大腸癌PARP與微血管形成的關(guān)系

1、大腸癌PARP與微血管形成的關(guān)系         08-10-10 14:55:00     編輯：studa20            作者：李佳，黎明，郝蘭香，王婭蘭   【摘要】  目的： 探討大腸癌PARP與微血管形成的關(guān)系及其可能機制. 方法： 應(yīng)用SP免疫組化染色觀察30例大腸癌中PAR的表達和微血管密度的變化，流式細胞計數(shù)和

2、明膠酶譜觀察5AIQ抑制CT26細胞后MMP9陽性細胞數(shù)和活性的變化. 結(jié)果： 在PAR強表達的大腸癌中，微血管密度高，弱表達則密度低，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.0001, P<0.01)；流式細胞計數(shù)中，與未處理組相比，用500 mol/L 5AIQ處理后，MMP9陽性細胞的百分比降低；明膠酶譜顯示，MMP9的活性在500 mol/L 5AIQ處理組和未處理組中差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.0013, P<0.01). 結(jié)論： 大腸癌PARP的表達可能和微血管形成相關(guān)，PARP活性增強可能促進了腫瘤血管的形成. 【關(guān)鍵詞】  聚（腺苷二磷酸核糖）聚合酶；微血管密度；明膠

3、酶B；結(jié)直腸腫瘤     0引言    聚（腺苷二磷酸核糖）聚合酶Poly(ADPribose) polymerase, PARP, 參與聚ADP糖基化過程，對核內(nèi)眾多的蛋白質(zhì)和酶類進行翻譯后修飾，從而調(diào)節(jié)細胞內(nèi)一系列的分子事件. 聚（腺苷二磷酸核糖）Poly(ADPribose), PAR是PARP的活化形式，對其抑制，可反映PARP的活性.  有文獻1-2報道，在炎癥反應(yīng)、以及白血病、前列腺癌等多種惡性腫瘤中PARP的表達增強. 而我們先前的研究結(jié)果也提示：大腸癌PAR表達較正常組織明顯增強，PARP與大腸癌轉(zhuǎn)

4、移具有相關(guān)性3. 亦有研究表明，通過抑制PARP能抑制人臍靜脈血管內(nèi)皮增殖2. 但PARP與腫瘤血管形成的關(guān)系，尚未見文獻報道.  在炎癥反應(yīng)中，5氨基異喹啉酮5Aminoisoquinolinone, 5AIQ）可通過抑制PARP活性，抑制細胞間黏附分子1（intercellular adhesion molecule1, ICAM1）和P選擇素(Pselectin)等黏附分子表達. 我們的前期研究也表明5AIQ可抑制大腸癌HT29細胞PARP活性3. 本研究觀察了PAR（PARP的活化形式，其表達強弱可反映PARP活性的高低）與大腸癌微血管密度（MVD）的關(guān)系、大腸癌CT26細胞

5、處理前后基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase9, MMP9）表達和活性的變化，初步探討了PARP與腫瘤血管生成的關(guān)系及其可能的機制.    1材料和方法    1.1材料大腸癌標本（n=30）均取自重慶醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)教研室，病理學(xué)分級參照WTO大腸癌分級標準. 所有標本經(jīng)40 g/L甲醛固定，石蠟包埋，5  m連續(xù)切片. 小鼠大腸癌CT26細胞由四川大學(xué)魏于全教授惠贈. 5AIQ由英國Bath大學(xué)Threadgill教授惠贈. 抗PAR抗體購自博士德生物工程有限公司,抗CD31抗體購自Gene

6、Tech公司，抗MMP9抗體購自Santa Cruz公司，SP免疫組化試劑盒、山羊抗兔IgGFITC均購自北京中杉生物技術(shù)公司，核及胞質(zhì)蛋白裂解液（NEPERTM Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents）購自Pierce公司，明膠購自Sigma公司.    1.2方法)，6分為強陽性(). 以PBS代替一抗為陰性對照，已知陽性心肌切片為陽性對照. CD31染色結(jié)果判斷： 細胞呈黃色或棕黃色為陽性（+）；無著色為陰性（-）. 以PBS代替一抗為陰性對照，自身大血管內(nèi)皮細胞為陽性對照.AIQ，對照組加入不含5AIQ的等體

7、積生理鹽水. 培養(yǎng)20 h后分別收集對照組和5AIQ處理組細胞,按試劑說明書進行MMP9染色標記，流式細胞儀計數(shù)10000個細胞中MMP9抗體標記陽性的細胞. 重復(fù)實驗5次.    統(tǒng)計學(xué)處理： 采用SAS 8.0統(tǒng)計軟件進行spearman秩相關(guān)分析和t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義.    2結(jié)果    2.1大腸癌PAR的表達與MVD的關(guān)系PAR陽性著色主要位于腫瘤細胞胞核，多靠近核膜，部分間質(zhì)內(nèi)皮細胞、炎癥細胞弱陽性. 30例大腸癌組織中，陽性表達23例（圖1）. 用CD31標記大腸癌

