SOP高效液相色譜儀操作標(biāo)準(zhǔn)

1、 高效液相色譜儀標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程一、目 的：制定高效液相色譜儀標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，以規(guī)范其操作。二、范 圍：中心化驗室使用的高效液相色譜儀。三、責(zé)任人：QC主管、QC人員對實施本SOP負(fù)責(zé)。四、內(nèi) 容1. 定義1.1高效液相色譜法是將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑，緩沖液為流動相，用高壓泵將流動相壓入裝有填充劑的色譜柱，注入供試品，經(jīng)流動相帶入柱內(nèi)，在填充劑上分離后，各組份先后進(jìn)入檢測器，進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，得到測定結(jié)果。1.2除另有規(guī)定外，都應(yīng)按現(xiàn)行版中國藥典附錄“高效液相色譜”的要求測定。2.組成 ：HP1200高效液相色譜儀主要由四元泵、標(biāo)準(zhǔn)型自動進(jìn)樣器、柱溫箱、 VWD檢測器等組成。（詳見

2、圖一） 詳見圖一1 流動相A B C D 2 真空脫氣裝置 3、6、9、11 電纜4 輸液泵 5 自動進(jìn)樣器（無） 7 柱溫箱 8 檢測器（DAD） 10 數(shù)據(jù)接收處理控制系統(tǒng)（計算機(jī)） 12 打印機(jī)3. 操作步驟3.1準(zhǔn)備工作：將配制好的對照品溶液、樣品溶液放入進(jìn)樣器中；將流動相試劑放置在真空脫氣裝置。3.2開機(jī)打開計算機(jī)，進(jìn)入WindowsXP畫面。打開各部分電源，脫氣裝置、輸液泵、柱溫控制、檢測器的指示燈變黃。3.3工作站操作打開工作站：在電腦桌面上，雙擊“儀器1聯(lián)機(jī)”圖標(biāo)，或點擊屏幕左下角的“開始”，選擇“程序”，選擇“Agilent Chemstation”,選擇“儀器1聯(lián)機(jī)”，化學(xué)

3、工作站自動與LC通訊，進(jìn)入的工作站畫面。此時，各單元指示燈變綠，在工具條的View中選擇界面為Runcontrol。調(diào)用方法：在第一個小窗口中利用下拉菜單，選擇顯示界面為Method and Run Control（方法和運(yùn)行控制）；在第二個小窗口中選擇已設(shè)定的使用方法（若是舊用戶則有記錄），新用戶先編輯實驗方法，然后選工具欄中MethodSave Method As。溶劑的設(shè)置：在輸液泵圖標(biāo)上按鼠標(biāo)左鍵，在出現(xiàn)的小菜單中選Setup Pump，在Solvents欄中輸入A、B、C、D溶劑名稱；點溶劑瓶圖標(biāo)，在Solvent Bottles Filling中輸入A、B、C、D各溶劑的實際體積數(shù)

4、。點OK確定并退出。設(shè)置泵的參數(shù)：點輸液泵圖標(biāo)，選Setup Pump，出現(xiàn)流速控制界面。設(shè)定流速flow rate（一般ODS柱為1ml/min）；設(shè)定A、B、C、D各溶劑比例，其中B、C、D可設(shè)置。OK。點輸液泵圖標(biāo)，選pump control，點ON打開泵，OK，泵即開始工作，圖標(biāo)亦變?yōu)榫G色。泵壓一般不要超過150bar。若要設(shè)置各種淋洗變換程序如梯度洗脫，點輸液泵圖標(biāo)，在此界面下面的空欄中，用Append添加一欄，依次輸入時間、濃度、流速?？捎肅ut刪去某一行或多行。設(shè)定好后，點OK退出本界面。其壓力及時間程序過程在圖標(biāo)上的指示框里顯示。設(shè)定柱溫：在柱子圖標(biāo)上按鼠標(biāo)左鍵，選Setup

5、Column Thermostat設(shè)置柱溫，可在室溫以下10度至80度穩(wěn)定控制，精度達(dá)到0.1度。設(shè)定后點OK退出，再點此圖標(biāo)，選Control打開恒溫器。但若設(shè)定溫度后直接點OK，則出現(xiàn)一英文對話框，詢問是否打開溫控，按yes鈕即可。一般溫度設(shè)置在3050度之間。若不需控溫，則在Setup Column Thermostat窗口中選not control。檢測器參數(shù)設(shè)定注意：為了延長氘燈和鎢燈的使用壽命，在開始分析前進(jìn)行預(yù)平衡時（每次分析前最好用待用流動相平衡20個柱體積以上）或所有分析完成后淋洗色譜柱時，不需打開檢測器，僅在分析樣品前10分鐘左右打開即可。因此，在檢測器的control窗口

