西蘭花酶蛋白的聯(lián)合測(cè)定法修改版

1、西蘭花酶蛋白聯(lián)合測(cè)定法1 包括：(1)可溶性蛋白(soluble protein)，(2)超氧化物歧化酶(superoxide dismutase)，SOD(3)過(guò)氧化物酶(peroxidase)，POD(4)丙二醛(malondialdehyde)，MDA(5)過(guò)氧化氫酶(catalase)，CAT2聯(lián)合測(cè)定的原因：(1) 節(jié)省人力，節(jié)省提取研磨過(guò)程(2) 節(jié)省待測(cè)樣品3聯(lián)合測(cè)定的可行性：（1）汪俏梅，郭得平（2004）對(duì)POD、SOD、CAT進(jìn)行聯(lián)合測(cè)定。取1g西蘭花樣品，按1:5(W/V)加入0.05mol/L，pH7.8的磷酸緩沖液，冰浴研磨，勻漿于4，13000g離心20min，上清

2、液為酶提取液，分別測(cè)定POD、SOD、CAT活性。（2）葉陳亮，柯玉琴，陳偉（1996），對(duì)可溶性蛋白、MDA、SOD、LOX進(jìn)行聯(lián)合測(cè)定。稱1g花蕾，用含1%聚乙烯吡咯烷酮的50mmol/L，pH7.0磷酸緩沖液4ml與冰浴中研磨勻漿，15000r/m冷凍離心10min，上清液備用。 取上清液50l，按Folin-酚法測(cè)定可溶性蛋白質(zhì)含量； 取上清液1.25ml，加水1.25ml和0.5%硫代巴比妥酸三氯醋酸溶液2.5ml混勻，煮沸10min后離心比色測(cè)定，按陳貴推薦公式計(jì)算MDA含量； 取上清液10l，按朱廣廉法測(cè)定SOD活性，以SOD抑制NBT光化學(xué)還原50%所需酶量為一個(gè)酶活性單位；

3、取上清液0.5ml，按Surrey法比色測(cè)定LOX活性，以每分鐘增加1個(gè)OD值為一個(gè)酶活單位。4聯(lián)合測(cè)定的缺點(diǎn)（1）時(shí)間比較緊張，要求合理安排順序，相互之間溶液干擾；（2）最好是同時(shí)做，人員比較多；（3）儀器，尤其是分光光度計(jì)要求要足夠，不要相互之間搶；（4）需要標(biāo)準(zhǔn)曲線的最好一起做，它要求所有待測(cè)樣盡量在同一條件下測(cè)定。其它酶也是么？解決，減少實(shí)驗(yàn)次數(shù)，集中在1-2次內(nèi)完成。做大量的預(yù)備實(shí)驗(yàn)，熟練技能。達(dá)到實(shí)驗(yàn)組每個(gè)成員倒背如流。5 方案想最后都一起測(cè)，理由是我們認(rèn)為可以保證較低溫度和酶活性不失活，并且我們保證人員充足，速度達(dá)到或接近單個(gè)指標(biāo)的測(cè)定。如果大批量同時(shí)測(cè)的話，分光光度計(jì)最多可以得

4、到3臺(tái)/4臺(tái)。復(fù)合物的提?。ㄖ饕敲福ㄒ唬┍⊙心シ? 取樣，1.0g西蘭花花蕾樣品2 放入事先預(yù)冷的研缽，先加入2ml的提取液（先預(yù)冷），加入少量石英砂，冰浴研磨至勻漿3 再加入3ml提取液繼續(xù)研磨4 轉(zhuǎn)移至10ml離心管，用2ml提取液沖洗研缽，混勻5 冰浴抽提30min，不時(shí)的輕搖6 離心，4，13000g，15min7 將上清轉(zhuǎn)移至帶刻度的試管，記錄每一試管的體積8 將酶液保存在冰浴中，嚴(yán)格保護(hù)，備用注（1）提取液總體積為7ml，即選用7倍體積的提取液（2）提取緩沖液成分：50mM磷酸緩沖液pH7.5內(nèi)含（1）PVP 1%（2）EDTA 2mM，pH8.0（3）-巰基乙醇 0.04%

5、（二）液氮研磨法1 取樣，1.0g西蘭花花蕾樣品2 放入事先預(yù)冷的研缽，加入液氮，并加入少量石英砂，研磨至粉末，用預(yù)冷的藥匙將粉末轉(zhuǎn)移至10ml離心管，加入7ml提取液，冰浴保護(hù)30min，不時(shí)搖勻3 離心，3900rpm，20min，盡量保持在低溫4 將上清液轉(zhuǎn)移至10ml量筒，記錄體積，轉(zhuǎn)移至10ml離心管，低溫保護(hù)備用第一部分 可溶性蛋白含量的測(cè)定考馬斯亮藍(lán)（G-250）法一、 原理考馬斯亮藍(lán)G-250（Coomassie brilliant blue G-250）測(cè)定蛋白質(zhì)含量屬于染料結(jié)合法的一種?？捡R斯亮藍(lán)在游離狀態(tài)下呈紅色，最大吸收在488nm，當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)榍嗌?，蛋白質(zhì)-