8、血管，可見腫瘤間質(zhì)內(nèi)微血管的大小、形態(tài)均存在差異，部分呈單個內(nèi)皮細胞或內(nèi)皮細胞團，部分管腔不規(guī)則或無明顯管腔（圖2）. MVD在不同程度表達PAR的大腸癌中存在差異. 在PAR強表達的大腸癌中，微血管密度高(28.86±13.49)；弱表達則密度低(7.52±4.75). 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，P=0.0001.2.2流式細胞計數(shù)對照組中，MMP9陽性細胞的百分比為86.75%；用濃度為500 mol/L的5AIQ處理后，陽性細胞的百分比為69.33%. 5AIQ處理組陽性細胞百分比較對照組降低（圖3）.    2.3明膠酶譜CT26細胞加入50

9、0 mol/L的5AIQ孵育后，其MMP9的活性明顯弱于未加藥的CT26（0.4001±0.0518） vs （0.6148±0.0847），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，P=0.0013.     08-10-10 14:55:00     編輯：studa20    3討論    PARP廣泛存在于真核細胞核內(nèi)，能通過PAR化，參與細胞內(nèi)一系列的分子生物事件. PAR作為PARP的產(chǎn)物，其合成的多少能反應(yīng)PARP活性的強弱，通過檢測PAR的表

10、達可了解PARP的活性狀態(tài). PARP與多種疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān). PARP與腫瘤的關(guān)系也逐漸被重視，文獻5報道，PARP與腫瘤細胞的增殖分化有關(guān)；還有研究顯示，結(jié)腸癌組織中PARP的活性明顯高于正常腸黏膜6. 我們先前的研究結(jié)果提示，在人大腸癌組織中，PARP與大腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)，PARP活性增強有利于大腸癌侵襲轉(zhuǎn)移，且PSelectin和ICAM1的表達增高也與大腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān). 而在腫瘤的轉(zhuǎn)移過程中，血管生成是關(guān)鍵的一步. 那么PARP是否會影響腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中血管的生成呢？目前尚未見文獻報道. 5AIQ作為一種強大的PARP抑制劑，在炎癥反應(yīng)中，可通過抑制PARP活性，抑制細胞I

11、CAM1和Pselectin等黏附分子表達，進而抑制由粘附分子介導(dǎo)的白細胞與血管內(nèi)皮細胞間黏附. Rajesh等2研究發(fā)現(xiàn)，5AIQ能通過對PARP的抑制，進而抑制血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞的增殖、遷移及血管形成等. 本實驗首次對人大腸癌組織PAR表達與腫瘤MVD的關(guān)系進行了觀察，結(jié)果顯示MVD在不同程度表達PAR的大腸癌中存在差異，PAR高表達的組織中，MVD大；低表達的組織中，MVD小. 有研究表明，PARP與NFB存在協(xié)同激活作用7，且這種協(xié)同作用是通過PARP1蛋白與NFB蛋白直接的相互作用

12、而實現(xiàn)的. PARP的自動修飾可促進NFB·DNA復(fù)合物的形成，增強NFB轉(zhuǎn)錄活性8. 還有研究表明，NFB可上調(diào)ICAM1, VEGF, MMP2等的表達，從而促進大腸癌的轉(zhuǎn)移9-10. Lu等11的研究表明，在單核細胞激活的情況下，MMP9的生成與NFB途徑有關(guān). Pandey等12的研究結(jié)果指出，NFB抑制劑能抑制NFB調(diào)節(jié)的基因產(chǎn)物如MMP9的表達，而這種抑制可能是通過對IKK的抑制實現(xiàn)的. 我們先前的實驗已觀察到13，大腸癌MVD與其轉(zhuǎn)移有關(guān)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的大腸癌組織中MVD較無轉(zhuǎn)移者高. 在對腫瘤血管生成的研究中，有實驗顯示，皮膚鱗癌組織中MMP9的表達與腫瘤血管形成密切

13、相關(guān)，MMP9可能是皮膚鱗癌中重要的促血管因子之一14.      而本實驗也觀察到，用500 mol/L的5AIQ處理后，小鼠結(jié)腸腺癌CT26細胞中MMP9的表達降低. 提示，PAR高表達可能與NFB依賴性的MMP9表達增強引起的促腫瘤血管形成有關(guān). 由此我們推測，PARP與腫瘤血管生成相關(guān). 在大腸癌中，PARP活性增強，使NFB的活性增強，而受NFB調(diào)節(jié)的MMP9表達也增高，從而促進了腫瘤血管的形成.【參考文獻】  1 Tentori L, Leonetti C, Scarsella M, et al. Inhibition o

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