PCR技術及習題

1、PCR技術及習題PCR（polymerase chain reaction）：聚合酶鏈式反應1、PCR原理：在解旋酶作用下，打開DNA雙鏈，每條DNA單鏈作為母鏈，以4中游離脫氧核苷酸為原料，合成子鏈，在引物作用下，DNA聚合酶從引物3'端開始延伸DNA鏈，即DNA的合成方向是從子鏈的5'端自3'端延伸的。實際上就是在體外模擬細胞內(nèi)DNA的復制過程。DNA的復制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能從3端延伸DNA鏈。2、PCR反應過程是：變性復性延伸類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性-退火（復性）-延伸三個基本反應步

2、驟構成：模板DNA的變性：當溫度上升到90以上時，雙鏈DNA解聚為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；模板DNA與引物的退火（復性）：溫度下降到50左右，兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結合；引物的延伸：72左右時，TaqDNA聚合酶有最大活性，可使DNA新鏈由5'端向3'端延伸。3、結果：上述三步反應完成后，一個DNA分子就變成了兩個DNA分子，隨著重復次數(shù)的增多，DNA分子就以2n的形式增加。PCR的反應過程都是在PCR擴增儀中完成的。4、細胞被DNA復制與PCR技術的比較：細胞內(nèi)DNA復制體外DNA擴增（PCR）不同點解旋在解旋酶作用下邊解旋邊復制80100

3、高溫解旋，雙鏈完全分開酶DNA解旋酶、DNA聚合酶TaqDNA聚合酶引物RNADNA、RNA溫度體內(nèi)溫和條件高溫相同點需提供DNA模板四種脫氧核苷酸為原料子鏈延伸的方向都是從5'端到3'端知識點撥：1、DNA分子復制的人工控制解開螺旋：在80100時，DNA雙螺旋打開，形成兩條DNA單鏈，稱為變性?；謴吐菪涸?060左右時，兩條DNA單鏈重新形成雙螺旋結構，稱為復性。復制條件：緩沖液，DNA模板、四種脫氧核苷酸、熱穩(wěn)定DNA聚合酶、兩種引物?？刂苾x器：PCR儀（溫度周期性自動調(diào)節(jié)儀）。2、PCR的含義是多聚酶鏈式反應。3、PCR技術反應的條件：穩(wěn)定的緩沖溶液環(huán)境（一般使用Tr

4、is-Cl緩沖液，標準的為10mmol/L,并將其調(diào)節(jié)到8.38.8之間）；DNA模板；合成引物（2個）；四種脫氧核甘酸；DNA聚合酶；溫控設備4、PCR技術最突出的優(yōu)點是快速、高效、靈活、易于操作。5、TaqDNA聚合酶的特點是：耐高溫。知識拓展：1、DNA聚合酶不能夠從頭合成DNA，只能從DNA的3'端開始延伸DNA鏈，因此DNA復制需要引物。2、引物: 引物是PCR特異性反應的關鍵，PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。3、PCR引物設計原則：（1

5、）PCR引物通常長15-25堿基，其中GC約占50%。（2）引物之間不能互配形成雙鏈結構，引物內(nèi)部也不能形成發(fā)夾結構。（3）引物的3末端必須與目的片段完全相配。（4）引物的5末端可以不與目的片段互補，可以包含內(nèi)切酶位點或啟動子序列，但在下一輪反應中，這些序列會被同樣合成習題訓練1聚合酶鏈式反應(PCR技術)是在實驗室中以少量樣品DNA制備大量DNA的生化技術，反應系統(tǒng)中包括微量樣品DNA、DNA聚合酶、引物、足量的4種脫氧核苷酸及ATP等。反應中新合成的DNA又可以作為下一輪反應的模板，故DNA數(shù)以指數(shù)方式擴增，其簡要過程如右圖所示。微量DNA樣品DNA互補鏈分離開為單鏈以單鏈為模板合成子代D

6、NA循環(huán)重復（1）某個DNA樣品有1000個脫氧核苷酸，已知它的一條單鏈上堿基A:G:T:C=1:2:3:4，則經(jīng)過PCR儀五次循環(huán)后，將產(chǎn)生 個DNA分子，其中需要提供胸腺嘧啶脫氧核苷酸的數(shù)量至少是 個。（2）分別以不同生物的DNA樣品為模板合成的各個新DNA之間存在差異，這些差異是 。（3）請指出PCR技術與轉(zhuǎn)錄過程的三個不同之處： 。 。 。2通過DNA重組技術使原有基因得以改造的動物稱為轉(zhuǎn)基因動物。運用這一技術使羊奶中含有人體蛋白質(zhì)，下圖表示了這一技術的基本過程，在該工程中所用的基因“剪刀”能識別的序列和切點是一GGATCC一，請回答：（1）從羊染色體中“剪下”羊蛋白質(zhì)基因的酶是 。人體蛋白質(zhì)基因“插入”后連接在羊體細胞染色體中時需要的酶是 。（2）請畫出質(zhì)粒被切割形成黏性末端的過程圖。（3）人體蛋白質(zhì)基因之所以能“插入”到羊的染色體內(nèi)，原因是 ，“插入”時常用的工具是 。3下面甲圖中DNA決定某一多肽鏈中的酪氨酸和丙氨酸過程示意圖，乙圖示樣品 DNA經(jīng)PCR技術(聚合酶鏈式反應)擴增，可以獲取大量DNA克隆分子。分析回答：（1）甲圖中含有 種核苷酸；丙氨酸的遺傳密碼子是 。該圖表示了DNA中遺傳信息的 過程。（2）有一種貧血癥是血紅蛋白分子的一條多肽鏈上，一個酪氨酸被一個苯丙氨酸所替代造成的。