p16ink4a基因的分子生物學(xué)研究進(jìn)展1

1、p16ink4a基因的分子生物學(xué)研究進(jìn)展張毅彬關(guān)鍵詞：p16ink4a基因；CDK4 / 6；細(xì)胞周期；腫瘤發(fā)生【摘要】 抑癌基因p16ink4a在特異地抑制 CDK4及CDK6在控制細(xì)胞生長(zhǎng)、抑制腫瘤發(fā)生、 促進(jìn)細(xì)胞衰老等方面發(fā)揮重要的生物學(xué)作用，該基因失活后導(dǎo)致了細(xì)胞周期的調(diào)控失常,使得細(xì)胞異常增殖,導(dǎo)致了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，本文就近幾年來(lái)有關(guān)它在染色體上的定位、結(jié)構(gòu)以及在細(xì)胞增殖、癌變過(guò)程中的研究進(jìn)展作一綜述。p16ink4a基因最早作為腫瘤抑制基因由美國(guó)冷泉實(shí)驗(yàn)室在1994年發(fā)現(xiàn)，屬于細(xì)胞周期依賴(lài)性激酶抑制基因INK4家族的一員1，在正常細(xì)胞中具有調(diào)控細(xì)胞周期的作用，負(fù)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖及分裂

2、，在人類(lèi)50%腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)有缺失、突變或者表觀遺傳上的沉默2。1p16ink4a基因的結(jié)構(gòu)和定位人類(lèi)p16ink4a基因位于第9號(hào)染色體斷臂的2區(qū)1帶，即9P21的CDKN2A位點(diǎn)，CDKN2A基因位點(diǎn)包含INK4A和ARF兩個(gè)重疊基因，因閱讀框不同分別編碼蛋白p16ink4a和p14ARF，p16ink4a基因全長(zhǎng)約8.5kb，由 3個(gè)外顯子exon1（126bp）,exon2(307bp),exon3(11bp)加上2個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成，其編碼的p16ink4a蛋白由148個(gè)氨基酸組成，定位于細(xì)胞核內(nèi)。2p16ink4a與細(xì)胞周期調(diào)控在正常增殖的組織細(xì)胞中，p16ink4a蛋白的表達(dá)處于一個(gè)較

3、低的水平，并通過(guò)p16ink4a-CDK4/6-Rb途徑調(diào)控細(xì)胞周期。Rb基因即成視網(wǎng)膜瘤基因，是一種重要的抗癌基因，細(xì)胞中的Rb基因在激活狀態(tài)下可編碼Rb蛋白，并通過(guò)Rb蛋白調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子E2F的活性，從而最終調(diào)節(jié)細(xì)胞周期。處于G0/G1期細(xì)胞中的Rb蛋白處于去磷酸化狀態(tài)，并與轉(zhuǎn)錄因子E2F組成復(fù)合體，從而阻斷E2F與順式作用元件的結(jié)合,進(jìn)而阻遏基因的表達(dá)。如Rb蛋白與E2F結(jié)合后,可阻斷編碼DNA聚合酶、胸苷激酶、二氫葉酸還原酶等的相關(guān)基因的表達(dá),使這些酶類(lèi)不能合成,DNA的生物合成亦受阻，因此抑制了細(xì)胞的生長(zhǎng)。當(dāng)在有絲分裂信號(hào)的激活作用下，G1期細(xì)胞中的CDK4/6與cyclin D組成復(fù)

4、合物，介導(dǎo)Rb蛋白磷酸化，磷酸化的Rb蛋白失去活性，釋放出轉(zhuǎn)錄因子E2F，轉(zhuǎn)錄因子E2F與DNA啟動(dòng)子近端元件結(jié)合后,促進(jìn)轉(zhuǎn)錄預(yù)始復(fù)合物(PIC)的組裝,使結(jié)構(gòu)基因穩(wěn)定表達(dá)，細(xì)胞通過(guò)G1/S期檢查點(diǎn)，從而促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)。p16ink4a的調(diào)控作用主要表現(xiàn)在p16ink4a蛋白直接與CDK4/6分子結(jié)合，從而競(jìng)爭(zhēng)性抑制CDK4/6與cyclin D的結(jié)合，保持Rb蛋白的去磷酸化狀態(tài)，進(jìn)而使細(xì)胞停滯于G0/G1期無(wú)法進(jìn)入S期啟動(dòng)染色體的復(fù)制以完成增殖活動(dòng)3, 4，除此之外，p16ink4a還能擾亂CDK4/6與其他CDKI的結(jié)合，導(dǎo)致這些非p16的CDKI的釋放，進(jìn)一步抑制細(xì)胞周期5。當(dāng)細(xì)胞出于一些