6、色素結(jié)合物在595nm波長(zhǎng)下有最大光吸收，其吸光值與蛋白質(zhì)含量成正比，因此可用于蛋白質(zhì)含量測(cè)定。蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍(lán)G-250結(jié)合在2min左右的時(shí)間達(dá)到平衡，完成反應(yīng)非常迅速；其結(jié)合物在室溫下1小時(shí)內(nèi)保持穩(wěn)定。該法是1976年Bradford建立，試劑配制簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便、快捷，反應(yīng)非常靈敏。靈敏度比Lowry法還高4倍，可測(cè)定微克級(jí)的蛋白質(zhì)含量，測(cè)定蛋白質(zhì)濃度范圍為01000g/ml，是一種非常常用的微量蛋白快速測(cè)定方法。二、 試劑配制1牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確稱取100mg牛血清白蛋白，溶于100ml蒸餾水中，即為1000g/ml的原液（4保存）。2 蛋白染色劑考馬斯亮藍(lán)G-250的

7、配制：稱取100mgG-250，溶于50ml90%乙醇中，加入100ml85%（w/v）的磷酸，最后定容至1000ml。此溶液在常溫下可保存1個(gè)月。注意：（1）乙醇可用無(wú)水乙醇配，無(wú)水乙醇與95%乙醇價(jià)格差0.5元左右；（2）磷酸本身濃度為85%。三、 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作（1）0100g/ml標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作取6支10ml干凈的具塞帶刻度的試管，按表一取樣。蓋塞后，將各試管中溶液縱向倒轉(zhuǎn)混合，放置2min后，用1cm光徑的比色杯在595nm波長(zhǎng)下比色，記錄各管測(cè)定的光密度OD值，并做出標(biāo)準(zhǔn)曲線。表一 0100標(biāo)準(zhǔn)曲線管號(hào)1234561000g/ml母液(ml)00.020.040.0

8、60.080.10DH2O(ml)1.000.980.960.940.920.90G-250試劑(ml)555555蛋白質(zhì)含量(g)020406080100OD250（2）01000g/ml標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作取6支10ml具塞試管，按表二取樣。其余步驟同（1）操作，做出蛋白質(zhì)濃度為01000g/ml的標(biāo)準(zhǔn)曲線。表二 01000g/ml標(biāo)準(zhǔn)曲線管號(hào)1234561000g/ml母液(ml)00.20.40.60.81.0DH2O(ml)1.000.80.60.40.20.0G-250試劑(ml)555555蛋白質(zhì)含量(g)02004006008001000OD250（3）0150g/ml標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

9、取6支10ml具塞試管，按表三取樣。其余步驟同（1）操作，做出蛋白質(zhì)濃度為0150g/ml的標(biāo)準(zhǔn)曲線。表三 0150g/ml標(biāo)準(zhǔn)曲線管號(hào)1234561000g/ml母液(ml)00.030.060.090.120.15DH2O(ml)1.000.970.940.910.880.85G-250試劑(ml)555555蛋白質(zhì)含量(g)0306090120150OD2503 樣品提取液中蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定取2支試管（10ml具塞，作為2個(gè)重復(fù)），按下表加樣：表3管號(hào)1314待測(cè)樣品(ml)0.080.08DH2O(ml)0.920.92G-25055OD595蛋白質(zhì)含量四、 計(jì)算結(jié)果樣品中蛋白質(zhì)含量（

10、g/gFW）=其中X為在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的蛋白質(zhì)含量，g；V0為提取的總體積，ml；V1為測(cè)定蛋白質(zhì)時(shí)所用的體積，ml；W為樣品鮮重，g。第二部分 超氧化物歧化酶的測(cè)定參考李合生、孫群、趙世杰、章文華編的植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)167頁(yè)一、 原理超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，簡(jiǎn)稱SOD）是需氧生物中普遍存在的一種含金屬酶，它能夠防御活性氧或其它過(guò)氧化自由基對(duì)細(xì)胞膜系統(tǒng)的傷害，因此，其活性與植物抗性密切相關(guān)。2O2-2HH2O2H2O22H2OO2依據(jù)超氧化物歧化酶抑制氮藍(lán)四唑（NBT）在光下的還原作用來(lái)確定酶活性大小。在有氧化物質(zhì)存在的條件下，核黃素可被光還原，被還原

