第三章 環(huán)境毒理學的基本研究方法

1、第三章 環(huán)境毒理學的基本研究方法實驗動物的選擇：物種選擇：選擇對外液化學物的毒性反應及代謝特點與人類接近的物種；選擇自然壽命不太長的物種；選擇易于飼養(yǎng)和實驗操作的物種；選擇經(jīng)濟并易于獲得的物種。品系選擇： 近交系動物 采用連續(xù)20代以上兄妹交配或親子交配而培育的純品系動物。如津白、津白、615， BALBC， C3H、C57B6J小鼠等。突變系動物 動物在生長繁殖過程中，通過自然突變或人工定向突變的辦法，使其某基因發(fā)生突變，并喪失了原有的正常功能。這種突變的基因可以世代相傳并保持遺傳基因特性的品系動物。 雜交群動物 兩個不同近交系之間有目的進行交配，所產(chǎn)生的第一代動物， 亦稱雜交一代動物。封閉

2、群動物 一個動物種群，在5年以上不從外部引進新血緣，僅由同一品系的動物在固定場所保存繁殖的動物群如昆明種小鼠、NIH小鼠、LACA小鼠、Wistar大鼠SD大鼠、青紫藍兔、新西蘭兔等。微生物控制的選擇：無菌動物 體內(nèi)外均無任何微生物和寄生蟲的動物無特定病原體動物（SPF）體內(nèi)無特定的微生物和寄生蟲存在的動物。實際上是無傳染病的動物，容許攜帶非特定微生物。飼養(yǎng)于封閉的系統(tǒng)中。清潔動物 有程最低限度疾病動物，動物體內(nèi)外不攜帶人畜共患的病原體或動物傳染病病原體，與SPF動物不同的是，抗體檢查常有腦脊髓炎病毒、鼠肝炎病毒等抗體滴度，但不應有臨床癥狀、病理改變及自然死亡。飼養(yǎng)在半屏蔽系統(tǒng)第一節(jié) 急性毒性

3、試驗一、急性毒性試驗的目的：概念：研究化學物大劑量一次染毒或24小時內(nèi)多次染毒動物后所引起的毒作用試驗。主要根據(jù)人體可能的暴露途徑，選擇經(jīng)口、經(jīng)皮、經(jīng)呼吸道的染毒途徑進行急性毒性試驗，獲得 LD50或LC50。農(nóng)藥等有可能與皮膚或眼接觸的化學物需進行皮膚刺激試驗、眼刺激試驗和皮膚變態(tài)反應試驗。對呼吸道有刺激作用的化學物還應進行吸入刺激閾濃度試驗。通過急性毒性試驗，可對化學物的毒性作出初步的估計并確定其急性毒作用特征，為急性毒性定級、進一步試驗的劑量設計和毒性判定指標的選擇提供依據(jù)。目的：在短期內(nèi)了解該物質(zhì)的毒性大小和特點，并為進一步開展其他毒性試驗提供設計依據(jù)。1、確定供試化學物急性毒性的劑量

4、反應關系和中毒特征；2、求LD50或LE50,為急性毒性評價提供依據(jù)。3、研究毒物的毒動學和毒效學過程。用來表示急性毒性大小的是LD50:對受試物的個體感受性影響較小，有更高的重現(xiàn)性；從劑量反應曲線上看它處于曲線的中段，是死亡率對劑量敏感的部位，有60一70死亡動物集中在LD50附近。見p505表22-5，22-6二、試驗程序與評價 1動物選擇 首先選擇受試物在體內(nèi)代謝情況與人體內(nèi)相近的或?qū)κ茉囄镒蠲舾械钠废怠?嚙齒類：大鼠、小鼠； 兔、豬、狗。應對兩種性別、成年和幼年動物進行測定。2染毒途徑與方式： 一般應與人的接觸途徑相同。常用的有以下幾種： (1)經(jīng)口染毒 常用灌胃法，也可將受試物放在飲