5、較明顯的異常狀態(tài)時(shí)，如DNA損傷、原癌基因過(guò)度表達(dá)及細(xì)胞生理性老化時(shí)，就能啟動(dòng)p16ink4a的表達(dá)6。3p16ink4a基因與腫瘤在人類(lèi)腫瘤中，在接近50%的腫瘤類(lèi)型中發(fā)現(xiàn)p16ink4a基因有不同程度的失活7，p16在不同腫瘤中失活的評(píng)估幾率如下：乳腺癌：20%；非小細(xì)胞肺癌：65%；結(jié)直腸癌：30%；膀胱癌：60%；頭頸部鱗狀細(xì)胞癌：50-70%；黑色素瘤：60%；白血?。?0%；食道癌：70%；多發(fā)性骨髓瘤：60%；胰腺癌：85%8。在這些腫瘤中，許多p16失活的機(jī)制已經(jīng)被闡明，包括基因純合性缺失、雜合性缺失、點(diǎn)突變以及表觀遺傳上的啟動(dòng)子甲基化9, 10，p16的失活導(dǎo)致細(xì)胞過(guò)度增殖，

6、并可使G1期未充分發(fā)育的細(xì)胞提前進(jìn)入S期，引起增殖性疾病的發(fā)生，并且每一種腫瘤具有自己特有的失活類(lèi)型，比如48%的胰腺癌樣本中發(fā)現(xiàn)p16純合性缺失，而在胃癌中，p16啟動(dòng)子甲基化是主要原因，比例高達(dá)34%，p16基因缺失和突變只占2%11，Chang等人發(fā)現(xiàn)膀胱癌中60%的p16基因啟動(dòng)子存在高度甲基化現(xiàn)象12，Hernandez等分析了4 2例慢性粒細(xì)胞白血病(CML)病人p16ink4a 基因外顯子2的缺失和啟動(dòng)子甲基化情況，發(fā)現(xiàn)29%的淋巴細(xì)胞白血病急性變中存在p16ink4a基因的純合性缺失，而慢性期和髓樣細(xì)胞白血病中均未發(fā)現(xiàn)缺失，也未發(fā)現(xiàn)p16ink4a基因啟動(dòng)子的異常高甲基化，p1

7、6ink4a基因的缺失與臨床特征無(wú)明顯相關(guān)，提示p16ink4a基因的缺失與否并不能影響病人的預(yù)后13。Kwong等人分析了亞洲人種喉鱗狀上皮細(xì)胞癌細(xì)胞系的p16ink4a的失活機(jī)制和功能，發(fā)現(xiàn)了啟動(dòng)子甲基化、外顯子2和3的純合性缺失、外顯子1的框移突變導(dǎo)致了其轉(zhuǎn)錄失活和蛋白突變體的產(chǎn)生14。Grafstrom等運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR方法研究了86個(gè)病人p16ink4a基因的缺失情況及其與預(yù)后的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)純合性缺失是皮膚惡性黑色素瘤最重要的遺傳學(xué)改變，且與不良預(yù)后密切相關(guān)15。另外，在小鼠腫瘤模型中, p16ink4a和 p14ARF 協(xié)同作用的缺失已經(jīng)在一些腫瘤發(fā)生模型,包括在對(duì)特定致癌物質(zhì)、黑