6、中，一定不要選At power on ,turnUV/VIS tamp on。在檢測器圖標(biāo)中按鼠標(biāo)左鍵，選Setup DAD Signals，出現(xiàn)檢測器參數(shù)設(shè)定窗口，在此設(shè)定存儲及檢測信號：每一譜圖可選5個通道（A、B、C、D、E）檢測。若需某個波長的信號，則在任一通道的小方框中打上X，然后設(shè)定檢測波長及參比波長。其它參數(shù)如波長范圍、時間、燈開關(guān)等，基本都不用變化，若需變化請與工作人員聯(lián)系。完成后點OK退出。積分儀的設(shè)定：在此項中可以設(shè)定各積分參數(shù)，選擇積分開始及關(guān)閉的時間，峰寬（peak width），最小面積（area reject），最小高度（height reject）等，可以象在wo

7、rd的表格里一樣，插入、刪除一行，選擇不同時間開始不同值等，完成后按Out圖標(biāo)并選擇存盤。進(jìn)行定量分析時，選Calibration項設(shè)置.報告格式窗口（Specify report）：定義計算的參數(shù)顯示方式（默認(rèn)為Screen），其中信號設(shè)置（signal set up）部分要檢查修改，一般在range中選autoscale，但多個樣品要互相比較時，建議第二個樣品時改為use range（這些處理可在Data Analysis中進(jìn)行，即在完成分析后處理數(shù)據(jù)時進(jìn)行）。完成后OK退出。 全部設(shè)定完成后，在工具欄下Method/Save Method AS，將本方法存入指定位置，其中路徑選擇方法：C

8、：HPCHEMHP1METHODS專業(yè)名（Analytical、Inorganic、Organic、Physical、Polymer）文件名.序號。文件名為操作者姓名縮寫（不要超過八個字符）。至此完成方法編輯。輸入樣品信息：在工具條上選RunControlSample info，輸入操作者姓名及樣品的有關(guān)信息。其中：Data file一欄為數(shù)據(jù)文件的保存路徑和文件名，要求在Subdirectory中輸入自己的專業(yè)（統(tǒng)一為Analytical、Inorganic、Organic、Physical、Polymer）；文件名輸入方式選Prefix/Counter，在Prefix中輸入操作人姓名縮寫，

9、在Counter中輸入自己文件的順序號。順序號會自動累加，連續(xù)測樣時，只要輸入第一個樣品的順序號即可。注意Path：C：HPCHEM1DATA不須更改。在Sample Parameters一欄中只要輸入Sample Name，其它不要改。在Comment中輸入流動相組分、比例等信息。輸入完畢后，點OK退出。進(jìn)樣：選擇合適的進(jìn)樣方式，設(shè)置進(jìn)樣體積與洗瓶位置?！皹?biāo)準(zhǔn)進(jìn)樣”只能輸入進(jìn)樣體積，此方式無洗針功能?！跋瘁樳M(jìn)樣”可以輸入進(jìn)樣體積和洗瓶位置，此方式從樣品瓶抽完樣品后，會在洗瓶中洗針?！笆褂眠M(jìn)樣器程序”可以點擊“編輯”按鈕進(jìn)行進(jìn)樣程序編輯。以上設(shè)置完畢后，點擊“確定”，進(jìn)入下一畫面。3.3.11

10、數(shù)據(jù)處理在第一個下拉菜單窗口，選擇Data Analysis，點Load Signal圖標(biāo)，選擇并打開文件。Graphics Signal Options，可以根據(jù)需要選擇作圖選項；IntegrationIntegration Events，可以設(shè)定積分條件，點保存圖標(biāo)后，儀器將自動根據(jù)積分條件顯示出最新積分結(jié)果；SpectraSelect Peak Apex Spectra，然后用光標(biāo)點一下色譜圖上某個峰，即顯示該峰光譜圖。SpectraSelect Spectrum，顯示任一點處的光譜圖ReportPrint Report，在屏幕上顯示報告預(yù)覽，若合適，點Print即打印。在不開儀器主機(jī)情

11、況下，可進(jìn)入Start/Program/HP Chemstation/Instrument 1 Offline進(jìn)行數(shù)據(jù)的處理，其窗口與圖標(biāo)，非常形象，可根據(jù)需要選擇進(jìn)行分析后打印。五關(guān)機(jī)分析測試完成后，對于ODS柱，應(yīng)用100%色譜純甲醇清洗柱子20分鐘（1mL/min）；將進(jìn)樣注射器洗凈并放好。將顯示屏上各色譜單元的圖標(biāo)（泵、柱溫箱、檢測器等）關(guān)閉，關(guān)閉各程序窗口后關(guān)閉計算機(jī)，然后再關(guān)閉儀器各色譜單元的電源開關(guān)。通知實驗室人員檢查后，登記、交費(fèi)。廢液及溶劑瓶中剩余溶劑請自己帶走。保護(hù)環(huán)境，請勿亂倒廢液！第三個小窗口中顯示LC操作條件。3.3點擊“泵”圖標(biāo)，點擊“設(shè)置泵”選項，進(jìn)入泵編輯畫面。