5、水中由動物自由攝取。將化學物與飼料混和具有劑量不準確的缺點，而且常會影響吸收，降低化學物的毒性。 為了便于染毒常需用溶劑來溶解受試物或?qū)⑵渑涑苫鞈乙?，溶劑本身應無毒，且不與受試物起反應。溜胃容積一般大鼠不超過3m1，小鼠不超過o5m1，當染毒劑量過大時，可分幾次給藥。 (2)經(jīng)呼吸道染毒 將實驗動物放在有毒氣或粉塵的染毒柜內(nèi)進行染毒。急性吸入染毒采用靜式染毒瓶(2025L)或染毒拒(2550L)，加入定量受試物形成所需濃度的空氣環(huán)境，讓動物自由吸入，染毒24h。 (3)經(jīng)皮膚染毒 本法主要用于化學物如化妝品農(nóng)藥經(jīng)皮(或粘膜)吸收所引起的急性毒性。常用動物是成年家免或脈鼠，有時也用大鼠和小鼠。在

6、正式給藥前24h，給動物背部脫毛，注意勿傷皮膚。將受試物均勻涂布于皮膚表面，用紗布覆蓋，共敷24h。 3試驗程序： （1）劑量與分組 首先應根據(jù)受試物的結(jié)構對比文獻中類似化學物的致死量作初步估計，然后進行預試以找出粗略的LD50或LD0。正式試驗可在LD100與LD0之間設57個劑量組。 （2）癥狀觀察 時間：24h或兩周內(nèi)的反應。觀察內(nèi)容：表現(xiàn)癥狀和解剖觀察p504表22-4三、 LD50的計算與結(jié)果評價計算LD50及其標準誤的方法：.通常采用概率單位法和寇氏法。見p506。根據(jù)所得結(jié)果，按前述急性毒性分級標準，評定其毒性大小。LD50值愈小，毒性愈大。各種化學物之間的毒性有明顯的差異。概率

7、單位法用正態(tài)曲線下的面積來表示死亡率的大小，其均數(shù)左右邊的面積各為50%。將正態(tài)曲線橫軸上的單位，用標準正態(tài)差為單位來計算：d=(x-)/為消去負號，將其值一律加5，稱為概率單位。死亡率為50%時，概率單位為5，以此類推。從表17-1百分率-概率單位換算表，可以任一死亡率換算為相應的概率單位。經(jīng)此換算，劑量對數(shù)與概率單位(即表示死亡率)，已不是S狀曲線(A)而成為直線關系(B)。LC50計算步驟如下：a根據(jù)各組死亡率從表17-1百分率-概率單位換算表中查到各組的概率單位，如第一組 死亡率為80，查得概率單位為5.84，余此類推。死亡率為100或0者，不列入計算。b 用方格紙繪相關線，橫軸表示濃

8、度對數(shù)（x），縱軸表示概率單位（y），各級數(shù)值點在圖上（圖 177）。C順著各點的分布趨勢，用直尺繪出一條最適合于各點的直線，此線應盡量靠近概率單位為5及附近的點子。畫線前可用透明尺或用一根黑線進行測試，為直線通過各點中間。d求概率單位與處的濃度對數(shù)（m），其反對數(shù)即為LC50e.劑量-反應關系的回歸方程的計算：可選兩個相距較遠的概率單位點y和y2,求回歸系數(shù)b。代入回歸方程式中：b為直線斜率x為的劑量對數(shù)為概率單位5的劑量對數(shù) f.求LC50的可信限先求LC50的標準誤差(Sm)：=4平均致死量法（又名寇氏法） 此法計算LD50較為簡便，但試驗時要符合下列要求：每個試驗組動物數(shù)要相同；各組劑

9、量要按等比級數(shù)分組；最大劑量的死亡率最好為100或與之接近，最小劑量的死亡率最好為0或與之接近。計算公式如下：式中，Xm為最大劑量的對數(shù)值；i為相鄰劑量比值的對數(shù)；為各組死亡率的總和（以小數(shù)表示）。例小鼠腹腔注射致百蟲急性毒性試驗結(jié)果如表 174所示，求 LD50式中，p為一個組死亡率；q為一個組存活率；i為相鄰劑量比值的對數(shù)；h為各組動物數(shù)。第二節(jié) 亞慢性和慢性毒性試驗 了解長期反復接觸低劑量化學物質(zhì)可能引起的毒性效應。 需進行蓄積試驗和亞慢性、慢性毒性試驗。一、蓄積試驗及其方法： 環(huán)境化學物的蓄積作用是慢性中毒的基礎。（一）蓄積作用：某些物質(zhì)以較小劑量反復作用于機體，可使機體對該物質(zhì)的反應