8、素瘤、惡性膠質(zhì)瘤和胰腺癌的反應(yīng)中確立。此外，盡管大量的研究表明p16ink4a作為一個(gè)腫瘤抑制基因在腫瘤中的表達(dá)是下調(diào)的，但是也有部分報(bào)道認(rèn)為p16ink4a在腫瘤中有過(guò)表達(dá)的情況，例如在子宮頸鱗癌和結(jié)腸癌的研究中，有報(bào)道p16ink4a在腫瘤細(xì)胞中過(guò)表達(dá)的現(xiàn)象發(fā)生16，并且p16ink4a高表達(dá)與病毒感染有關(guān)，如在人類(lèi)乳頭瘤病毒HPV相關(guān)口腔鱗狀細(xì)胞癌中，高風(fēng)險(xiǎn)類(lèi)型的HPV感染口腔細(xì)胞后，HPV所表達(dá)的E7蛋白能與細(xì)胞中Rb蛋白結(jié)合，阻止Rb與轉(zhuǎn)錄因子E2F結(jié)合，因此E2F具有活性，引起細(xì)胞分裂，又因?yàn)镽b-E2F復(fù)合物能負(fù)反饋抑制p16的表達(dá)，而E7蛋白與Rb蛋白結(jié)合后，Rb-E2F復(fù)合物

9、不足，所以導(dǎo)致了p16ink4a高表達(dá)17, 18。而在非HPV感染的頭頸部鱗癌中，p16ink4a低表達(dá)，癌細(xì)胞分裂活躍，而HPV感染的頭頸部鱗癌中, p16ink4a因E7蛋白的緣故而高表達(dá)19，但即使p16ink4a在癌細(xì)胞中高表達(dá)，仍無(wú)法對(duì)抗癌細(xì)胞的異常增殖20。不過(guò)，這種p16ink4a高表達(dá)的口腔腫瘤對(duì)放射療法的敏感性更高，并且p16ink4a可作為口腔癌臨床預(yù)后的標(biāo)志物，p16ink4a高表達(dá)陽(yáng)性類(lèi)型的預(yù)后較p16ink4a高表達(dá)陰性的更好21。另外，在腫瘤癌前病變組織中也可以監(jiān)測(cè)到p16ink4a的高表達(dá)，可以認(rèn)為這種變化是為了抑制病變的繼續(xù)發(fā)展22。4p16ink4a與細(xì)胞衰

10、老 細(xì)胞衰老也稱(chēng)細(xì)胞老化,一般是指細(xì)胞在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用下不可逆地脫離細(xì)胞周期并喪失增生能力后進(jìn)入的一種相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)。細(xì)胞衰老是生物體中普遍存在的一種不可逆的生長(zhǎng)停滯現(xiàn)象,是器官衰老的基礎(chǔ),存在于任何生命的任何時(shí)期,在不同情況下其速率與程度有所差別。己有研究證明基因是細(xì)胞衰老的關(guān)鍵效應(yīng)物，是遺傳控制程序中的主要環(huán)節(jié)，它通過(guò)定途徑調(diào)控細(xì)胞周期，影響細(xì)胞的生物鐘細(xì)胞壽命和端粒長(zhǎng)度，而非激活端粒酶起作用，細(xì)胞衰老的遺傳原因有很多種,其中有一個(gè)原因是突變的癌基因所產(chǎn)生的信號(hào)導(dǎo)致細(xì)胞衰老。目前發(fā)現(xiàn)這種現(xiàn)象與p16ink4a- Rb和p14ARF-p53這2條途徑有關(guān), Rb和p53是衰老信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)中的 2

11、個(gè)重要的控制點(diǎn)23。在人類(lèi)腎臟組織細(xì)胞和皮膚細(xì)胞的衰老過(guò)程中都顯示出p16ink4a的表達(dá)上升24，提示這個(gè)腫瘤抑制基因在細(xì)胞衰老中的重要作用。除此之外，有報(bào)道發(fā)現(xiàn)p16ink4a在衰老的成纖維細(xì)胞中過(guò)度表達(dá)25，在氧化應(yīng)激和DNA損傷中也有被報(bào)道有過(guò)表達(dá)現(xiàn)象的發(fā)生26, 27。Janzen等發(fā)現(xiàn)p16ink4a的表達(dá)在HSCs 、NSCs和胰腺干細(xì)胞中都顯示了其促進(jìn)衰老和抗增生能力,這表明在這些干細(xì)胞中p16ink4a的表達(dá)能夠通過(guò)抑制增生和自我更新而促進(jìn)衰老,是引起衰老的原因之一28, 29。Han 等研究發(fā)現(xiàn)p16ink4a蛋白能增加p21蛋白的穩(wěn)定性，p21蛋白則通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子SP1 激

