生理學(xué)(2015級)細(xì)胞膜離子通透性的測定

1、細(xì)胞膜離子通透性的測定電壓鉗實(shí)驗(yàn)早在 1902 年， Julius Bernstein 就提出膜學(xué)說用以解釋生物電的產(chǎn)生機(jī)制，認(rèn)為細(xì)胞膜兩側(cè)帶電離子的不同分布和跨膜擴(kuò)散是產(chǎn)生生物電的基礎(chǔ)。但直到 1939 年英國科學(xué)家AlanHodgkin 和 Andrew Huxley 在槍烏鲗巨神經(jīng)軸突橫斷面上插入0.1mm 直徑的微電極才第一次真正記錄到了靜息電位。由于他們測得的細(xì)胞內(nèi)電位數(shù)值和K+的平衡電位非常接近，從而證實(shí)了 Bernstein膜學(xué)說中關(guān)于靜息電位產(chǎn)生機(jī)制的推斷，即在安靜情況下細(xì)胞膜對K+通透性較大，K+外流是靜息電位產(chǎn)生的主要原因。然而， Hodgkin和Huxley在接下來記錄細(xì)

2、 胞受到刺激發(fā)生動作電位的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，動作電位的幅度大大超過了零電位，表現(xiàn)為膜電位的倒轉(zhuǎn)。這一現(xiàn)象無法用Bernstein 膜學(xué)說中提出的動作電位是膜對各種離子通透性普遍增大而使靜息電位暫時(shí)消失來解釋，因?yàn)檫@樣的解釋，其結(jié)果是膜電位變?yōu)榱?。Hodgkin 和Huxley發(fā)現(xiàn)，用葡萄糖或氯化膽堿等張地替代細(xì)胞外液中Na+時(shí)，動作電位幅度會隨著細(xì)胞外液中Na+的減少而降低；又考慮到動作電位的超射值(+30+50mV)接近經(jīng)公式計(jì)算的鈉平衡電位(+50+70mV )。Hodgkin和Huxley由此認(rèn)為：動作電位發(fā)生時(shí)膜對Na+的通透性瞬間增大，并遠(yuǎn)超過對K+的通透性，動作電位的去極化和復(fù)極化時(shí)相可

3、能是膜對Na+和K+的通透性發(fā)生選擇性改變的結(jié)果。然而，如何能夠直接觀察動作電位期間膜對Na+和K+通透性的變化呢？ 20 世紀(jì) 40 年代后期，Hodgkin 和 Huxley 設(shè)計(jì)并成功地在槍烏鲗巨軸突上進(jìn)行了著名的電壓鉗(voltage clamp)實(shí)驗(yàn)。他們通過測定跨膜離子電流來觀察膜通透性的改變，證實(shí) 了膜對Na+和K+通透性的相繼改變是形成動作電位的離子基礎(chǔ)。由于這一貢獻(xiàn)，Hodgkin和 Huxley 共同獲得了1963 年的諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。Hodgkin 和 Huxley 通過測定膜電流來反映膜對離子通透性的改變，其設(shè)計(jì)依據(jù)是歐姆定律。因?yàn)閺碾妼W(xué)角度看，離子跨膜移動可形成

4、離子電流(I ion) ，膜的通透性即是離子通過膜的難易程度，可用膜電阻(R)或其倒數(shù)膜電導(dǎo)(Gion)表示，推動離子跨膜移動的動力則是由電位差和濃度差決定的該離子的電- 化學(xué)驅(qū)動力，可用膜電位和離子平衡電位的差值(Vm- Eion)來表不。根據(jù)歐姆7E律，Iion = Gion . (Vm- Eion),如果將驅(qū)動力 Vm - Eion 加以固定，離子電流Iion的變化即可用來表示膜電導(dǎo)Gion或膜通透性的變化。 然而，在動作電位期間，盡管Eion因離子移動量少不會發(fā)生顯著變化，但膜電位Vm則可發(fā)生快速顯著的變化，如從-65mV改變?yōu)?30mV ,這就使離子跨膜移動的驅(qū)動力Vm - Eion

5、發(fā)生了顯著變化，從而使測量所得的離子電流I ion 的變化便失去了意義。在測定膜電流時(shí)如何能使膜電位Vm保持不變？ Hodgkin和Huxley在電壓鉗實(shí)驗(yàn)中，巧妙地應(yīng)用了 Kenneth Cole在1940年發(fā)明的電壓鉗技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了膜電位的固定?！般Q” （clamp）即是固定的意思。電壓鉗實(shí)驗(yàn)的基本原理如圖1所示，在被鉗制的槍烏鯽軸突橫斷面上插入兩根微電極 （此為雙電極電壓鉗，以后的電壓鉗技術(shù)通過快速的開關(guān)轉(zhuǎn)換只需一根電極也能完成雙電極的功能），一根是記錄膜電位的電極E',通過放大器（X1）輸入到示波器監(jiān)測膜電位 Vm。同時(shí)，將信號（Vm）輸入到反饋放大器（FBA）,與另一個(gè)指令電位

