真菌的分離培養(yǎng)及形態(tài)觀察和無菌操作

1、真菌的分離培養(yǎng)及形態(tài)觀察、真菌的分離培養(yǎng)方法（）平板劃線分離法1取適合真菌的瓊脂培養(yǎng)基融化，冷至45，注入無菌平皿中，每皿1520ml，制成平板待用。2取要分離的材料（如田土、混雜的或污染的真菌培養(yǎng)物、真菌）少許，投入盛無菌水的試管內(nèi)，振搖，使分離菌懸浮于水中。3將接種環(huán)經(jīng)火焰滅菌并冷卻后，蘸取上述菌懸浮液，進行平板劃線(同細菌的劃線法。4劃線完畢，置溫箱中培養(yǎng)25d，待長出菌落后，釣取可疑單個菌落先作制片檢查，若只有一種所需要的真菌生長，即可進行釣菌純培養(yǎng)。如有雜菌可從單個菌落中釣少許菌制成懸液，再作劃線分離培養(yǎng)，有時需反復(fù)多次，才得純種。另外，也可在放大鏡的觀察下，用無菌鑷子夾取一段待分離

2、的真菌菌絲，直接放在平板上作分離培養(yǎng)，可獲得該種真菌的純培養(yǎng)。（二）稀釋分離法1取盛有無菌水的試管5支（每管9ml），分別標記1、2、3、4、5號。取樣品（如田土等）1g，投入1號管內(nèi)，振搖，使懸浮均勻。2用1ml滅菌吸管，按無菌操作法，從1號管中吸取1ml懸浮液注入2號管中，并搖勻；同樣由2號管取1ml至3號管，依此類推，直至5號管。注意每稀釋一管應(yīng)更換一支滅菌吸管。3用2支無菌吸管分別由4號、5號試管中各取1ml懸液，并分別注入2個滅菌培養(yǎng)皿中，再加入融化后冷至45的瓊脂培養(yǎng)基約15ml，輕輕在桌面上搖轉(zhuǎn)，靜置，使冷凝成平板。然后倒置溫箱中培養(yǎng)，25d后，從中挑選單個菌落，并移植于斜面上。

3、二真菌培養(yǎng)性狀觀察（一）真菌在固體培養(yǎng)基上的生長表現(xiàn)1 .酵母菌菌落：酵母菌在固體培養(yǎng)基上多呈油脂狀或蠟脂狀，表面光滑、濕潤、黏稠，有的表面呈粉粒狀、粗糙或皺褶。菌落邊緣有整齊、缺損或帶絲狀。菌落顏色有乳白色、黃色或紅色等。2. 霉菌菌落：將不同霉菌在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)25d，可見霉菌菌落呈絨毛狀、絮狀、蜘蛛網(wǎng)狀等。菌落大小依種而異，有的能擴展到整個固體培養(yǎng)基，有的有一定的局限性（直徑12mm或更?。?。很多霉菌的孢子能產(chǎn)生色素，致使菌落表面、背面甚至培養(yǎng)基呈現(xiàn)不同的顏色，如黃色、綠色、青色、黑色、橙色等。 （二）真菌在液體培養(yǎng)基中的生長表現(xiàn)1. 酵母菌 注意觀察其混濁度、沉淀物及表面生長性狀等。

4、2. 霉菌 霉菌在液體培養(yǎng)基中生長，一般都在表面形成菌層，且不同的霉菌有不同的形態(tài)和顏色。三 真菌的形態(tài)觀察（一）真菌水浸片的制備及觀察常用美蘭染色液制備真菌水浸片來觀察真菌的菌體形態(tài)，并且活細胞能還原美藍為無色，故可區(qū)別死細胞、活細胞。1. 酵母菌水浸片的制備將美蘭染色液一滴滴加在干凈的載玻片中央，如不染色則加蒸餾水一滴，用接觸環(huán)以無菌操作取培養(yǎng)48h左右的酵母菌體少許，在液滴中輕輕涂抹均勻（液體培養(yǎng)物可直接取一接種環(huán)培養(yǎng)液于玻片上）并加蓋干凈蓋玻片。為避免產(chǎn)生氣泡，應(yīng)先將其一邊接觸液滴，再慢慢放下蓋片。然后置于顯微鏡載物臺上進行觀察，注意酵母菌的形態(tài)、大小和芽體，同時可以根據(jù)是否染上顏色來