12、活p16ink4a基因的表達(dá)，二者協(xié)同抑制細(xì)胞周期，細(xì)胞周期的停滯則是細(xì)胞衰老的前提，說(shuō)明p16ink4a基因可能通過(guò)促進(jìn)p21基因的表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞衰老30. 盡管諸多的報(bào)告顯示p16ink4a與細(xì)胞衰老有千絲萬(wàn)縷的聯(lián)系，但目前p16ink4a在細(xì)胞衰老過(guò)程中的完整的具體機(jī)制尚未明了31。5p16ink4a基因表達(dá)的調(diào)控作為調(diào)控因子，已知有一些腫瘤相關(guān)因子或分子信號(hào)通路影響p16ink4a的表達(dá)。其中最好的研究就是通過(guò)激活 Ras 及其下游效應(yīng)器B-Raf的突變來(lái)誘導(dǎo) ERK/MAPK通路。已有研究證明RAS活化可能導(dǎo)致p16ink4a表達(dá),包括ERK介導(dǎo)的 Ets1/2活化誘導(dǎo)p16ink4a

13、的表達(dá)和Jun介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子DMP 1活化誘導(dǎo)p14ARF的表達(dá)，另外polycomb 家族 ( PcG) 基因 ( BMI - 1、Cbx 7、Mel 18) 等也抑制p16ink4a的表達(dá)。在成纖維細(xì)胞中,Ets1、Ets2轉(zhuǎn)錄因子可通過(guò)與p16ink4a啟動(dòng)子中的Ets結(jié)合位點(diǎn)(GGCC)結(jié)合而使其激活,促進(jìn)p16ink4a轉(zhuǎn)錄。在低代齡(30代)成纖維細(xì)胞中大量存在的Ets2對(duì)p16ink4a的誘導(dǎo),可被Ras-Raf-MAPK激酶信號(hào)所加強(qiáng),同時(shí)可被Id1的直接作用所抑制32。E蛋白是一類(lèi)含有bHLH結(jié)構(gòu)域并通過(guò)與E-box結(jié)合來(lái)激活轉(zhuǎn)錄的蛋白家族,它包括E12、E47、E2-2、H

14、EB4個(gè)成員。p16ink4a啟動(dòng)子內(nèi)含有2個(gè)E-box結(jié)構(gòu)，E蛋白以其bHLH結(jié)構(gòu)域結(jié)合這兩個(gè)E-box,上調(diào)p16ink4a的轉(zhuǎn)錄水平,誘導(dǎo)衰老表型出現(xiàn)。Id1也是E-box結(jié)合蛋白序列特異性轉(zhuǎn)錄抑制因子33。在細(xì)胞中, 具有鋅指結(jié)構(gòu)的Sp(specificityprotein)家族轉(zhuǎn)錄因子與GC盒相互作用，目前已知有Sp1Sp88種蛋白質(zhì)。p16ink4a啟動(dòng)子無(wú)TATA盒,其啟動(dòng)子上GC含量豐富,且含有5個(gè)Sp家族轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn),Sp家族中轉(zhuǎn)錄因子Sp1通過(guò)與這些GC盒結(jié)合來(lái)促進(jìn)p16ink4a的轉(zhuǎn)錄24。LI等認(rèn)為p16ink4a啟動(dòng)子-426到-433區(qū)域含有一個(gè)HMG盒包含蛋白