11、的核黃素在有氧條下極易再氧化而產(chǎn)生O2，O2可將氮藍(lán)四唑還原為藍(lán)色的甲腙，后者在560nm出有最大吸收。而SOD可清除O2，從而抑制了甲腙的形成。于是光還原反應(yīng)后，反應(yīng)液藍(lán)色愈深，說(shuō)明酶活性愈低，反之酶活性愈高。根據(jù)此可算出酶活性的大小。二、試劑1130mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液：稱取1.9399gMet用磷酸緩沖液定容至100ml。2750mol/L氮藍(lán)四唑溶液：稱取0.06133gNBT用磷酸緩沖液定容至100ml，避光保存。3100mol/LEDTA-Na2溶液：稱取0.03721g EDTA-Na2，用磷酸緩沖液定容至1000ml。420mol/L核黃素溶液：稱取0.0753g

12、核黃素蒸餾水定容至1000ml，避光保存。三、實(shí)驗(yàn)步驟1 SOD的提取，使用聯(lián)合測(cè)定法提取的酶液。2 顯色反應(yīng)取5ml指形管（或試管，要求透明度好）4支，2支為測(cè)定管，2支為對(duì)照管，按下表1加入各溶液：表1 溶液顯色反應(yīng)用量試劑（酶）用量（ml）終濃度0.05mol/L磷酸緩沖液1.5130mmol/LMet溶液0.313mmol/L750mol/LNBT溶液0.375mol/L100mol/LEDTA-Na20.310mol/L20mol/L核黃素0.32.0mol/L酶液0.102支對(duì)照管以緩沖液代替酶液蒸餾水0.20總體積3.0混勻后將1支對(duì)照管放置暗處，其它各管于4000lx日光下反應(yīng)

13、15min（要求各管受光情況一致，溫度高，時(shí)間縮短，低時(shí)延長(zhǎng)）。3 SOD活性測(cè)定與計(jì)算至反應(yīng)結(jié)束后，并將各管遮光放置，以不照光的對(duì)照管為空白，分別測(cè)定其它各管的吸光度。二、 結(jié)果計(jì)算已知SOD活性單位以抑制NBT光化還原的50%為一個(gè)酶活性單位表示，按下式計(jì)算SOD活性。SOD總活性=SOD比活性=式中：SOD總活性以鮮重酶單位每克表示；比活力單位以酶單位每毫克蛋白表示；ACK為照光對(duì)照管的吸光度；AE為樣品管的吸光度；V為樣品液的體積，ml；Vt為測(cè)定時(shí)樣品用量，ml；W為鮮重，g；蛋白質(zhì)含量單位為mg/g。第三部分 過(guò)氧化物酶的測(cè)定張志良植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)，1990一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪^(guò)氧化物

14、酶是植物體內(nèi)普遍存在的、活性較高的一種酶，它與呼吸作用、光合作用及生長(zhǎng)素的氧化等都有密切的關(guān)系，在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，它的活性不斷發(fā)生變化，因此測(cè)量這種酶，可以反應(yīng)某一時(shí)期植物體內(nèi)代謝的變化。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)了解過(guò)氧化物酶的作用，掌握其測(cè)定方法愈創(chuàng)木酚法。二、原理在過(guò)氧化物酶（peroxidase）催化下，H2O2將愈創(chuàng)木酚氧化成茶褐色產(chǎn)物。此產(chǎn)物在470nm處有最大光吸收，故可通過(guò)測(cè)470nm下的吸光度變化測(cè)定過(guò)氧化物酶活性。三、試劑1 20mM KH2PO4(提取液)（我們用0.05M磷酸緩沖液）2 100mM磷酸緩沖液（原文pH6.0）3 30%H2O2（原試劑）4 愈創(chuàng)木酚（原試劑）四、實(shí)驗(yàn)

15、步驟1 POD的提取，使用聯(lián)合測(cè)定法提取的酶液。2 POD測(cè)定混合液的配制100mM磷酸緩沖液 50ml愈創(chuàng)木酚 28l（1）將上述溶液混合，磁力攪拌器攪拌，加熱溶解后，冷卻至室溫（2）加入19l 30%H2O2（3）保存在冰箱中備用3 酶活性測(cè)定（1）測(cè)定體系反應(yīng)體系溶液對(duì)照待測(cè)樣1待測(cè)樣2混合液3.0ml3.0ml3.0ml提取緩沖液1.0ml0.7ml0.7ml酶 液0.0ml0.3ml0.3ml（2）加入溶液后，秒表立即計(jì)時(shí)，分別記錄20s，60s波長(zhǎng)下的吸光值。(時(shí)間想改為20s+40s?)五、結(jié)果計(jì)算以每分鐘內(nèi)A470變化0.01為1個(gè)過(guò)氧化物酶活性單位（u）。過(guò)氧化物酶活性=式中

