實(shí)驗(yàn)六動(dòng)物染色體標(biāo)本的制備與觀察

1、安徽大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)精品課程實(shí)驗(yàn)六 動(dòng)物染色體標(biāo)本的制備與觀察實(shí)驗(yàn)簡介：染色體是細(xì)胞內(nèi)遺傳物質(zhì)的載體。骨髓細(xì)胞具有豐富的細(xì)胞質(zhì)和高度的分裂能力，可直接觀察到細(xì)胞周期中的各個(gè)時(shí)相。但通常情況下， 中期染色體在鏡下的數(shù)量較少，如經(jīng)秋水仙素處理后，分裂的骨髓細(xì)胞大多被阻斷在有絲分裂中期，再經(jīng)離心、低滲、固定、滴片等步驟，便可得到理想的染色體標(biāo)本, 用以觀察中期染色體形態(tài)和染色體組型分析等實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)學(xué)時(shí)3個(gè)。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 初步掌握動(dòng)物骨髓染色體標(biāo)本制備基本過程，了解操作步驟的原理。2. 了解常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物染色體的數(shù)目及特點(diǎn)。二、實(shí)驗(yàn)原理染色體的分析往往是選擇細(xì)胞處于活躍增殖狀態(tài)，或者經(jīng)過各種處理后細(xì)胞

2、進(jìn)入分裂的動(dòng)物組織。在正常動(dòng)物體內(nèi)，骨髓是處于不斷分裂的組織之一。給動(dòng)物注射一定劑量的秋水仙堿即可使許多處于分裂的細(xì)胞停滯于中期，然后采用常規(guī)空氣干燥法制備染色體，即可得到大量可分析的染色體標(biāo)本。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)時(shí)，可在取材前經(jīng)腹腔注射有絲分裂抑制劑，一般常用秋水仙素，這此方法對于動(dòng)物的核型分析是非常有用的。本方法簡便、可靠，不需要經(jīng)體外培養(yǎng)和無菌操作，易于推廣。因此骨髓細(xì)胞是用于動(dòng)物細(xì)胞遺傳學(xué)研究很好的材料。三、實(shí)驗(yàn)材料（一）材料 昆明種小白鼠若干只。（二）器材 水平離心機(jī)、顯微鏡、刻度離心管(10m1、注射器(1m1、載玻片、燒杯(400m1、100m1 、試管架、鑷子、剪刀、解剖刀、吸管、擦鏡

3、紙。（三）試劑1. 2檸檬酸鈉溶液：稱取28g 檸檬酸鈉(檸檬酸三鈉，Trisodium citrate，AR 溶解于蒸餾水中。2. 1檸檬酸鈉溶液。安徽大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)精品課程3. 200g ml 秋水仙素(cochicine4. 姬姆薩 (Giemsa原液(P H6.8Giemsa染料(Giemsa stain 1g甘油(glycerine，AR 33ml甲醇(methyl alcohol，AR 45ml將染粉傾入乳缽，加幾滴甘油，在乳缽內(nèi)研磨直到無顆粒為止，此時(shí)再將全部剩余甘油使6065保溫箱中保溫2h 后，加入甲醇攪拌均勻，保存于棕色瓶中備用。5. 0.067mol/L磷酸鹽緩沖液(pH

4、 6.8Na 2HPO 4. 12H2O 11.81g(或Na 2HPO 4. 2H2O 5.92gKH 2P04 4.5g溶解于蒸餾水中至1000m1。6. 姬姆薩 (Giemsa應(yīng)用液(pH6.8取1ml 姬姆薩原液用9ml 0.067mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.8稀釋即可。當(dāng)天臨時(shí)配制，一天后失效。7. 甲酸(AR8. 冰醋酸(Acetic acid glacial,AR90.4KCl(potassiumchloride，AR 溶液四、實(shí)驗(yàn)操作1. 秋水仙素處理 動(dòng)物按4g g 體重的劑量經(jīng)腹腔注射秋水仙素，34h 后殺死動(dòng)物。2. 取骨髓 取出動(dòng)物后肢的脛骨和股骨，剪去兩端骨骺。

