cè)指標(biāo)1,2。芳胺的測(cè)定方法主要有光度法、電化學(xué)法、色譜法等，其中高效液相色譜法是最常用的方法。但是對(duì)于許多復(fù)雜環(huán)境樣品，芳胺的含量只是微克級(jí)，而且樣品中還存在大量其它有紫外吸收的物質(zhì)，這些物質(zhì)很難和芳胺完全分離，會(huì)干擾芳胺的測(cè)定。為了能有選擇性地測(cè)定環(huán)境水樣中的芳胺，研究了用1-萘酚衍生，讓1-萘酚和芳胺重氮偶

3、合生成偶氮染料，然后用固相萃取富集、高效液相色譜分離測(cè)定芳胺的方法。由于該方法采用了1-萘酚衍生，衍生反應(yīng)對(duì)芳胺是特效的，且衍生后生成的幾種偶氮染料最大吸收波長(zhǎng)在460500nm之間，該波長(zhǎng)下樣品中其它有紫外吸收的物質(zhì)無(wú)吸收，不干擾芳胺的測(cè)定，方法選擇性大大增加。結(jié)合固相萃取對(duì)待測(cè)組分的高倍數(shù)富集，該方法可準(zhǔn)確測(cè)定環(huán)境樣品中g(shù)/L 級(jí)的幾種主要芳胺。1 實(shí)驗(yàn)部分1.1 主要儀器和試劑濟(jì)南海能儀器股份有限公司高效液相色譜儀，包括LC7010四元泵LC7050自動(dòng)進(jìn)樣器，LC7060二極管陣列檢測(cè)器，Hanon-Clarity色譜管理軟件；苯胺、1-萘胺、2-萘胺、對(duì)甲基苯胺、2,4-二甲基苯胺和

4、4-氨基聯(lián)苯標(biāo)樣(含量99%，購(gòu)于Fluka 公司)，用50%乙醇-水溶液配成1.0mg/mL 的儲(chǔ)備液，使用時(shí)用50%乙醇-水溶液稀釋成1.0g/mL 的標(biāo)準(zhǔn)工作液；1-萘酚溶液：2.0%(w/v)，用50%乙醇-水溶液配制；硫酸氫鉀(KHSO4)溶液：5%(w/v)，用水配制；亞硝酸鈉溶液：5%(w/v)，用水配制；氨基磺酸銨溶液：2.5%(w/v)，用水配制；氫氧化鈉溶液：3mol/L，用水配制；甲醇：高效液相色譜專(zhuān)用(Fisher 公司生產(chǎn))；實(shí)驗(yàn)用水為石英亞沸蒸餾水并用Milli-Q50(Millipore 公司)超純水儀處理，電阻>18 M·cm-1。1.2 色譜條

5、件色譜柱為 RP18 液相色譜柱(3.9×150mm, 5m)；固相萃取柱為C18 固相萃取小柱(填料為十八烷基鍵合硅膠，粒度30m，柱腔容積為1mL，萃取容量為30mg)；流動(dòng)相為82%的甲醇(內(nèi)含0.01mol/L pH=8 的四氫吡咯-醋酸緩沖鹽)，流速0.5mL/min；進(jìn)樣體積20L。在該色譜條件下標(biāo)準(zhǔn)品和水樣在480nm 波長(zhǎng)下的色譜圖見(jiàn)圖1。1.3 測(cè)定方法根據(jù)樣品中芳胺含量，酌情取適量水樣于100mL 錐形瓶中，用5%的鹽酸調(diào)節(jié)pH 至1.52.0(用精密pH 試紙測(cè)試)后，加入5%的亞硝酸鈉溶液0.1mL，充分搖勻，放置5min；然后加入2.5%的氨基磺酸銨溶液0.

6、5mL，充分振蕩至氣泡消除(消除過(guò)量亞硝酸鈉的影響)，然后再加入2%的1-萘酚溶液3mL 和3mol/L 的氫氧化鈉溶液2.5mL，充分搖勻，定容到100mL，該有色溶液以20mL/mim 的流速通過(guò)活化好的固相萃取小柱，過(guò)完柱后小柱上富集的待測(cè)組份用2.0mL 的乙醇以5mL/min 的流速洗脫；洗脫液用0.45m 的針頭過(guò)濾器過(guò)濾，進(jìn)樣20L 分析。2 結(jié)果與討論2.1 柱前衍生條件由于復(fù)雜水樣中含有大量的其它有紫外吸收的物質(zhì)，如果不經(jīng)衍生直接分析，樣品中的芳胺無(wú)法和這些成分完全分離，會(huì)嚴(yán)重干擾芳胺的測(cè)定。因此采用柱前衍生的方法讓芳胺生成偶氮染料，衍生反應(yīng)對(duì)芳胺是特效的，而且生成的偶氮染料

7、最大吸收波長(zhǎng)紅移到460500nm 之間，在該波長(zhǎng)下其它有紫外吸收的干擾組分無(wú)吸收，在色譜上不出峰，不干擾芳胺的測(cè)定，方法選擇性得到很大提高。芳胺的衍生劑常用的有8-羥基喹啉、1-萘酚、鄰甲氧基苯酚和N-(1-萘基)乙二胺等，對(duì)幾種試劑作了比較，效果以1-萘酚最好，因此本實(shí)驗(yàn)選用1-萘酚作為芳胺的衍生試劑。衍生條件參照文獻(xiàn)，芳胺先在硫氫酸鉀和亞硝酸鈉介質(zhì)中生成重氮鹽，用氨基磺酸胺分解過(guò)量的亞硝酸鈉，然后在堿性條件下和1-萘酚重氮偶聯(lián)即可生成偶氮染料。重氮化反應(yīng)的最佳反應(yīng)條件為用5%的硫酸氫鉀溶液將水樣pH 調(diào)節(jié)至1.52.0 后加入5%的亞硝酸鈉溶液0.1mL，反應(yīng)5min 可完全；重氮化反應(yīng)