10、性增強，即一次染毒不引起明顯中毒反應或死亡的劑量，經(jīng)分次重復染毒后，可引起明顯中毒或死亡，此種現(xiàn)象稱為蓄積作用(accumulation)?？煞謨煞N：物質(zhì)蓄積，即毒物在體內(nèi)的排出量小于進入量，以致毒物在體內(nèi)的貯留量增多為物質(zhì)蓄積；功能蓄積：是毒物進入機體后，并末發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)明顯貯留，但可引起機體功能改變的逐漸累積，導致對該毒物的反應性增強，此種現(xiàn)象稱為功能蓄積。但兩者的劃分是相對的，既有差別，又互有聯(lián)系。功能蓄積可能是由于貯存于體內(nèi)的化合物或代謝產(chǎn)物的數(shù)量極微，目前分析方法尚不能檢出的一種物質(zhì)蓄積，或是由于每次機體接觸化合物之后所引起的損害累積所致。耐受性(tolerance)是機體多次接觸化學

11、物質(zhì)后對該物質(zhì)產(chǎn)生反應性減弱的現(xiàn)象，顯示不易發(fā)生慢性中毒。（二）蓄積作用的測定方法 有多種，常用蓄積系數(shù)法。蓄積系數(shù)是指多次染毒使半數(shù)動物出現(xiàn)某種效應的總劑量(ED50(n)與一次染毒引起同一效應的劑量，即半數(shù)效量(ED50(1)的比值。若以死亡為毒效應指標，上式為蓄積系數(shù)的測定：1固定劑量法 由Kagan和s帕nkevic(I 954)提出，該法固定每天染毒劑量為1201/5 LD50，連續(xù)染毒，直至實驗動物半數(shù)死亡。如果染毒劑量累計已達5個LD50 動物死亡仍末達半數(shù)，實驗均可告結(jié)束，計算蓄積系數(shù)，作出評價。2遞增劑量法 由Lim等(1961)提出，先測定LD50（1），然后對另一組動物每

12、天染毒，以4天為一期，開始給予0.1LD50。以后每期按1.5倍遞增劑量，直至動物半數(shù)死亡，或?qū)嶒炓堰_24天，可結(jié)束實驗，計算系數(shù)。3. 二十天試驗法 本法是我國食品安全性毒理學評價程序(1984)針對上述兩法的利弊而提出的。選用大鼠或小鼠每個劑量組雌雄各10只，以12、l5、110、120 LD50。分別對每組進行染毒，每日1次，共20天。如l20LD50組動物有死亡，且有劑量反應關系，則有較強蓄積作用；如120 LD50組無死亡，則為弱蓄積。二、亞慢性毒性作用及其試驗方法：1、目的：確定化學物亞慢性毒性的閾劑量 和NOEL(最大無作用劑量或未觀察到作用劑量)。2、試驗期限：無完全統(tǒng)一認識，

13、一般認為3-6月；現(xiàn)有學者主張喂飼：90天，因有報道認為3個月毒性效應與更長時間基本相同。 呼吸道吸收：30或90天，每天6小時，每周5天。 皮膚毒性：30天。3、試驗動物的選擇、飼養(yǎng)環(huán)境及染毒途徑： 選擇：急性毒性實驗證明對受試化學物敏感的物種或品系； 環(huán)境：營養(yǎng)合理，飲水清潔、充足、溫、光、濕適宜； 染毒途徑：盡量模擬人類在環(huán)境中接觸受試化學物的途徑，與急性毒性試驗相似。4、劑量選擇與分組 劑量：120I5LD50，對于在體內(nèi)不產(chǎn)生蓄積作用而排泄又快的物質(zhì)可適當加大劑量，反之則可減少劑量。 設34個實驗組和1個對照組。實驗組要求：要求在實驗結(jié)束時，最低劑量組的動物不會產(chǎn)生可觀察到的毒性反應

14、，相當于亞慢性的最大無作用劑量；最高劑量組要求能引起動物明顯的毒性反應，但又不引起動物死亡；中間劑量組應產(chǎn)生輕微的毒性反應，相當于亞慢性的閾劑量。另設一對照組。劑量選擇可參照急性毒性和蓄積毒性的資料。如：以急性非致死性試驗的閾劑量作為亞慢性試驗的最高劑量。5、癥狀觀察(1)一般性指標：如動物體重增長率、食物消耗率、活動能力等。為整體反應指標。體重明顯下降常常是中毒或疾病的信號，也是一項比較敏感的指標。(2) 化驗指標： 特異指標：用以測定化學物作用于機體后所引起的特異性反應。因此，它能更確切地闡明該物質(zhì)對動物產(chǎn)生有害影響的聞劑量(濃度)及無作用劑量(濃度)。例如： 有機磷農(nóng)藥：測定血中膽堿酯酶