5、區(qū)別死、活細胞。2. 霉菌水浸片的制備在干凈載玻片上加蒸餾水或美蘭染色液一滴。取培養(yǎng)25d的根霉或毛霉、培養(yǎng)35d的曲霉、青霉或木霉、培養(yǎng)2d左右的白地霉同上法制片。霉菌要選擇有無性孢子的菌體，用解剖針挑取少量菌絲體放在載玻片的液滴中，將玻片置于解剖鏡下，細心地用解剖針將菌絲體分散成自然狀態(tài)，然后加蓋玻片，注意不要讓其產(chǎn)生氣泡，蓋后不再移動玻片，以免弄亂菌絲。制好片后，就可以在顯微鏡下觀察。觀察時注意它們的菌絲有無隔膜、孢子囊柄與分生孢子柄的形狀、分生孢子小梗的著生方式、孢子囊的形態(tài)、足細胞與假根的有無、孢子囊孢子和分生孢子的形狀和顏色、節(jié)孢子的形狀和特點等。并且要區(qū)別根霉與毛霉、青霉、曲霉、

6、木霉之間的異同點以及白地霉的特點。 （二）霉菌封閉標本的制備霉菌的封閉標本，常用乳酸石炭酸液封片，其中含有的甘油使標本不宜干燥，而石炭酸又有防腐作用。在封片液中，還可加入棉藍或其它酸性染料，以便于觀察菌體。在潔凈載玻片上滴一滴乳酸石炭酸棉藍染色液，用解剖針從霉菌菌落的邊緣處取少許帶有孢子的菌絲于染液中，再細心地把菌絲挑成自然狀態(tài)，然后用蓋玻片蓋上，注意不要產(chǎn)生氣泡。在溫暖干燥室內(nèi)放數(shù)日，讓水分蒸發(fā)一部分，使蓋玻片與載玻片緊貼，即可封片。封片時，先用清潔的紗布或脫脂棉將蓋玻片四周擦凈，并在蓋玻片周圍涂一圈加拿大樹膠或合成樹膠，風(fēng)干后即成封閉標本。（三）真菌的載片培養(yǎng)真菌的載片培養(yǎng)法不僅可克服水浸

7、片制片的困難，還可使對菌絲分枝和孢子著生狀態(tài)的觀察獲得更滿意的效果。取直徑7cm左右圓形濾紙一張，鋪放于一個直徑9cm的平皿底部（圖5-1），上放一U形玻棒，其上再平放一張干凈的載玻片與一張蓋玻片，蓋好平皿蓋進行滅菌。挑取真菌孢子接入盛有滅菌水的試管中，搖振試管制成孢子懸液備用。用滅菌滴管吸取滅菌后融化的真菌固體培養(yǎng)基少許，滴于上述滅菌平皿內(nèi)的載玻片中央，并以接種環(huán)將孢子懸液接種在培養(yǎng)基四周，加上蓋玻片，并輕輕壓貼一下。為防止培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基干燥，可在濾紙上滴加滅菌20甘油液34ml，然后蓋上平皿蓋，即成所謂濕室載片培養(yǎng)。放在適宜溫度（多數(shù)真菌為2030）的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，定期取出在低倍鏡下觀察

8、，可以看到孢子萌發(fā)、發(fā)芽管的長出、菌絲的生長、無隔菌絲中孢子囊柄與孢子囊孢子形成的過程、有隔菌絲上足細胞生長、鎖狀聯(lián)合的發(fā)生、孢子著生狀態(tài)等。無菌操作原則：一、在執(zhí)行無菌操作時，必須明確物品的無菌區(qū)和非無菌區(qū)。 二、執(zhí)行無菌操作前，先戴帽子、口罩、洗手，并將手擦干，注意空氣和環(huán)境清潔。 三、夾取無菌物品，必須使用無菌持物鉗。 四、進行無菌操作時，凡未經(jīng)消毒的手、臂、均不可直接接觸無菌物品或超過無菌區(qū)取物。 五、無菌物品必須保存在無菌包或滅菌容器內(nèi)，不可暴露在空氣中過久。無菌物與非無菌物應(yīng)分別放置。無菌包一經(jīng)打開即不能視為絕對無菌，應(yīng)盡早使用。凡已取出的無菌物品雖未使用也不可再放回?zé)o菌容器內(nèi)。