15、1（HBP1），其與p16ink4a啟動(dòng)子的結(jié)合能上調(diào)p16ink4a的表達(dá)34。哺乳動(dòng)物的AP1蛋白能以同源二聚體或異源二聚體的形式組成bZIP蛋白，包括C-JUN、junB等等，在小鼠p16ink4a啟動(dòng)子區(qū)域中發(fā)現(xiàn)3個(gè)AP1樣結(jié)合位點(diǎn)，bZIP蛋白與AP1樣位點(diǎn)結(jié)合后能促進(jìn)p16ink4a的表達(dá)35。Id家族可抑制Ets蛋白對(duì)p16ink4a的轉(zhuǎn)錄激活作用。在成纖維細(xì)胞中,Ets1和Ets2可通過(guò)與p16ink4a啟動(dòng)子中的Ets結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合,促進(jìn)p16ink4a轉(zhuǎn)錄,但同時(shí)可被Id1的直接作用所抑制。因此,在該細(xì)胞中雖然大量表達(dá)Ets2,但可能由于Id1抵消了Ets2對(duì)p16ink4a

16、的促進(jìn)作用,使p16ink4a在年輕細(xì)胞中只有低水平表達(dá);而在衰老細(xì)胞中,Ets2和Id1水平下降,Ets1水平上升,這樣仍可使p16ink4a的表達(dá)顯著增加32。甲基化對(duì)p16ink4a的轉(zhuǎn)錄有負(fù)調(diào)控作用，其中p16ink4a基因5端啟動(dòng)子區(qū)及第一、二外顯子的CpG島甲基化使其不能完成轉(zhuǎn)錄是導(dǎo)致抑癌基因失活的重要原因, 如腦部腫瘤、乳腺癌、結(jié)腸癌、頭頸部腫瘤、肺小細(xì)胞肺癌和非霍奇金病等疾病中都有相關(guān)報(bào)道36。polycomb 家族 ( PcG) 基因通過(guò)染色質(zhì)修飾調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄抑制子，與細(xì)胞的增殖、分化和腫瘤發(fā)生有密切關(guān)系，從生化和功能上它可以分成兩個(gè)主要的核心蛋白復(fù)合體PRC1(Poly

17、comb repressive complex 1)和PRC2(Polycomb repressive complex 2)，BMi1、Cbx7、Ring1b以及Phc2都屬于PcG基因，如BMi1基因的靶基因就是CDKN2A位點(diǎn)，在小鼠模型和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，都確認(rèn)了BMi1能下調(diào)p16ink4a及p14ARF的表達(dá)37。6其他 在細(xì)胞的其他一些活動(dòng)過(guò)程中，p16ink4a也扮有相關(guān)作用，例如細(xì)胞凋亡、細(xì)胞侵襲、血管生成等等，并且這些活動(dòng)與它在腫瘤中的過(guò)表達(dá)有一定聯(lián)系。另外在紅細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中，p16通過(guò)調(diào)節(jié)bcl-X與NF-KB通路來(lái)促進(jìn)紅細(xì)胞分化和凋亡38。Harada發(fā)現(xiàn)在惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤中，p

18、16ink4a能下調(diào)VEGF的表達(dá)，從而抑制腫瘤的血管生成過(guò)程39。7展望 在這篇綜述中，我們簡(jiǎn)單地闡述了p16ink4a基因的結(jié)構(gòu)、功能、相關(guān)疾病的關(guān)系以及眾多轉(zhuǎn)錄因子對(duì)其復(fù)雜的正、負(fù)調(diào)控，盡管在探索P16分子在細(xì)胞中的相關(guān)作用及表達(dá)產(chǎn)物的功能研究上已經(jīng)取得一定的成果，但我們?nèi)晕慈媪私馇宄?，尤其是p16ink4a與細(xì)胞衰老發(fā)生的機(jī)制方面還需要更多的探索與研究，拓展其在細(xì)胞和機(jī)體中以及在更多不同疾病中相關(guān)功能的認(rèn)識(shí)，無(wú)疑將有助于人們更好的掌握細(xì)胞生長(zhǎng)規(guī)律，這樣才能為新的治療方法和策略指明方向。參考文獻(xiàn)：1.Kamb, A., et al., A cell cycle regulator po

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