16、：A470為反應(yīng)時(shí)間內(nèi)吸光度的變化；W為樣品鮮重，g；t為反應(yīng)時(shí)間，min；VT為提取酶液總體積，ml；Vs為測(cè)定時(shí)取用酶液體積，ml。第四部分 丙二醛的測(cè)定參考上海植物生理研究所編的現(xiàn)代植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指南305頁(yè)一、 原理丙二醛（malondialdehyde，MDA）是常用的脂質(zhì)過(guò)氧化指標(biāo)，在酸性和高溫條件下，可以與硫代巴比妥酸（TBA）反應(yīng)生成紅棕色的三甲川（3,3,5-三甲基惡唑2,4-二酮），其最大吸收波長(zhǎng)在532nm。但是測(cè)定植物組織中MDA時(shí)受多種物質(zhì)的干擾，其中最重要的是可溶性糖，糖與TBA顯色反應(yīng)產(chǎn)物的最大吸收波長(zhǎng)在450nm處，532nm處也有吸收。植物遭受干旱、高溫、低溫

17、等逆境脅迫時(shí)可溶性糖增加，因此測(cè)定植物組織中MDA-TBA反應(yīng)物質(zhì)含量時(shí)一定要排除可溶性糖的干擾。低濃度的鐵離子能夠顯著增加TBA與蔗糖或MDA顯色反應(yīng)物在532nm、450nm處的消光度值，所以在蔗糖、MDA與TBA顯色反應(yīng)中需要有一定量的鐵離子，通常植物組織中鐵離子的含量為100300g/gDW,根據(jù)植物樣品量和提取液的體積，加入Fe3的終濃度為0.5nmol/L。三、 試劑110%的三氯乙酸（為什么用它，水可以么）20.6%的硫代巴比妥酸（用10%三氯乙酸溶解不太好溶）（配法：稱取0.6g硫代巴比妥酸，加入10ml 1mol/L的NaOH溶液，加熱溶解，再加入11ml1.0mol/L的H

18、Cl溶液，然后轉(zhuǎn)移到100ml容量瓶中，5小時(shí)內(nèi)使用）四、 實(shí)驗(yàn)步驟1MDA的提取，使用聯(lián)合測(cè)定法提取的酶液。2MDA測(cè)定體系對(duì)照待測(cè)1待測(cè)2TBA溶液（ml）2.02.02.0磷酸緩沖液0.05M(ml)2.01.01.0酶液0.01.01.0按上表加入各溶液，混勻后于沸水浴上反應(yīng)15min，迅速冷卻后再離心。取上清液測(cè)定532、600和450nm波長(zhǎng)下的消光度。3含量計(jì)算，采用雙組分光廣度計(jì)法，根據(jù)公式(1)：C1(mol/L)=6.45(D532D600)0.56D450 （1）其中C1為MDA的濃度，D450、D532、D600分別代表450nm、532nm、600nm波長(zhǎng)下的消光度值

19、。此外還可以計(jì)算出溶液中可溶性糖的濃度C2。C2（mmol/L）=11.71D450 （2）第五部分 過(guò)氧化氫酶的測(cè)定反應(yīng)條件：將底物溶液37預(yù)熱。H2O2混合液（底物）： 取0.1ml 30%市售H2O2，用50mM的磷酸緩沖液（pH7.0）進(jìn)行稀釋，定容到50ml。（市售H2O2約為17.6mol/L，稀釋后濃度約為35.2mM）。對(duì)照：0.1ml酶液+2.9ml 蒸餾水待測(cè)：0.1ml酶液+2.9ml H2O2混合液測(cè)定：加入樣品后20s穩(wěn)定時(shí)間，40秒測(cè)定時(shí)間，記錄20s和60s的240nm下的吸光值，計(jì)算40s內(nèi)吸光值的變化。每次測(cè)定一個(gè)樣品。重復(fù)2次。注意：紫外波長(zhǎng)要用石英比色杯。第六部分 過(guò)氧化氫酶的測(cè)定參考：（1）郝再彬、蒼晶、徐仲編的植物生理實(shí)驗(yàn)技術(shù)202頁(yè)（2）楊瑞紅、原老師的方法。B 施特爾馬赫，錢(qián)嘉淵譯.酶的測(cè)定方法.中國(guó)輕工業(yè)出版社，1992，186-188.過(guò)氧化氫酶普遍存在于植物的所有組織中，其活性與植物的代謝強(qiáng)度及抗寒、抗旱、抗病能力有一定關(guān)系，故常加以測(cè)定。一、 原理H2O2在240nm波長(zhǎng)下有強(qiáng)吸收，過(guò)