5、將0.61ml 2檸檬酸鈉用1ml 注射器接上5#針頭注入骨髓腔，將骨髓細(xì)胞先沖入小培養(yǎng)皿中，取下注射器針頭，反復(fù)吸打骨髓細(xì)胞，使細(xì)胞團(tuán)塊分散，轉(zhuǎn)入10ml 離心管。3. 低滲處理 視骨髓量之多少，加入0.4%KCl溶液810ml ，隨即將離心管置37水浴中低滲10min 。4. 固定 1000rmin 離心8min 。棄上清液，沿離心管壁緩慢加入新配制的甲安徽大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)精品課程醇：冰醋酸(3：1 固定液5ml ，加固定液時(shí)，注意不要沖動(dòng)細(xì)胞團(tuán)塊。加完固定液后，立即用吸管將細(xì)胞輕輕吸打均勻，靜置固定20 min。如此反復(fù)固定23次，每次20min 。5. 滴片 固定的細(xì)胞經(jīng)離心后，吸去上層

6、固定液，視管底的細(xì)胞多寡加入少量新配制的固定液，將細(xì)胞團(tuán)塊輕輕吸打成懸液。在干凈、冰冷的載玻片上滴23滴上層細(xì)胞懸液，在酒精燈上文火烘干，在空氣干燥30min 。6. 染色 將玻片標(biāo)本平放于支架上，細(xì)胞面朝上，每片滴加1：10 Giemsa應(yīng)用液0.21m1，染色10min 。7. 沖洗 在自來水管下細(xì)流水沖洗15s ，洗去Giemsa 應(yīng)用液，用濾紙吸干玻片標(biāo)本，置于顯微鏡觀察。五、結(jié)果1. 在顯微鏡下可觀察到染色體被Giemsa 應(yīng)用液染為紫紅色或桃紅色。小鼠染色體數(shù)目2n=40。2. 在低倍鏡下可見較多的圓形的間期細(xì)胞核。尋找染色體分散良好的中期分裂相，移至視野中央，然后用油鏡觀察。在油

7、鏡下，可見40條清晰的染色體，每條染色體中，還可以見到著絲粒、染色體長臂和短臂等特征。六、注意事項(xiàng)1. 秋水仙素的注射劑量與時(shí)間對觀察中期染色體的形態(tài)影響很大。通常情況下，小鼠按4g g 體重的劑量經(jīng)腹腔注射秋水仙素，34h 后處死小鼠，此時(shí)觀察中期染色體特征明顯。注射時(shí)間過短或過長，在鏡下可見間期細(xì)胞多，而中期染色體形態(tài)少。如果在顯微鏡下能觀察到50%80%中期染色體，說明試驗(yàn)操作相當(dāng)成功。2. 由于小鼠的股骨較細(xì)，因此應(yīng)細(xì)心地剝?nèi)テつw，然后用手術(shù)剪剪去兩端骨骺，用裝有2檸檬酸鈉溶液的注射器針小心插入骨髓腔將溶液注射完畢，并反復(fù)從兩端沖洗將骨髓沖出來，吹洗直至骨腔變白。此外要防止注射針頭阻塞。3. 低滲處理是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵，其目的是使細(xì)胞體積脹大，染色體松散。低滲處理時(shí)間過長，會(huì)造成細(xì)胞破裂，染色體丟失。低滲處理時(shí)間不足，細(xì)胞內(nèi)染色安徽大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)精品課程體則易聚集在一起，不能很好伸展開來，觀察時(shí)無法區(qū)分和計(jì)數(shù)。4. 固定液要現(xiàn)配現(xiàn)用。用固定液固定染色體形態(tài)至關(guān)重要，固定時(shí)間要充分，應(yīng)在20 min以上。5. 載玻片要事前要酸液浸泡2448h ，自來水反復(fù)沖洗后，雙蒸水沖洗后，烘干備用。臨用前，用潔凈紙包裹置于4冰箱中。6. 對于離心過后的沉淀于管底中的沉淀物，要用吸管吸入固定液將細(xì)胞輕輕吸打均勻。尤其最后一步，如果混合