6、 （鉗制電位）Vc進(jìn)行比較。當(dāng)兩者電位相等時(shí)（如鉗制電位等于靜息電位），反饋放大器的輸出電流為零；當(dāng)兩者出現(xiàn)差異時(shí)（如鉗制電位突然由靜息電位改變?yōu)?mV,相當(dāng)于一個(gè)刺激），F(xiàn)BA將輸出一個(gè)電流，經(jīng)電極 I'向細(xì)胞內(nèi)注入。該電流流過細(xì)胞膜產(chǎn)生的電位差 使新的膜電位趨向于鉗制電位 Vc,當(dāng)新的膜電位達(dá)到鉗制電位水平時(shí)，反饋放大器的輸入 端因無電位差而注射電流便停止。如此，便構(gòu)成一個(gè)使膜電位Vm始終跟隨或等于鉗制電位Vc的反饋電路。該裝置之所以稱為“電壓鉗”，正是因?yàn)樗軐⒛る娢弧翱刂啤被颉般Q制”到任何想要的水平。這種由改變鉗制電位產(chǎn)生的注射電流通過細(xì)胞膜的阻容耦合電路時(shí)可首 先記錄到的一個(gè)

7、由膜被動特性決定的電容充電電流或稱刺激偽跡。重要的是，當(dāng)細(xì)胞固定于某一鉗制電位 Vc時(shí)，如果膜電導(dǎo) Gion在此時(shí)發(fā)生改變，就會出現(xiàn)隨Gion而變化、能夠反映Gion改變的跨膜離子電流Iion。同樣地，電壓鉗反饋電路也會極其靈敏地探測到由于跨膜離 子電流Iion出現(xiàn)而改變的膜電位，并發(fā)生快速反應(yīng)，經(jīng)電極I'注入與跨膜離子電流Iion同樣大小但方向相反的電流（上述充電電流或刺激偽跡之后記錄到的電流），以精確地對抗跨膜離子電流而使膜電位保持恒定。所以，電壓鉗記錄到電流實(shí)際上并不是跨膜離子電流Iion本身,而是跨膜離子電流的鏡像電流?？傊?，電壓鉗技術(shù)是通過向細(xì)胞內(nèi)注射一定的電流，抵消離子通道

8、開放時(shí)所產(chǎn)生的離子流，從而將細(xì)胞膜電位固定在某一數(shù)值的。如此，便可通過改變膜電位的鉗制水平，記錄不同膜電位下出現(xiàn)的跨膜電流，從而觀察膜電導(dǎo)Gion的變化規(guī)律。Hodgkin和Huxley設(shè)計(jì)電壓鉗實(shí)驗(yàn)的第一個(gè)目標(biāo)是，確定神經(jīng)元膜對離子的通透性是否具有電壓依賴性。結(jié)果表明，當(dāng)膜電位設(shè)定為超極化狀態(tài)時(shí)，不能引起跨膜離子電流和膜電 導(dǎo)的變化；只有設(shè)定為去極化水平時(shí)，才有可能記錄到跨膜離子電流。例如，當(dāng)膜電位由-65mV突然固定到-9mV并持續(xù)幾毫秒時(shí)，首先出現(xiàn)一個(gè)向下的內(nèi)向電流，隨后又出現(xiàn)一個(gè)向上的外向電流。這說明，去極化期間有膜電導(dǎo)Gion的變化。進(jìn)一步的問題是，去極化引起的內(nèi)向和外向電流是什么離

9、子攜帶的？也就是說，去極化使膜對哪些離子的通透性發(fā)生了改變？實(shí)驗(yàn)表明，早期出現(xiàn)的內(nèi)向電流的大小受去極化程度的影響，其翻轉(zhuǎn)電位接近Na+的平衡電位。而且，去除細(xì)胞外的Na+可引起早期內(nèi)向電流極性倒轉(zhuǎn)，但不影響外向電流。特別是，給予特異性影響膜Na+通透性的藥物河豚毒（tetrodotoxin, TTX ）時(shí)，可阻斷內(nèi)向電流；給予特異性影響膜K+通透性的藥物四乙?。╰etraethylammonium, TEA ）時(shí)，可特異性阻斷外向電流。這些結(jié)果證明，持續(xù)去極化過程中有兩種離子的膜電導(dǎo)發(fā)生了改變。Na+電導(dǎo)（GnJ首先加大，然后迅速減??；K+電導(dǎo)（Gk）增加較慢，卻可持續(xù)保持。這就形成了首先出現(xiàn)