9、六、無菌包應(yīng)按消毒日期順序放置在固定的柜櫥內(nèi)，并保持清潔干燥，與非滅菌包分開放置，并經(jīng)常檢查無菌包或容器是否過期，其中用物是否適量。 七、無菌鹽水及酒精、新潔爾滅棉球罐每周消毒一次，容器內(nèi)敷料如干棉球、紗布塊等，不可裝得過滿，以免取用時碰在容器外面被污染。 無菌操作技術(shù)及注意事項1、玻璃器皿的消毒和清潔 新購玻璃器皿的處理新購玻璃器皿應(yīng)用熱肥皂水洗刷，流水沖洗，再用12%鹽酸溶液浸泡，以除去游離堿，再用水沖洗。對容量較大的器皿如試劑瓶、燒瓶或量具等，經(jīng)清水洗凈后應(yīng)注入濃鹽酸少許，慢慢轉(zhuǎn)動，使鹽酸布滿容器內(nèi)壁數(shù)分鐘后傾出鹽酸，再用水沖洗。 污染玻璃器皿的處理 一般試管或容器可用3煤酚皂溶液或5石

10、炭酸浸泡，再煮沸30分鐘，或在35漂白粉澄清液內(nèi)4小時，有的亦可用肥皂或合成洗滌劑洗刷使盡量產(chǎn)生泡沫，然后用清水沖洗至無肥皂為止。最后用少量蒸餾水沖洗。 細菌培養(yǎng)用的試管和培養(yǎng)皿可先行集中，用1kg/cm2高壓滅菌1530分鐘，再用熱水洗滌后，用肥皂洗刷，流水沖洗。 吸管使用后應(yīng)集中于3%煤酚皂溶液中浸泡24小時，逐支用流水反復(fù)沖洗，再用蒸餾水沖洗。 油蠟沾污的器皿，應(yīng)單獨滅菌洗滌，先將沾有油污的物質(zhì)棄去，倒置于吸水紙上，100烘干半小時，再用堿水煮沸，肥皂洗滌，流水沖洗。必要時可用二甲苯或汽油去油污。 染料沾污的器皿，可先用水沖洗，后用清潔或稀鹽酸洗脫染料，再用清水沖洗。一般染色劑呈堿性，所

11、以不宜用肥皂的堿水洗滌。 玻片可置于3煤酚皂溶液中浸泡，取出后流水沖洗，再用肥皂或弱堿性煮沸，自然冷卻后，流水沖洗。被結(jié)核桿菌污染或不易洗凈的玻片，可置于清潔液內(nèi)浸泡后再沖洗。 2、無菌器材和液體的準備將玻璃器具中的培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶、試管、吸管等按上述方法洗凈烘干后，用一潔凈紙包好瓶口并把吸管尾端塞上棉花，裝入干凈的鋁盒或鐵盒中，于120的干燥箱中干燥滅菌小時，取出備用。對于手術(shù)器械、瓶塞、工作服以及新配制的PBS洗液，則采用高壓蒸氣滅菌法，即在15磅的條件下，加熱20分鐘。而對于MEM培養(yǎng)液、小牛血清和消化液等需用G5或G6濾器負壓抽濾后使用。 3、無菌操作過程在無菌操作過程中，最重要的是要保

12、持工作區(qū)的無菌、清潔。因此，在操作前2030分鐘要先啟動超凈臺和紫外燈，并認真洗手和消毒。在操作時，嚴禁喧嘩，嚴禁用手直接拿無菌物品，如瓶塞等，而必須用消毒的止血鉗、鑷子等。培養(yǎng)瓶應(yīng)在超凈臺內(nèi)操作，并且在開啟和加蓋瓶塞時需反復(fù)用酒精燈燒。對于吸管應(yīng)先用手拿后1/3處，戴上膠皮乳頭，并用酒精燈燒烤之后再吸液體。 4、常用清潔液的配制法重鉻酸鉀清潔液：可根據(jù)不同需要，選用下列的任何一種濃度。先將重鉻酸鉀溶于水中，再慢慢加入濃硫酸。注意，此時可產(chǎn)生高熱，應(yīng)防止容器破裂。重鉻酸鉀清潔液除污力強，腐蝕性大，應(yīng)避免接觸皮膚和衣服。為防止吸收空氣的水分而變質(zhì)，此液應(yīng)貯存于帶蓋的容器中。如清潔效力較差，可再加入少量重鉻酸鉀及濃硫酸，還可繼續(xù)使用。直到液體變藍綠色，即不能再用。配制重鉻酸鉀清潔液時，宜用耐高溫的陶瓷缸或耐酸搪瓷或塑料容器。使用玻璃器皿