12、3.8設(shè)流速：3-5ml/min，點擊“確定”。3.9點擊“泵”圖標(biāo)，點擊“控制”選項，選中“啟動”，點擊“確定”，則系統(tǒng)開始沖洗，直到管線內(nèi)（由溶劑瓶到泵入口）無氣泡為止，切換通道繼續(xù)沖洗，直到所有要用通道無氣泡為止（一般每個通道排氣泡5分鐘為宜）。3.10點擊“泵”圖標(biāo)，點擊“控制”選項，選中“關(guān)閉”，點擊“確定”，關(guān)泵，手動旋緊沖洗閥。3.11點擊“泵”圖標(biāo)，點擊“設(shè)置泵”選項，設(shè)流速：1.0ml/min。3.12點擊泵下面的瓶圖標(biāo)，選擇“溶劑瓶添沖量”圖標(biāo)，輸入溶劑的實際體積和瓶體積。也可輸入停泵的體積，點擊“確定”。4.數(shù)據(jù)采集方法編輯:4.1開始編輯完整方法：從“方法”菜單中選擇“

13、編輯完整方法”項，選中除“數(shù)據(jù)分析”外的三項，點擊“確定”，進(jìn)入下一個畫面。4.2方法信息：在“方法注釋”中加入方法的信息。點擊“確定”，進(jìn)入下一畫面。4.3泵參數(shù)設(shè)定：在“流速”處輸入流量，停止時間。在“溶劑B”處輸入溶劑百分比（A=100-B-C-D）,也可“插入”一行“時間表”，編輯梯度。在“壓力限”處輸入柱子的最大耐高壓，以保護(hù)柱子。以上設(shè)置完畢后，點擊“確定”，進(jìn)入下一畫面。4.4自動進(jìn)樣器參數(shù)設(shè)定：選擇合適的進(jìn)樣方式，設(shè)置進(jìn)樣體積與洗瓶位置?！皹?biāo)準(zhǔn)進(jìn)樣”只能輸入進(jìn)樣體積，此方式無洗針功能?！跋瘁樳M(jìn)樣”可以輸入進(jìn)樣體積和洗瓶位置，此方式從樣品瓶抽完樣品后，會在洗瓶中洗針?！笆褂眠M(jìn)樣器

14、程序”可以點擊“編輯”按鈕進(jìn)行進(jìn)樣程序編輯。以上設(shè)置完畢后，點擊“確定”，進(jìn)入下一畫面。4.5柱溫箱參數(shù)設(shè)定:在“溫度”下面的空白方框內(nèi)輸入所需溫度，并選中它，點擊“更多信息”鍵，選中“與左側(cè)相同”，使柱溫箱的溫度左右一致，以上設(shè)置完畢后，點擊“確定”，進(jìn)入下一畫面。4.6檢測器參數(shù)設(shè)定在“波長”下方的空白處輸入所需的檢測波長，在“峰寬（響應(yīng)時間）”下方點擊下拉式箭頭，選擇合適的響應(yīng)時間。在“時間表”中可以“插入”一行，輸入隨時間切換的波長，點擊“確定”，進(jìn)入下一個畫面。在“運(yùn)行時選項表”中，選中“數(shù)據(jù)采集”，點擊“確定”。從“方法”菜單，選中“方法另存為”，輸入一方法名，點擊“確定”。從菜單

15、“視圖”中選中“在線信號”，選中“信號窗口1”，然后點擊“改變”，將所要繪圖的信號移到右邊的框中，點擊“確定”。從“運(yùn)行控制”菜單中，選擇“樣品信息”選項，輸入相關(guān)信息，在“數(shù)據(jù)文件”中選擇“手動”或“前綴/計數(shù)器”，點擊“確定”。從“儀器”菜單選擇“啟動系統(tǒng)”。等儀器準(zhǔn)備號，基線平穩(wěn)，從“運(yùn)行控制”菜單中選擇“運(yùn)行方法”，進(jìn)樣。5.數(shù)據(jù)分析方法編輯5.1從“視圖”菜單中，點擊“數(shù)據(jù)分析”進(jìn)入數(shù)據(jù)分析畫面。5.2從“文件”菜單選擇“調(diào)用信號”，選中你的數(shù)據(jù)文件名，點擊“確定”，則數(shù)據(jù)被調(diào)出。5.3圖譜優(yōu)化:從“圖形”菜單中選擇“信號選項”，從“范圍”中選擇“滿量程”或“自動量程”及合適的時間范

16、圍或選擇“自定義量程”調(diào)整。反復(fù)進(jìn)行，直到圖的比例合適為止。點擊“確定”。5.4積分：從“積分”菜單中選擇“積分事件”選項，選擇合適的“斜率靈敏度”，“峰寬”，“最小峰面積”，“最小峰高”。從“積分”菜單中選擇“積分”選項，則數(shù)據(jù)被積分。如積分結(jié)果不理想，則修改相應(yīng)的積分參數(shù)，直到滿意為止。點擊左邊“”圖標(biāo)，將積分參數(shù)存入方法。5.5打印報告：從“報告”菜單中選擇“設(shè)定報告”選項，進(jìn)入下個畫面。點擊“定量結(jié)果”框中“計算”右側(cè)的黑三角，選中“面積百分比”，其他選項不變，點擊“確定”。從“報告”菜單中選擇“打印報告”，則報告結(jié)果將打印到屏幕上，如果想輸出到打印機(jī)上，則點擊“報告”底部的“打印”。6.關(guān)