10、向下的內(nèi)向電流，隨后出現(xiàn)向上的外向電流。Hodgkin和Huxley電壓鉗實(shí)驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)， 膜電導(dǎo)具有電壓依賴性和時(shí)間依賴性。 由于電壓鉗技術(shù)可方便地提供在任何膜電位水平下膜通透性的信息，因此可將膜電位鉗制于不同的水平，記錄到一組膜電流。 再根據(jù)歐姆定律，可換算成一組膜電導(dǎo)值，用以研究膜電 導(dǎo)和膜電位的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2A所示，GNa和Gk都隨著去極化幅度的增大而增大。其中，去極化程度的增加可引起GNa增加，而GNa增加引起的Na +內(nèi)流又促進(jìn)了膜電位的去極化，兩者互為增強(qiáng)，表現(xiàn)為GNa的正反饋性激活（圖 2B）,這一特征有助于動作電位去極化時(shí)相的快速形成；去極化也使Gk增大，但Gk增

11、大后引起的K+外流將使膜電位向去極化的相反方向變化，即轉(zhuǎn)入復(fù)極化，這可促使去極化后的膜電位向靜息電位迅速恢復(fù)（圖 2C）。同時(shí)，GNa和Gk還具有明顯的時(shí)間依賴性。Gw表現(xiàn)為快速（小于 1ms）一過性激活（電導(dǎo)最大值前為激活，之后為失活），這使Na +內(nèi)流首先出現(xiàn)，引發(fā)了動作電位去極化的產(chǎn)生；Gk則在GNa失活時(shí)逐漸激活，這使 K+外流出現(xiàn)在Na+內(nèi)流之后，與 G失活共同 導(dǎo)致了膜的復(fù)極化。K«卜波1ms圖 2 膜電導(dǎo)的電壓依賴性和時(shí)間依賴性電壓鉗實(shí)驗(yàn)觀察到的GNa和Gk的變化，很好地解釋了動作電位的成因：當(dāng)細(xì)胞受到有效刺激時(shí)，細(xì)胞膜的GNa將首先增大，Na+在較大的電化學(xué)驅(qū)動力推動

12、下出現(xiàn)Na+內(nèi)流，Na+內(nèi)流引起的去極化達(dá)到一定程度后，去極化與 GNa之間出現(xiàn)正反饋，使膜電位急劇上升，形成動作電位迅速上升的去極化時(shí)相和超射。動作電位到達(dá)峰值后GNa迅速下降，同時(shí)Gk逐漸增大，細(xì)胞內(nèi)的 K+在強(qiáng)大的外向驅(qū)動力作用下快速外流，使膜迅速復(fù)極化，形成動作電位的降支，并與升支共同構(gòu)成尖峰狀的鋒電位。（祁金順供稿）單通道電流的記錄膜片鉗技術(shù)Hodgkin 和 Huxley 用電壓鉗技術(shù)記錄到了去極化時(shí)膜電導(dǎo)的改變，證明了動作電位的發(fā)生與膜對Na+和K+通透性的改變有關(guān)。但膜通透性改變的本質(zhì)是什么？Hodgkin和Huxley在電壓鉗記錄全細(xì)胞電流的時(shí)代就提出了離子通道的概念，指出離

13、子通道是膜上一些具有離子選擇性的孔道（hole） 。根據(jù)電壓鉗實(shí)驗(yàn)中測得的離子電導(dǎo)和離子電流特征，他們推測離子通道應(yīng)該具備以下特征：（ 1 ）允許離子高速率地通過（可高達(dá)每秒100 萬個(gè)） ； （ 2）借助電化學(xué)驅(qū)動力推動離子流動；（ 3）具有一定的離子選擇性；（ 4）電壓門控離子通道能感受電壓的改變。甚至，根據(jù) Na+電導(dǎo)和K +電導(dǎo)的電壓依賴性和時(shí)間依賴性，Hodgkin和Huxley 還提出了電壓門控鈉通道具有兩個(gè)閘門（激活門和失活門）、三種狀態(tài)（靜息、激活和失活） ，電壓門控鉀通道具有一個(gè)閘門（激活門）、兩種狀態(tài)（靜息和激活）的工作模型（ H- H 模型） 。然而，關(guān)于這些離子通道的描

14、述在當(dāng)時(shí)（20 世紀(jì) 50 年代）仍然是推測性的，那時(shí)還沒有記錄到單個(gè)離子通道活動形成的離子電流。要想解釋膜電導(dǎo)或膜離子通透性改變的本質(zhì)，還必須通過單通道離子電流的檢測以證實(shí)離子通道的存在和闡明它們活動的特征。而實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)首先要解決的，就是背景噪聲問題，因?yàn)橐话愕募?xì)胞內(nèi)微電極記錄法背景噪聲很大，峰值可達(dá)200pA,而單通道電流僅有12pA。1976年，年輕的德國科學(xué)家 Erwin Neher 和 Bert Sakmann 在電壓鉗工作原理基礎(chǔ)上創(chuàng)建了膜片鉗（patch clamp）技術(shù)， 成功記錄到了骨骼肌終板膜處由單一ACh 門控通道開放形成的單通道電流。15 年后，Neher和Sakma