15、活性； 芳香族硝基化學物：可測定高鐵血紅蛋白；無機F：可檢查斑釉發(fā)生率及牙齒和骨氟含量。功能指標：血、肝、腎功能指標：一些酶的測定來實現(xiàn)的，目前常用的有谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(吻)、堿性磷酸酶(AKP)、乳酸脫氫酶(LDH)及其同功酶、r谷氨酰轉(zhuǎn)耽酶(rGTP)等活性測定。有害物質(zhì)在體內(nèi)的分布、代謝及排泄指標：生物材料(血、尿、毛發(fā)等)中有害物質(zhì)(汞、鎘、鉛、砷、氟等)含量測定。三、慢性毒性作用及其試驗方法：慢性毒性試驗是檢測在較長時間內(nèi)，以小劑量反復染毒后所引起損害作用的試驗。1、目的：評價化學物在長期小劑量作用的條件下對機體產(chǎn)生的損害及其特點確定其慢性毒作用閾劑量和最大無作用劑量

16、。2、試驗方法：（1） 動物選擇、染毒方法、觀察指標等與亞慢性毒性試驗相似；（2）染毒期限：1-2年或終身染毒，也有人提出6月。（3）劑量分組： 3個染毒組和一個對照組。 高劑量組：1/51/2亞慢性試驗閾值； 中間劑量：1/501/10； 低劑量組：1/100。第四節(jié) 致突變實驗一般包括原核細胞基因突變實驗，如Ames試驗或大腸桿菌試驗或枯草桿菌試驗；真核細胞染色體畸變實驗，如微核試驗或骨髓細胞染色體畸變分析；如實驗結(jié)果為陽性，可在DNA修復合成試驗、顯性致死試驗、果蠅伴性隱性致死試驗和體外細胞轉(zhuǎn)化等試驗中再選兩項進行最后的綜合評價。通過致突變試驗，可對受試物的潛在遺傳危害性作出評價并預測其

17、致癌性。一、目的 確定外源化學物對生物體是否具有致突變作用。 基因點突變試驗、染色體畸變試驗、DNA損傷試驗。二、供試生物： 微生物、動物細胞、昆蟲、動物或植物三、試驗方法 體外基因突變試驗、細胞遺傳學試驗、體內(nèi)基因突變試驗、DNA損傷試驗（一）體外基因突變試驗1、Ames試驗（鼠傷寒沙門氏菌/動物肝細胞微粒體試驗）（1）方法原理：利用一種突變微生物菌株與被檢測化學物接觸，使突變型微生物回復突變，重新成為野生型微生物。突變型微生物不具備合成組氨酸的能力，不能在不含（或低濃度）組氨酸培養(yǎng)基上生長。（2）方法： 將突變型沙氏菌在不含（或低濃度）組氨酸培養(yǎng)基上培養(yǎng),以其生長狀況作為指標。 在培養(yǎng)基中

18、加入哺乳動物的肝細胞微粒體：提高靈敏度。（3）特點： 優(yōu)點： 簡便、靈敏、快速（48h）、費用低； 檢測結(jié)果與對動物的致癌性的相符率達約90%。 缺點： 利用微生物作為供試物，不能全面反映哺乳動物的遺傳信息，僅1/6； 微生物的DNA修復系統(tǒng)與動物有差異； 微生物無免疫功能。 2、哺乳動物體細胞突變試驗（1）方法原理與微生物突變類似。常用的細胞株：中國地鼠肺細胞V79、中國地鼠肺卵巢細胞(CHO)、小鼠淋巴瘤L5178Y細胞株。V79、CHO細胞株：缺乏利用嘌呤堿的一種酶次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶（HGPRT）。在培養(yǎng)基中加入某些類似嘌呤堿類物質(zhì)：6-巰基嘌呤、6-硫代嘌呤、8-N雜鳥嘌呤，這些物質(zhì)對正常細胞有毒性，不能在該培養(yǎng)基上生長；而突變細胞株可利用類似嘌