8、完全后可和1-萘酚偶聯(lián)，偶聯(lián)反應(yīng)的最佳條件為加入3mL 2%(w/v)的1-萘酚，在pH 8.213.5 范圍內(nèi)進(jìn)行偶聯(lián)，通過(guò)加入3mol/L 的氫氧化鈉溶液2.5mL 控制偶聯(lián)反應(yīng)在該pH 范圍。實(shí)驗(yàn)表明偶聯(lián)反應(yīng)瞬間可反應(yīng)完全，而且生成的偶氮染料在放置10h 后吸光度不變，說(shuō)明偶氮染料生成后至少可穩(wěn)定10h。2.2 固相萃取條件選擇環(huán)境水樣中的芳胺含量很低，只在g 級(jí)，不經(jīng)富集很難用液相色譜法準(zhǔn)確測(cè)定。由于用溶劑萃取法富集誤差較大，操作麻煩，且易污染環(huán)境，因此本實(shí)驗(yàn)采用固相萃取法富集。小柱對(duì)芳胺衍生后生成的偶氮染料的固相萃取可用疏水締合原理解釋。即偶氮染料具有一定的疏水性，以水溶液通過(guò)小柱時(shí)

9、能富集在小柱上，改用少量溶劑強(qiáng)度大的溶劑(乙醇、乙腈、四氫呋喃等)洗脫就能把絡(luò)合物洗下而達(dá)到富集。用Waters SPE 真空提取裝置，每次可同時(shí)處理20 個(gè)樣，小柱活化和樣品富集的流速均為20mL/min，小柱用2mL 乙醇活化，再用10mL 水洗去殘留的乙醇；樣品(有色溶液)以20mL/min 的流速通過(guò)小柱(廠家提供小柱對(duì)待富集物的參考萃取容量為30mg，而樣品中的芳胺含量只為微克級(jí)，因此不會(huì)超過(guò)小柱的萃取容量)，通過(guò)小柱后的流出液為無(wú)色，而且收集流出液再萃取一次也未見(jiàn)小柱上有紅色物質(zhì)保留，說(shuō)明一次固相萃取就能完全萃取生成的偶氮染料。樣品富集完后可用洗脫劑洗脫，實(shí)驗(yàn)了不同洗脫劑洗脫小柱上

10、的有色絡(luò)合物，用乙醇、乙腈、丙酮、四氫呋喃、甲醇等極性有機(jī)溶劑均可使小柱上富集的偶氮染料完全洗下。在幾種溶劑中由于乙醇揮發(fā)性弱、無(wú)毒且價(jià)格便宜，因此實(shí)驗(yàn)選用乙醇作洗脫劑，乙醇用量在2.0mL左右即可把小柱上富集的絡(luò)合物完全洗下。2.3 色譜分離條件的選擇實(shí)驗(yàn)表明，用82%的甲醇作流動(dòng)相，六種芳胺衍生生成的偶氮染料可達(dá)到完全分離。但是，芳胺衍生生成的偶氮染料有酸式和堿式兩種結(jié)構(gòu)，pH5.4 時(shí)以酸式結(jié)構(gòu)存在，為黃色，pH5.4時(shí)以堿式存在，為紅色，堿式結(jié)構(gòu)具有更高的靈敏度和更好的峰形，因此實(shí)驗(yàn)選擇在流動(dòng)相中加入0.01mol/L pH=8 的四氫吡咯-醋酸緩沖鹽，保持偶氮染料在分離過(guò)程中以堿式結(jié)

11、構(gòu)存在。2.4 色譜峰的識(shí)別和檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇樣品中各芳胺的色譜峰均由其保留時(shí)間及二極管陣列檢測(cè)器400650nm波長(zhǎng)掃描所得光譜圖與標(biāo)樣對(duì)照確認(rèn)，并作了色譜峰純度分辨，證明各芳胺均達(dá)到完全分離，無(wú)重疊峰，各芳胺衍生后生成的偶氮染料的吸收曲線見(jiàn)圖2；為了獲得最高靈敏度，各成分均在最大吸收波長(zhǎng)下檢測(cè)。2.5 工作曲線用峰面積定量法得工作曲線，進(jìn)樣量為20L 時(shí)，根據(jù)信燥比S/N=3，算得各組分的檢測(cè)限，結(jié)果見(jiàn)表1。表中A 為峰面積，C 單位為(g/mL)。2.6 樣品分析及結(jié)果清潔水樣可直接按測(cè)定方法測(cè)定，混濁水樣需用鹽酸酸化后濾去懸浮物或殘?jiān)?，再按測(cè)定方法測(cè)定。水樣每種等量取兩份，其中一份加入1g 的苯胺、對(duì)甲基苯胺、2,4-二甲基苯胺、4-氨基聯(lián)苯、1-萘胺、2-萘胺標(biāo)樣，另一份不加，按測(cè)定方法測(cè)定，每種平行測(cè)定5 次，計(jì)算5 次平行測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，并按加標(biāo)樣品測(cè)出量減去未加標(biāo)樣品測(cè)出量再除以標(biāo)準(zhǔn)加入量計(jì)算平均回收率，結(jié)果(扣除試劑空白)見(jiàn)表2。3 結(jié)論用1-萘酚衍生環(huán)境水樣中的幾種芳胺生成偶氮染料，用固相萃取富集偶氮染料，二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè)測(cè)定了環(huán)境水樣中的幾種芳胺。由于采用了1-萘酚衍生，衍生反應(yīng)對(duì)芳胺是