15、nn共同榮獲了 1991年的諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。他們于1981年發(fā)表在歐洲生理學(xué)雜志上的一篇著名論文Improved Patch-Clamp Techniques for High-ResolutinCurrent Recording from Cells andCell-free Membrane Patches至今已被引用近兩萬次！膜片鉗鉗制電壓的基本原理與電壓鉗相同，不同之處在于它使用的微吸管電極并不刺入細(xì)胞，而是將它的尖端緊緊吸附于膜上（細(xì)胞貼附式，圖1 ） ，因而鉗制和記錄的僅僅是微吸管電極尖端所限定的一小片膜（如幾個(gè)平方微米）， 故稱“膜片鉗”。 這一小片膜上可能存在有一個(gè)或幾個(gè)

16、離子通道，因而有可能記錄到單個(gè)離子通道電流。微電極由玻璃吸管拉制而成，內(nèi)充鹽溶液可以導(dǎo)電，尖端經(jīng)熱拋光后輕壓在細(xì)胞膜的表面。如果電極尖端的邊緣與肌膜封接良好，就能實(shí)現(xiàn)小片膜在電學(xué)上與周圍完全隔離的效果，如果封接不良，電極尖端邊緣與膜之間就會產(chǎn)生漏電流，使噪聲增大，從而淹沒很小的單通道電流（pA 級水平） 。 因此， 電極與膜的封接是膜片鉗技術(shù)成敗的一個(gè)關(guān)鍵因素。1976 年， Neher 和 Sakmann用這種方法完成了電阻為50MD的封接，并首次在細(xì)胞膜上記錄到單通道電流（圖1A）。但當(dāng)時(shí)實(shí)驗(yàn)記錄的背景噪聲仍然較大，電流的分析仍有一定困難。正當(dāng)人們用各種方法加以改進(jìn)未能奏效而幾乎放棄努力時(shí)

17、，Neher 于 1980 年在一次實(shí)驗(yàn)中偶然向吸管電極的尾端施加了一點(diǎn)負(fù)壓（2030cmH2O）,封接電阻驟然增大了兩個(gè)數(shù)量級，達(dá)到 10100G5在電學(xué)上將膜片與周圍近乎完全隔離開來。從而背景噪聲顯著減低，大大提高了單通道電流記錄的信噪比（圖1B）。后來將這種電阻大于1GQ （109Q）的封接稱為giga-seal。圖1單通道離子電流的記錄A .微電極置于細(xì)胞面表形成MIQ的封接，記錄電流噪聲較大；B.電極內(nèi)施加輕微負(fù)壓，封接電阻增加到高達(dá)10億歐姆10100GQ,背景噪聲顯著減低應(yīng)用膜片鉗記錄單通道離子電流的結(jié)果發(fā)現(xiàn)：化學(xué)和電壓門控通道的活動大體呈現(xiàn)關(guān)閉 和開放兩個(gè)狀態(tài)，狀態(tài)之間轉(zhuǎn)換的速

18、度非?？欤?lt;10科電流表現(xiàn)為方波；通道開放時(shí)具有恒定的電導(dǎo)，電流幅度在 pA （10-12安培）級（正態(tài)分布）；開放時(shí)間和關(guān)閉時(shí)間是隨機(jī)的， 可以是幾毫秒，幾十毫秒，甚至上百毫秒（指數(shù)分布）；特定的化學(xué)信號或特定的電位差可使相應(yīng)的配體或電壓門控通道開放概率增加；全細(xì)胞電流是每一瞬間同時(shí)出現(xiàn)的各通道的單通道電流疊加而成的。由于膜片鉗技術(shù)中微電極不需要直接刺入細(xì)胞內(nèi)，因此可廣泛用于各種細(xì)胞，特別是哺 乳類動物較小的神經(jīng)細(xì)胞，甚至可將微電極置于細(xì)胞突起的某一部分。1981年，Hamill等在實(shí)現(xiàn)giga-seal的基礎(chǔ)上建立了膜片鉗記錄的四種模式，即：細(xì)胞貼附（cell-attached）式、全細(xì)胞（whole-cell）式、內(nèi)面向外（inside-out）式和外面向外（outside-out）式等（圖 2）。 其中，細(xì)胞貼附式是在最接近生理狀態(tài)下記錄單通道活動的理想模式；全細(xì)胞記錄模式已將電極內(nèi)部和細(xì)胞內(nèi)部連通成一體，除